Article de méthode

Imagerie en 4 dimensions de la morphogenèse de la coupe optique du poisson-zèbre

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DOI :

10.3791/62155

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26 mai 2021

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1Department of Human Genetics, University of Utah

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une approche pour l’étiquetage in toto et l’imagerie multidimensionnelle du développement oculaire précoce du poisson-zèbre. Nous décrivons l’étiquetage, l’intégration et l’imagerie quadridimensionnelle (4D) à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les considérations relatives à l’optimisation de l’acquisition d’ensembles de données pour disséquer les mécanismes de morphogenèse optique en coupe.

Résumé

La fonction du système visuel nécessite l’établissement de structures tissulaires et organiques précises. Dans l’œil des vertébrés, les défauts structurels sont une cause fréquente de déficience visuelle, mais les mécanismes de la morphogenèse oculaire sont encore mal compris. L’organisation de base de l’œil embryonnaire est conservée chez les vertébrés, ainsi l’imagerie vivante des embryons de poisson zèbre est devenue une approche puissante pour observer directement le développement des yeux en temps réel dans des conditions normales et pathologiques. Les processus cellulaires dynamiques, y compris les mouvements, les morphologies, les interactions, la division et la mort, peuvent être visualisés dans l’embryon. Nous avons développé des méthodes pour le profilage uniforme des structures subcellulaires et la microscopie confocale timelapse du développement oculaire précoce chez le poisson-zèbre. Ce protocole décrit la méthode de génération d’ARNm capuchonné pour injection dans l’embryon de poisson zèbre à 1 cellule, de montage d’embryons au stade de vésicule optique (~ 12 heures après la fécondation, hpf) et d’imagerie multidimensionnelle en timelapse de la morphogenèse optique sur un microscope confocal à balayage laser, de sorte que plusieurs ensembles de données sont acquis séquentiellement au cours de la même session d’imagerie. Une telle approche produit des données qui peuvent être utilisées à diverses fins, y compris le suivi des cellules, les mesures de volume, le rendu tridimensionnel (3D) et la visualisation. Nos approches nous permettent d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l’origine du développement de la coupe optique, à la fois dans des conditions mutantes de type sauvage et génétiques. Ces méthodes peuvent être utilisées directement par d’autres groupes ou adaptées pour visualiser de nombreux aspects supplémentaires du développement des yeux du poisson-zèbre.

Introduction

Le développement oculaire des vertébrés commence par l’émergence, ou l’évagination, des vésicules optiques du neuroépithélium cérébral prospectif. Les vésicules optiques subissent ensuite une série de changements de forme tissulaire, s’allongeant puis s’invaginant pour générer la coupe optique. Dans la coupe optique, la rétine neurale et l’épithélium pigmentaire rétinien, tous deux dérivés du neuroépithélium, enveloppent le cristallin naissant, qui est dérivé de l’ectoderme de surface. L’ensemble du processus nécessite une série complexe de mouvements cellulaires et tissulaires et de signalisation moléculaire, coordonnés entre les populations de cellules neuroépithéliales, ectodermiques et mésenchymateuses. Ces événements initiaux établissent la structure de base de l’œil, et les étapes ultérieures du développement oculaire, y compris la formation de l’iris et de la cornée, sont des élaborations sur l’organisation précoce. Les perturbations du développement oculaire précoce et de la morphogenèse sous-tendent de nombreuses affections de déficience visuelle chez l’homme, notamment l’anophtalmie, la microphtalmie et le colobome. Déverrouiller les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant la morphogenèse de la coupe optique est crucial pour mieux comprendre le développement du système visuel et les conditions pathologiques qui résultent lorsque ces processus tournent mal.

Notre compréhension du développement oculaire et de la morphogenèse des vertébrés est née d’une énorme quantité de travaux couvrant les études histologiques classiques aux approches embryologiques et génétiques dans une variété d’organismes modèles, y compris la souris, le poussin,lagrenouille et le poisson1,2,3,4,5. Alors que cet ensemble de travaux a établi des mécanismes moléculaires qui régulent le développement précoce de l’œil, il existe historiquement une mauvaise compréhension de la morphogenèse de l’œil: l’émergence de sa structure 3D. La majeure partie de ces résultats proviennent de l’imagerie d’embryons sectionnés à des moments discrets. Bien que cela soit suffisant pour fournir une vue de la morphologie des tissus en 2 dimensions, la morphogenèse est un processus dynamique en 3D. Afin de déterminer comment la forme du tissu change en 3 dimensions au fil du temps, comment les cellules individuelles se comportent et comment ces comportements contribuent aux changements dans la forme des tissus 3D, différentes approches sont nécessaires.

Une solution pour combler cette lacune importante dans les connaissances est l’imagerie en direct, qui permet une observation dynamique des cellules et des tissus en temps réel à mesure que l’organe prend forme. Malheureusement, cela n’est pas facilement réalisable dans de nombreux organismes modèles en raison des contraintes du développement embryonnaire. Par exemple, les embryons de souris et de poussins (se développant in utero ou dans une coquille d’œuf) ne sont pas facilement accessibles, et de nombreux embryons vivants ne sont pas optiquement transparents, ce qui provoque une diffusion importante de la lumière et limite la profondeur à laquelle les images peuvent être acquises. Le poisson-zèbre, avec un développement externe et des embryons transparents, offre une occasion unique de réaliser une imagerie en direct de la morphogenèse oculaire6,7,8,9,10 , 11,12,13,14,15,16,17,18,19. De nombreuses lignées transgéniques et mutantes sont également disponibles, ainsi que des outils pour générer de nouveaux transgéniques et mutants20,21,22,23,24. De plus, la morphogenèse optique se produit rapidement chez le poisson-zèbre, sur une période de 12 heures (12 à 24 heures après la fécondation, HPF), ce qui rend possible l’imagerie de l’ensemble du processus.

Les efforts d’imagerie en direct ont été accélérés par l’expansion et l’optimisation de la famille des protéines fluorescentes, qui permettent le marquage vital génétiquement codé des structures subcellulaires, ainsi que par des améliorations et des innovations aux méthodes de microscopie. Le protocole décrit ici utilise la microscopie confocale à balayage laser, plutôt que d’autres approches actuelles pour l’imagerie de l’embryogenèse du poisson-zèbre, y compris la microscopie confocale à disque rotatif, la microscopie à illumination plane sélective (SPIM et ses variantes) et d’autres méthodes de microscopie plus spécialisées. Pour l’œil de poisson zèbre en développement, nous avons constaté que la microscopie confocale à disque rotatif n’était pas suffisante pour l’imagerie plus profonde dans le tissu. Bien que SPIM bénéficie d’un temps d’imagerie extrêmement rapide et soit de plus en plus largement utilisé, la gestion des grands ensembles de données pour la visualisation et l’analyse reste un défi. En revanche, la microscopie confocale à balayage laser est facilement accessible, en particulier pour les personnes manquant d’expertise dans l’assemblage de matériel optique. Nous espérons que la grande disponibilité de la microscopie confocale à balayage laser rendra notre protocole utile pour de nombreux laboratoires.

Ici, nous décrivons notre méthode pour capturer des ensembles de données 4D de morphogenèse de coupe optique, en utilisant le marquage in toto de l’embryon pour les membranes et la chromatine, et un microscope confocal à balayage laser pour l’acquisition d’images (schématisé dans la figure 1). Les protéines fluorescentes utilisées ici (EGFP-CAAX et H2A. F/Z-mCherry) ont été choisis pour fournir un étiquetage tissulaire avec une résolution cellulaire unique. Nous utilisons des ensembles de données générés avec ce protocole pour une variété de fonctions d’analyse et de visualisation d’images. Ce protocole peut être facilement adapté si d’autres structures subcellulaires sont souhaitées. Le profilage de la membrane plasmique a été sélectionné pour la visualisation de la forme cellulaire: nous utilisons EGFP-CAAX, dans lequel les 21 derniers acides aminés de H-ras, servant de séquence de signal de prénylation, sont fusionnés au C-terminus de l’EGFP13. D’autres protéines fluorescentes ciblées sur la membrane plasmique (p. ex. fusion transmembranaire ou myristylé) sont susceptibles de fonctionner tout aussi bien. Pour marquer les noyaux, nous avons sélectionné H2A. F/Z-mCherry, dans lequel mCherry est fusionné à une protéine d’histone13. Cela garantit que la division cellulaire, y compris l’orientation du fuseau mitotique, est facilement visualisée.

Avec toute approche d’imagerie en direct, il faut envisager des compromis entre l’augmentation de la vitesse d’imagerie tout en maximisant le rapport signal/bruit, la résolution axiale et la préservation des échantillons. Nous avons optimisé nos méthodes pour maximiser la qualité d’image et le nombre d’embryons pouvant être imagés en une seule fois. Souvent, l’objectif est d’imager la morphogenèse de la coupe optique dans un embryon mutant homozygote, qui peut être phénotypiquement impossible à distinguer du type sauvage au début de la morphogenèse de la coupe optique et de la progéniture d’un croisement hétérozygote (25% des embryons sont le génotype souhaité). En optimisant, puis en multiplexant l’acquisition d’images, il y a une probabilité accrue de capturer un ensemble de données d’un embryon mutant homozygote.

La résolution temporelle, ou la fréquence à laquelle les données de volume (Z-stacks) sont acquises, est un aspect clé de l’imagerie timelapse. Selon l’objectif de ces ensembles de données, il existe différentes exigences en matière de vitesse. Initialement, ce protocole a été développé pour le suivi manuel des cellules 4D. Le suivi des cellules individuelles dans un tissu uniformément marqué nécessite une résolution temporelle suffisamment élevée pour donner l’assurance qu’une cellule est suivie en permanence au fil du temps. Nous avons constaté que les piles Z de morphogenèse optique de la coupe optique du poisson-zèbre doivent être acquises au moins toutes les 3,1 minutes sur 12 h; ici, nous avons optimisé notre acquisition sur un microscope confocal à balayage laser de sorte que nous pouvons acquérir des piles Z de 4-5 embryons toutes les 2,5 minutes.

L’établissement de la taille Z-step a été une étape cruciale dans l’optimisation du protocole : pour le rendu et la visualisation 3D, les données isotropes sont idéales, dans lesquelles la taille Z-step est égale à la dimension XY en pixels. En réalité, il est extrêmement difficile d’acquérir de telles données timelapse avec des échantillons vivants, compte tenu des contraintes liées au temps d’imagerie et au photobleachage. Par conséquent, il est important de déterminer la taille adéquate du pas Z pour les besoins de rendu et de visualisation de l’expérience, et plus précisément, quel rapport voxel X: Y: Z est nécessaire pour maximiser les informations axiales tout en maintenant la vitesse et en empêchant le photobleaching. Pour ce protocole, le rapport de voxel établi était de 1:1:3,5 (0,6 μm x 0,6 μm x 2,1 μm Z-step taille en utilisant un objectif d’immersion dans l’eau à longue distance de travail de 40x). Lors de l’acquisition d’une profondeur Z de 130-140 μm, cela donne des données de volume avec une résolution temporelle appropriée et peu de photobleachage.

Comme discuté ci-dessus, ce protocole est spécifique pour l’imagerie 4D de la morphogenèse optique de la coupe optique du poisson-zèbre, en utilisant des embryons marqués toto pour la membrane plasmique et la chromatine, et un microscope confocal à balayage laser. Le protocole ci-dessous peut être facilement adapté à une variété d’expériences et de besoins. Tout d’abord, en ce qui concerne les structures subcellulaires, toute structure pour laquelle il existe un marqueur de cellules vivantes peut être imagée. Ensuite, bien que l’accent soit mis ici exclusivement sur la morphogenèse optique en coupe, l’imagerie timelapse peut être adaptée à d’autres stades du développement oculaire, par exemple, la neurogenèse25,26,27, 28,29,30,31,32,33. Pour le développement ultérieur de l’imagerie, il peut être nécessaire d’envisager l’immobilisation embryonnaire (car l’activité musculaire spontanée commence autour de 24 hpf), la pigmentation (qui commence à émerger autour de 24 hpf), la taille des tissus (l’œil grandit considérablement en volume pendant la neurogenèse) et la vitesse d’imagerie (qui doit être ajustée en fonction de la vitesse du processus d’intérêt). Toutes ces considérations peuvent être facilement gérées. Le protocole est assez flexible; en plus des détails du protocole spécifique ici, il existe des principes généraux qui aideront ceux qui s’intéressent à l’imagerie en direct d’autres aspects du développement oculaire.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici à l’aide de poissons-zèbres sont couvertes par le protocole animal du Dr Kristen Kwan, « Mécanismes cellulaires et moléculaires du développement du système visuel chez le poisson-zèbre », et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de l’Utah.

1. Synthèse d’ARN plafonnée

  1. Générer le modèle d’ADN pour la transcription in vitro.
    1. Linéariser le gabarit d’ADN en digérant 10 μg d’ADN dans un volume de 100 μL du mélange réactionnel. Une réaction typique est assemblée comme suit: digérer 10 μg d’ADN en utilisant 3 μL d’enzyme et 10 μL de tampon, porter le volume de réaction à 100 μL avec de l’eau.
      REMARQUE: Un modèle typique pour la digestion est un vecteur pCS2, par exemple, pCS2-EGFP-CAAX ou pCS2FA-H2A.F/Z-mCherry pour le marquage de la membrane et de la chromatine décrits ici. Dans ce cas, les ADN plasmidiques sont chacun digérés à l’aide de l’enzyme NotI. Les utilisateurs doivent se méfier de l’activité des étoiles; dans ce cas, une enzyme haute fidélité est recommandée et disponible dans le commerce.
    2. Incuber la réaction à 37 °C pendant la nuit pour s’assurer que l’ADN est digéré jusqu’à la fin.
    3. Nettoyez le digest de restriction à l’aide d’un kit de purification PAR PCR en suivant le protocole du fabricant. Éluez l’ADN avec 30 μL ddH2O. Stockez l’ADN linéarisé à -20 °C et utilisez-le au besoin.
      REMARQUE: La quantité d’ADN digérée et le volume d’élution donnent environ 0,3 μg / μL; ceci est suffisant pour ~5 tours de transcription in vitro, chaque tour utilisant ~2 μg d’ADN comme modèle.
  2. Transcrire in vitro l’ARN coiffé à l’aide d’un kit de transcription in vitro. Pour les modèles pCS2 (comme décrit ici), utilisez un kit SP6.
    1. Assemblez la réaction de transcription in vitro, comme suit: Digérer 2 μg de gabarit d’ADN ou jusqu’à 6 μL avec 2 μL de 10x tampon de réaction, 10 μL de 2x mélange de ribonucléotide et 2 μL de 10x mélange d’enzymes.
    2. Incuber à 37 °C pendant 2 à 4 h ou plus (des temps plus longs entraîneront un rendement plus élevé). Si vous le souhaitez, 1 μL d’Enzyme Mix peut être complété à mi-chemin de la période d’incubation.
    3. Digérer le gabarit d’ADN en ajoutant 1 μL de DNase sans RNase et en incubant pendant 15 min à 37 °C.
  3. Purifier l’ARN coiffé à l’aide d’un kit de purification de l’ARN suivant le protocole du fabricant (voir tableau des matériaux). Éluez avec 100 μL deH2Osans RNase.
    REMARQUE: L’ajout de β-mercaptoéthanol n’est pas nécessaire pour cette application. Bien que la méthode décrite dans ce protocole soit simple, d’autres réactifs peuvent également être utilisés pour purifier l’ARN.
  4. Précipiter l’ARN.
    1. Ajouter 10 μL de NaOAc sans RNase de 3 M et 2,5 volumes (~275 μL) d’ETOH glacé sans RNase à 100 % à l’ARN élué.
    2. Incuber la réaction à -20 °C pendant 15-30 min. Tourner pendant 15 min à grande vitesse à 4 °C pour granuler l’ARN.
      REMARQUE: La pastille doit être visible contre la paroi du tube. Il est utile de noter comment le tube est aligné dans la centrifugeuse à cette étape, afin de prédire où la pastille devrait être à la fin du spin.
    3. Retirez soigneusement l’EtOH avec une seringue, en prenant soin d’éviter de chauffer, de trop sécher ou de déloger la pastille. Resuspendez la pastille dans 20 μL de H2O sans RNase.
    4. Vérifiez l’ARN pour vous assurer que la synthèse est réussie. Utilisez 1 μL pour dosage de la concentration sur un spectrophotomètre et exécutez 0,5 μL sur un gel d’agarose à 1 % pour vérifier la recherche d’une ou deux bandes discrètes, plutôt que d’un frottis de faible poids moléculaire. Le rendement de la réaction de transcription in vitro doit être d’environ 1 μg/μL.
    5. Aliquote et stockage de l’ARN à -20 °C ou -80 °C. L’ARN n’est dilué qu’immédiatement avant les injections.

2. Microinjection d’embryons de poisson-zèbre à 1 cellule

REMARQUE: Injecter 200-300 pg par ARN pour obtenir une expression omniprésente de la chromatine et des membranes cellulaires tout au long de la morphogenèse de la coupe optique. Préparer 5 à 10 μL de dilution de l’ARN et charger 2,5 à 5 μL/aiguille; prévoyez un supplément au cas où l’aiguille se briserait.

  1. Préparations préalables pour les injections.
    1. Préparez une boîte de moulage par injection pour faciliter l’alignement et l’orientation des embryons à 1 cellule pour la micro-injection. Faire fondre 2% d’agarose dans E3 (milieu embryonnaire standard) et verser dans une boîte de Pétri. Faites flotter soigneusement le moule d’injection (voir Tableau des matériaux)sur le dessus de l’agarose chaude pour générer l’empreinte des creux dans l’agarose lorsqu’elle se solidifie. Une fois que l’agarose se solidifie, retirez le moule d’injection.
      REMARQUE: Les plats de moules d’injection peuvent être utilisés pendant plusieurs mois; couvrir dans E3 et conserver à 4 °C lorsqu’il n’est pas utilisé.
    2. Tirez les aiguilles de micro-injection. Tirez les capillaires en verre vers une longue conicité pour fabriquer des aiguilles de micro-injection à l’aide d’une machine à tirer des aiguilles. Programmer la machine en fonction du type de capillaires utilisés. Pour les capillaires borosilicate de 1,0 x 0,78 mm, utilisez le programme suivant: chaleur = 546 °C, traction = 130, vitesse = 70, temps = 90(Figure 2F). Rangez les aiguilles dans une boîte de Pétri et fixez-les avec de la pâte à modeler.
      REMARQUE: La recette de traction varie en fonction de la machine et du filament, et les nouveaux filaments doivent toujours être étalonnés. Chaque tour de traction produit deux aiguilles(Figure 2G); faites-le plusieurs fois pour produire suffisamment d’aiguilles en cas de ruptures accidentelles et d’expériences futures.
    3. Diluer l’ARN coiffé pour l’injection. Diluer les ARN EGFP-CAAX et H2A-mCherry à une concentration de 200-300 ng/μL en utilisant H2Osans RNase et 1 μL de rouge phénol dans un volume total de 5 μL (la concentration finale de rouge phénol est de 0,1%). Faites glisser le mélange et tournez brièvement vers le bas pour recueillir le volume total. Conservez l’ARN dilué sur la glace avant l’injection.
  2. Injection d’embryons à 1 cellule
    1. Une fois que le poisson commence à se reproduire, prévoyez environ 15 à 20 minutes pour vous assurer que les œufs sont fécondés. Pendant ce temps, rechargez l’aiguille avec 2,5-5 μL de dilution de l’ARN à l’aide d’embouts de micro-chargeur P10 et P10.
    2. À l’aide d’un picoinjecteur, calibrer l’aiguille à l’aide d’un réticule oculaire (une lame d’étalonnage micrométrique suffit également) pour mesurer le volume de la gouttelette (volume d’une sphère = (4/3) * pi * rayon ^3). Réglez le temps et la pression d’injection de manière à ce que le volume d’injection soit de 1 nL(Figure 2I).
    3. À l’éventreur à rouleaux/pipette de transfert, charger soigneusement les œufs dans le moule d’injection(Figure 2J). Si cela est utile, utilisez des forceps pour rouler les embryons de manière à ce que la cellule unique soit visible, avant ou pendant l’injection. L’utilisateur préfère utiliser un micromanipulateur.
    4. Injecter des embryons au stade 1 cellule, en ciblant la cellule et non le jaune(Figure 2M). Cela garantira un étiquetage uniforme de l’embryon en développement.
  3. Élever les embryons au stade souhaité (avant 12 hpf, selon la stadification standard34). Les embryons injectés auront un développement retardé, alors élevez-les à une température légèrement plus élevée (29,0-29,5 ° C) pour rattraper le temps. Au cours de l’après-midi, vérifiez les embryons et retirez ceux qui sont morts pour préserver la santé de la couvée.

3. Montage d’embryons de poisson-zèbre au stade de vésicule optique pour l’imagerie timelapse

  1. Avant le montage, préparez 1,6 % d’agarose à faible teneur en fusion dans l’E3. Si vous planifiez plusieurs expériences d’imagerie, préparez environ 20 mL d’agarose à faible fusion et conservez-la à température ambiante. Le jour du montage de l’embryon, faites-le fondre pour générer une aliquote fraîche (1-5 mL) dans un tube qui peut être placé dans un bloc thermique de 42 °C avant le montage.
  2. Filtrer les embryons pour une injection réussie et la luminosité globale de la fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence avant le montage. Un échantillon idéal aura une forte fluorescence EGFP et mCherry et sera au bon stade de développement(Figure 3B - B'').
    1. Dépister les embryons à l’aide d’un microscope à fluorescence. Sélectionnez des embryons qui expriment fortement à la fois la fluorescence EGFP et mCherry pour le montage.
    2. Sélectionnez des embryons de 11 hpf. Compter les somites pour bien mettre en scène les embryons34; à 11 hpf il devrait y avoir 3 somites, et à 12 hpf il y a 6 somites.
      REMARQUE: En montant des embryons avant 12 hpf (à 11 hpf), les échantillons seront correctement mis en scène à 12 hpf lorsque le timelapse commencera.
  3. Déséchorionate des embryons avant le montage. Faites-le manuellement avec une pince fine ou chimiquement en utilisant de la pronase (2 mg / mL). Avec des embryons aussi jeunes, il est essentiel que la décchorionation soit effectuée dans un plat enrobé d’agar et que les embryons n’entrent pas en contact avec l’interface air-eau.
  4. À l’aide d’une pipette à rouleaux en verre, aspirez un embryon et éjectez autant d’E3 que possible de sorte que l’embryon se trouve à l’extrémité de la pipette Pasteur en verre.
  5. Déposer l’embryon dans le tube d’agarose du bloc thermique. Laissez-le s’enfoncer dans l’agarose pendant quelques secondes, puis aspirez d’abord de l’agarose, puis l’embryon, en vous assurant que l’embryon reste à l’extrémité de la pipette (Figure 3C - C').
  6. Placez une antenne à fond de verre pour l’imagerie sous une lunette de dissection. Éjecter l’embryon et l’agarose dans une gouttelette d’agarose dans le plat à fond de verre. Utilisez des pinces pour vous orienter très rapidement, de sorte que l’embryon soit dorsal vers le bas (haut de la tête sur le fond en verre). Laisser durcir la gouttelette d’agarose (Figure 3D - D'). Cette étape doit être effectuée rapidement mais avec soin, car les embryons à ce stade sont fragiles. Les embryons endommagés ne survivront pas au processus d’imagerie timelapse.
    REMARQUE: Il est important d’orienter tous les embryons de manière cohérente pour cette expérience. Lors de l’exécution du timelapse, les embryons doivent s’adapter au champ de vision assigné tout en conservant un espace supplémentaire pour que la vésicule optique puisse se développer. Une orientation optimale consiste à aligner l’axe antérieur-postérieur de tous les embryons « verticalement » ou le long de 12 et 6 heures sur un cadran d’horloge(Figure 3G).
  7. Montez entre 10 et 12 embryons, soit plus du double de ceux qui seront imagés, afin que les meilleurs échantillons puissent être sélectionnés une fois évalués sur le confocal (Figure 3E - E'). Les échantillons seront évalués pour l’âge, l’uniformité de l’étiquetage fluorescent et la précision de l’orientation du montage.
  8. Après avoir monté les embryons, pipeter plus d’agarose pour couvrir complètement le fond du plat, enveloppant ainsi toutes les gouttelettes d’agarose séparées dans un seul grand disque d’agarose(Figure 3F - F'). Une quantité suffisante d’agarose garantira que les gouttelettes embryonnaires individuelles ou le disque entier ne se soulèvent pas du fond du plat et ne flottent pas hors de vue.
  9. Une fois durci, superposer l’agarose avec de l’E3 pour garder les échantillons hydratés pendant toute la durée de l’expérience d’imagerie timelapse (une préoccupation en fonction de l’humidité du bâtiment et de l’environnement).
    NOTE: La tricaïne n’est pas nécessaire pour ces expériences spécifiques d’imagerie timelapse, car ces embryons sont suffisamment jeunes; cependant, si vous le souhaitez, et si vous travaillez avec des embryons plus âgés, la tricaïne peut être ajoutée à l’agarose elle-même et superposée dans le milieu.
  10. Sur papier, dessinez une carte des embryons pour une référence facile lors de la mise en place d’un timelapse. Ceci est crucial pour associer ultérieurement la position au génotype de chaque échantillon.

4. Timelapse confocal à positions multiples avec un microscope confocal à balayage laser

REMARQUE: Ce protocole d’imagerie timelapse a été conçu pour être utilisé avec un microscope confocal à balayage laser équipé d’un logiciel du fabricant (voir table des matériaux). Ce système est équipé d’un dispositif piézoélectrique z-stage qui permet une acquisition rapide des piles Z. Les lignes laser utilisées dans ce protocole sont un laser à ions Argon de 488 nm et un laser DPSS de 561 nm. Le laser 561 nm est bien adapté à l’imagerie du fluorophore mCherry : il est suffisamment proche du pic d’excitation mCherry (587 nm) et bien alimenté.

  1. Configurez le confocal.
    1. Mettez le confocal sous tension et connectez-vous à l’ordinateur de bureau.
    2. Installez l’insert piézo-Z-stage (Figure 4B), puis démarrez le logiciel d’acquisition.
    3. Dans le logiciel en mode Acquisition, allumez les lasers 488 et 561 à l’aide du menu déroulant (Figure 4F). Les lasers prennent plusieurs minutes à se réchauffer, donc cette étape est effectuée tôt pour gagner du temps.
      REMARQUE: Les paramètres d’acquisition sont les suivants: Cochez les cases Z-stack, Time Serieset Position. Définissez la taille d’image sur 512 (X) x 384 (Y), la vitesse de numérisation sur 9, le mode de numérisation sur bidirectionnel, le zoom sur 0,7, le sténopé sur 60,2 (1,63 unités aérées ~= section de 1,6 μm) et l’intervalle Z sur 2,1 μm. Cela donnera une taille d’image de 303,6 μm x 227,7 μm et une taille de pixel de 0,59 μm. Les lasers 488 et 561 doivent être vérifiés et affectés à la même voie; la plage de détection EGFP est de 494-545 nm et la plage de détection mCherry est de 598-679 (Figure 4F).
    4. Recouvrir généreusement le fond de la boîte en verre d’un milieu d’immersion correspondant à l’indice de réfraction de l’eau, en prenant soin d’éviter les bulles d’air (Figure 4C). Sélectionnez l’objectif d’eau 40x et appliquez une petite goutte de milieu d’immersion sur l’objectif(Figure 4D). Fixez le plat à fond de verre dans l’insert de scène, appliquez de l’E3 pour garder les embryons humides pendant la nuit, puis utilisez de la pâte à modeler pour sceller le couvercle en plastique sur le plat (Figure 4E). Élevez l’objectif d’entrer en contact avec le plat.
  2. Filtrez les échantillons et préparez-vous au timelapse.
    1. Passez de l’onglet Acquisition à l’onglet Localiser et cliquez sur le symbole de l’ampoule pour allumer la lumière transmise. Avec la lumière transmise, localisez le premier échantillon avec le joystick: à l’œil, déplacez d’abord l’échantillon dans le faisceau de lumière, puis utilisez les oculaires au centre et concentrez-vous sur une vésicule optique.
    2. Revenez à l’onglet Acquisition. Assurez-vous que les cases Z-stack, Time Serieset Positions sont cochées et que les lasers sont réchauffés pour être utilisés.
    3. Définissez la taille d’image sur 512 (X) x 384 (Y), la vitesse de numérisation sur 9, le mode de numérisation sur bidirectionnel et réglez Zoom sur 0,7.
    4. Sous la rubrique Canaux, commencez par affecter les lasers 488 et 561 à Power 2.0 et Gain 550 (cela peut être ajusté ultérieurement). Réglez le sténopé sur 60,2 (1,63 unités aérées ~= section de 1,6 μm).
    5. Commencez l’analyse à l’aide du bouton Continu. Avec le bouton de mise au point fine, localisez l’échantillon dans l’axe Z et positionnez l’axe X-Y dans le cadre. Arrêtez l’analyse.
    6. Sous l’en-tête Positions, cliquez sur Ajouter pour enregistrer les informations XYZ sur le premier échantillon (Figure 4F). Faites-le uniquement pour que les échantillons soient chronométrés. Sélectionnez les échantillons pour leur forte fluorescence et leur montage optimal.
    7. Basculez vers l’onglet Localiser, passez à l’exemple suivant et répétez les étapes 4.2.5 à 4.2.6, en étant sélectif dans le choix des échantillons.
  3. Finalisez les positions des échantillons, attribuez la plage z, puis démarrez le timelapse. Une fois que tous les échantillons sont sélectionnés (il est possible d’imager 4 à 5 échantillons dans l’intervalle de temps total de 2,5 minutes) et que les positions sont enregistrées, parcourez chaque échantillon et ajustez la position XYZ dans le cadre de visualisation.
    1. Mettez en surbrillance la première position et cliquez sur Déplacer vers. Tout en scannant en continu, alignez la vésicule optique dans le cadre. Laissez suffisamment d’espace dans les régions antérieures et distales par rapport à la vésicule optique et au cerveau.
    2. Ensuite, affectez la première et la dernière tranche Z en sélectionnant Définir en premier et Définir en dernier tout en vous déplaçant dans la direction Z avec le bouton de mise au point fin. Maintenez un nombre total de tranches d’environ 63, car cela permettra la croissance de la tasse optique. Prévoir de l’espace supplémentaire sur la face ventrale de la vésicule optique pour permettre la croissance.
    3. Une fois que la première et la dernière tranche Z ont été définies, cliquez sur le bouton C pour vous déplacer vers le centre de la pile Z. Ajuster la puissance et le gain du laser pour les deux lasers; si possible, maintenez la puissance du laser en dessous de 5 et utilisez un gain plus élevé, si nécessaire. Arrêtez l’analyse. Mettez à jour les informations de position en cliquant sur Mettre à jour.
    4. Passez à la position suivante en cliquant sur Position 2. Répétez les étapes 4.3.1 à 4.3.3 pour chaque position attribuée. La puissance et le gain du laser doivent être réglés de manière à ce que tous les échantillons soient suffisamment éclairés.
    5. Une fois les informations de position et les paramètres laser finalisés, attribuez des paramètres de série chronologique. Sous l’en-tête Série chronologique, affectez Intervalle de temps à 2,5 min et Cycles à 300(Figure 4F). Le nombre de cycles est calculé de telle sorte que le timelapse passe au-delà de l’étape de 24 hpf, lorsque le développement de la coupe optique est terminé.
    6. Pour commencer le timelapse, cliquez sur Démarrer. Surveillez le premier cycle complet : utilisez une minuterie pour vous assurer qu’un cycle complet (imagerie de toutes les positions) est inférieur à 2,5 minutes et vérifiez que chaque position semble correcte. Le microscope fonctionne indépendamment pendant la nuit et n’a pas besoin d’être surveillé.
      REMARQUE: Bien que la température de la pièce confocale soit contrôlée, la température ambiante est de 20 à 25 ° C. Avec l’équipement en marche et le balayage laser, la température sur la scène semble être plus proche de 28,5 ° C, puisque le développement embryonnaire se déroule à ce rythme attendu, tel que dosé visuellement avec des repères morphologiques.
    7. Avec ces réglages, le timelapse durera 12,5 h. Enregistrez le fichier une fois le timelapse terminé. Il sera grand (~ 40 Go) et peut être séparé en positions individuelles après avoir été enregistré à l’aide du logiciel d’acquisition.

Résultats

L’injection d’ARN fluorescents permet le marquage subcellulaire
Des ARN qui marquent la membrane plasmique et les histones de la cellule sont injectés afin de capturer les morphologies et les mouvements cellulaires individuels qui sous-tendent la morphogenèse de la coupe optique. La figure 2 illustre chaque étape du processus de microinjection d’embryons de poisson zèbre au stade 1 cellule. En bref, les poissons-zèbres sont accouplés (Figure 2E), et les embryons sont collectés et chargés dans le moule d’injection (Figure 2J). Une aiguille de micro-injection est remblayée (Figure 2H), et les embryons sont injectés directement dans la cellule unique (Figure 2K-M), ce qui est nécessaire pour obtenir un étiquetage uniforme (Figure 2M, Figure 4I-I''',Film1). En plus d’un marquage uniforme, une fluorescence robuste est observée et le développement se déroule sans être perturbé(Figure 3B-B'').

Un montage efficace est essentiel pour l’ocm d’imagerie timelapse de 12à24 hpf
Pour imager la morphogenèse optique, qui se produit sur une longue période de temps, il est essentiel à la fois de sélectionner les embryons idéaux et de positionner correctement chaque échantillon lors de l’intégration. La figure 3 montre un compte rendu détaillé du montage réussi d’embryons de 11 hpf. Les embryons injectés sont d’abord examinés pour une fluorescence suffisante(Figure 3B',B'',F'',F''''). Les embryons individuels sont immergés dans l’agarose (Figure 3C, C') et montés dorsalement dans une goutte individuelle d’agarose (Figure 3D, D '). Tous les échantillons sont montés dans un disque collectif d’agarose (Figure 3E-F'). Lorsque les embryons sont mis en scène correctement, suffisamment fluorescents et correctement montés(Figure 3G),les échantillons resteront dans le cadre d’imagerie pendant le timelapse permettant d’imager l’ensemble de l’organe (Figure 4G-G'',I-I''',Film1). Si vous n’accomplissez pas l’une de ces étapes, vous obtiendrez un embryon monté qui n’est pas un échantillon optimal pour l’imagerie timelapse. La moindre variation du degré de rotation aura un effet dramatique sur la direction de la croissance embryonnaire pendant le timelapse. Les rotations sous-optimales sont montrées à la figure 3, y compris un embryon qui est sur-tourné (Figure 3I), ce qui entraînera un timelapse plus postérieur, et un embryon qui est sous-tourné (Figure 3J) dans lequel seul le tissu le plus antérieur peut être observé. En plus d’une rotation correcte pendant le montage, les échantillons montés par rapport à l’orientation de la trame sont plus susceptibles de produire un timelapse réussi (Figure 4G-G'',I-I''',Film1). Les échantillons optimaux sont ceux qui sont orientés verticalement sur le plat, avec l’axe antérieur-postérieur aligné avec 12 et 6 heures sur un cadran d’horloge (Figure 3G). Les échantillons sous-optimaux sont ceux qui ne sont pas orientés sur cet axe, tels que ceux qui sont horizontaux ou diagonals(Figure 3H). Ces échantillons sortiront du cadre d’imagerie au fur et à mesure que le timelapse se poursuit et ne pourront pas être utilisés pour une analyse plus approfondie (Figure 4H-H'',J-J''').

Acquisition d’un jeu de données timelapse adapté à une analyse future
Les embryons qui sont injectés, élevés et montés avec précision permettront de réussir les échantillons d’images confocales. La figure 4 montre un échantillon optimal pour le timelapse: il y a même une fluorescence et l’échantillon est de 12 hpf. La pile z pour l’imagerie est assignée de telle sorte que la première tranche est juste dorsale à la vésicule optique, tandis que la dernière tranche laisse plusieurs tranches au-delà de la limite ventrale de la vésicule optique 12 hpf(Figure 4G-G''). Ce biais vers le côté ventral fournit un espace excédentaire pour la croissance tissulaire dans la direction ventrale. Ces facteurs, lorsqu’ils sont rencontrés, entraînent un timelapse optimal (Figure 4I-I''',Film 1). Un échantillon sous-optimal a une fluorescence mosaïque ou faible, s’est déjà développé au-delà de 12 hpf (lorsque la morphogenèse en coupe optique est en cours), ou est mal positionné dans la pile Z ou le cadre XY(Figure 4H-H''). Lorsque ces critères ne sont pas remplis, le timelapse ne capte plus tout le volume 3D du tissu au fur et à mesure de son développement et ne peut pas être utilisé pour une analyse plus approfondie(Figure 4J-J''').

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Figure 1: Flux de travail de l’imagerie timelapse 4D de la morphogenèse optique de la coupe optique du poisson-zèbre. (A) Pour étiqueter par fluorescence les structures subcellulaires d’intérêt, synthétiser les ARNm coiffés appropriés. (B) Microinjecter des ARNm dans des embryons de poisson-zèbre au stade 1 cellule. (C) Les embryons sont montés dorsalement, ou tête en bas pour un microscope confocal inversé, au stade de la vésicule optique, ~ 11 h après la fécondation ou 3 stades somite. (D) Plusieurs embryons peuvent être imagés séquentiellement au cours d’une seule séance d’imagerie timelapse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2: Guide visuel pour la microinjection d’embryons de poisson-zèbre à 1 cellule. (A) Articles à inclure dans un kit d’injection (dans le sens des aiguilles d’une montre): boîte de taille moyenne pouvant contenir l’ensemble du kit avec des gants jetables en nitrile; un plat contenant des aiguilles de micro-injection; forceps; une aliquote d’huile minérale et des carrés découpés de parafilm; conseils de microchargement; ARN dilué sur la glace; moule d’injection d’agarose; marqueur; pipette à rouleaux/transfert; et pipette P10. (B) Configuration de la micro-injection: un microscope à dissection à côté d’un pico-injecteur qui est connecté à une source de gaz comprimé externe. Une pédale et un micromanipulateur sont fixés au pico-injecteur. Le micromanipulateur est équipé d’un porte-aiguille et positionné en place au-dessus de l’étage du microscope. (C) Moule d’injection d’agarose contenant six rangées de rainures avec un angle de 90 degrés d’un côté et un angle de 45 degrés de l’autre côté. (D) Le panneau avant du pico-injecteur. L’affichage de la pression indique 7,8 PSI; cela peut être ajusté avec le bouton étiqueté Pinject. En dessous, il y a des boutons-poussoirs pour déclencher manuellement la pression d’injection, pour changer le temps d’injection ou pour nettoyer, remplir ou maintenir le liquide dans l’aiguille. Le temps d’injection est réglé sur 08 (équivalent à 8 x 10 msec). Un tuyau de sortie est connecté à lasortie P et est fixé à l’aiguille d’injection. L’interrupteur de source du pressomètre est réglé sur Pinject lors du réglage de la pression d’injection, et il peut être commuté sur Pbalance pour ajuster la pression basale appliquée à l’aiguille lorsque les injections ne sont pas effectuées. Le régulateurd’équilibre P se trouve à côté du régulateurd’injection P. Le bouton d’alimentation s’allume pour indiquer que la machine est sous tension. (E) Les poissons-zèbres adultes sont accouplés dans de petits bassins d’élevage qui contiennent un réservoir imbriqué avec un fond en maille qui sépare les poissons adultes des œufs fécondés et permet une collecte facile. Le niveau d’eau est abaissé pour imiter les conditions d’eau peu profonde et les séparateurs de réservoir sont retirés pour initier le comportement d’accouplement. (F) Le panneau avant de l’arracheur de micropipette (aiguille): contient un écran qui montre les conditions spécifiques utilisées pour tirer les aiguilles. Le réglage de pression est P = 500, suivi de la date et de l’heure de la dernière modification du programme, du numéro du programme, HEAT = 546, PULL = 130, VEL = 70 et TIME = 90. (G) Un capillaire en verre est inséré dans le tiret de micropipette (aiguille) et fixé en place. Chaque course de traction programmée se traduit par deux longues aiguilles effilées (pointes de flèches rouges). (H) La dilution de l’ARN est rechargée dans une aiguille; le colorant rouge phénol permet une visualisation facile de la solution. (I) Après avoir cassé la pointe de l’aiguille, le bolus d’ARN est mesuré à l’aide d’un réticule oculaire sur la lunette de dissection. Pour ce stéréomicroscope, à un grossissement total de 30x, 6 marques de hachage sont égales à 1 volume nL. (J) Les œufs fécondés sont chargés dans le moule d’injection d’agarose et distribués le long des auges du moule à l’aide d’une pipette à rouleaux. (K) Le moule d’injection contenant des embryons d’un stade cellulaire est positionné sous le microscope et les embryons sont injectés séquentiellement. (L) L’aiguille d’injection est insérée dans chaque embryon ciblant la cellule unique. (M) Une fois dans la cellule, la pédale est utilisée pour déclencher une quantité régulée de pression et la libération de 1 nL d’ARN dans la cellule de l’embryon (visualisée par le rouge phénol). Barres d’échelle: I = 0,1 mm; L, M = 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour agrandir cette figure.

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Figure 3: Guide visuel pour le montage d’embryons pour l’imagerie. (A) Montage mis en place (de gauche à droite): un bloc thermique programmé à 42 °C, des tubes chauffants en agarose bassement fondue; une pipette à rouleaux; une paire de pinces; un plat enrobé d’agarose contenant des embryons décchorionés; et un stéréomicroscope disséquant relié à une lampe fluorescente aux halogénures métalliques. (B,B',B'') Un embryon de 11 hpf injecté avec l’ARNm EGFP-CAAX et l’ARNm mCherry-H2A, représentés respectivement sous champ lumineux, fluorescence GFP et fluorescence mCherry. (C,C') Une pipette pasteure en verre contenant de l’agarose et un embryon assis dans la pointe; C' est une vue agrandie. (D,D') Un embryon monté dans une gouttelette d’agarose bassement fondue sur un plat à fond de verre, vu à la fois de la scène du microscope et à travers les oculaires du microscope. (E,E')12 embryons montés dans des gouttelettes individuelles d’agarose faiblement fondue sur un plat à fond de verre, vus à la fois du stade du microscope et à travers les oculaires du microscope. (F,F',F'',F'',F''') Tous les embryons montés sont recouverts d’une couche complète d’agarose pour remplir le fond du plat, vu à la fois de la scène du microscope et des oculaires du microscope montrés en champ lumineux; F'' Fluorescence GFP; et F''' mCherry fluorescence. (G) Un échantillon optimal à 12 hpf est monté dorsalement et orienté verticalement en ligne avec 12 et 6 heures avec les deux vésicules optiques dans le même plan. (H) Un échantillon sous-optimal: bien que les vésicules dorsales et optiques montées soient en plan les unes avec les autres, cet échantillon est orienté sur un axe diagonal et sortira de la taille du cadre au fur et à mesure du développement. (I) Un échantillon sous-optimal: cet échantillon est sur-tourné et non une monture dorsale, de sorte que la partie antérieure de la vésicule optique ne sera pas capturée dans le timelapse. (J) Un échantillon sous-optimal: cet échantillon est sous-tourné et non une monture dorsale, de sorte que la partie postérieure de la vésicule optique ne sera pas capturée dans le timelapse. Des lignes pointillées indiquent chaque vésicule optique. Barres d’échelle: B = 0,1 mm; D'= 1,5 mm; E', F' = 2,5 mm; G = 0,1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Graphique 4: Mise en place d’un timelapse à positions multiples et de résultats potentiels. (Un) Microscope confocal à balayage laser. (B) Insert piezo Z-stage. (C) Le fond d’une cabole en verre contenant des embryons incrustés dans l’agarose est recouvert d’un milieu d’immersion correspondant à l’indice de réfraction de l’eau. (D) Une gouttelette de milieu d’immersion est placée sur l’objectif de 40 x W (longue distance de travail). (E) Le plat est maintenu en place avec l’insert de scène, E3 est ajouté sur le dessus de la couche d’agarose et le couvercle est fixé avec de la pâte à modeler. (F) Paramètres du logiciel d’acquisition : les lignes laser souhaitées sont activées dans le menu déroulant. Pour les embryons injectés avec de l’ARN EGFP-CAAX et de l’ARN H2A-mCherry, les lasers Argon et DPSS 561-10 sont activés. La surbrillance rouge indique que le laser Argon se réchauffe. Pour localiser l’échantillon au-dessus de l’objectif, la lumière transmise est activée via le panneau de commande du microscope. EGFP et mCherry sont affectés à la piste 1 (pour l’imagerie simultanée) et la portée de chaque détecteur est définie. Ici, la plage EGFP est définie sur 494-545 nm et la plage mCherry est définie sur 598-679 nm. En vertu de l' Canaux menu, la puissance laser peut être réglée. Une fois que les lasers se sont réchauffés, la puissance peut être augmentée jusqu’à 5,0 et le gain (maître) peut être ajusté. Le sténopé est réglé à 60,2, ce qui équivaut à 1,63 unité aérée ou à une section de 1,6 μm. En vertu de l' Acquisition , la taille de l’image est définie sur 512 x 384, la vitesse de numérisation est de 9,0, la moyenne est bidirectionnelle et le zoom est réglé sur 0,7. En vertu de l' Pile Z , la première et la dernière position dans l’axe Z sont définies pendant que le confocal est en cours de numérisation. L’intervalle (taille du pas) est défini sur 2,1 μm. Lors du choix de la première et de la dernière position Z, un nombre standard de 63 tranches est généralement maintenu; cela s’adapte à la croissance globale de l’œil. L’option « utiliser piézo » est sélectionnée. En vertu de l' Positions , chaque position sélectionnée est répertoriée, y compris un numéro attribué et les positions X, Y et Z. Il existe des boutons supplémentaires pour contrôler le nombre d’embryons (positions séparées) à imager, y compris ajouter, mettre à jour ou supprimer. En vertu de l' Séries chronologiques , le cycle est défini sur 300 (le nombre de piles Z qui seront acquises) et l’intervalle (pas de temps) est défini sur 2,5 min. Une fois les réglages finalisés, l’acquisition du timelapse est lancée en appuyant sur Start. Le logiciel affichera la tranche de la pile Z, le cycle et la position en cours de numérisation. Lorsque le timelapse est terminé, le fichier est enregistré en cliquant sur l’icône de la disquette dans le Images et documents panneau. (G-J) Membranes cellulaires (green) sont marqués avec EGFP-CAAX et des noyaux cellulaires (chromatine, magenta) sont étiquetés avec des ARN H2A-mCherry. (G,G',G'') Exemple de définition de la première et de la dernière tranche Z pour un échantillon monté de manière optimale. La première tranche Z (côté dorsal) se fait au détriment de l’ectoderme dorsal, tandis que la dernière tranche Z (côté ventral) est bien en dessous de la vésicule optique, pour accueillir sa croissance dans la direction ventrale. (H,H',H'') Exemple de définition de la première et de la dernière tranche Z d’un échantillon sous-optimal. L’échantillon a une faible fluorescence mCherry et il est monté en diagonale, de sorte que la coupe optique en développement est peu susceptible de rester dans le cadre pendant la durée du timelapse. (Je,Je',Je'',Je''') Exemple de timelapse à partir d’un échantillon optimal. Les images à tranche unique du milieu de la pile Z sont prises à partir de l’ensemble du volume de 63 tranches à 4 points temporels (valeur T). Br, cerveau; NR, rétine neurale; EPR, épithélium pigmenté rétinien; Le, lentille. (J,J',J'',J'''') Exemple de timelapse à partir d’un échantillon sous-optimal. Dans ce cas, l’échantillon s’est déplacé hors du plan Z et seule une partie oblique de la coupe optique antérieure a été capturée. Barres d’échelle: G, I = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Film 1: Timelapse de la morphogenèse de la coupe optique dans un embryon de type sauvage optimal. Vue dorsale d’un embryon de type sauvage marqué avec EGFP-CAAX (membranes plasmiques, vert)et H2A. F/Z-mCherry (chromatine, magenta). Le timelapse est d’environ 12-24 hpf et contient une seule section confocale d’un ensemble de données 4D entier. L’intervalle de temps est de 2,5 minutes entre les piles z et est affiché à 22,5 images par seconde. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Discussion

Nous décrivons ici un protocole pour le profilage in toto et l’imagerie timelapse 4D de la morphogenèse optique en coupe. Nous passons par le processus de génération d’ARN coiffé codant pour des protéines fluorescentes pour marquer différents compartiments subcellulaires; injection d’embryons de poisson-zèbre à 1 cellule; l’incorporation d’embryons de 11 hpf dans l’agarose pour l’imagerie multiplexée; et l’acquisition d’ensembles de données 4D de plusieurs embryons pour la durée de la morphogenèse de la coupe optique (12-24 hpf).

Une myriade de questions peuvent être répondues avec ces ensembles de données riches en informations. Les données 4D peuvent être visualisées et analysées quantitativement de différentes manières. Bien qu’en dehors de la portée de ce protocole, nous incluons ici certains de nos objectifs et applications standard comme exemple des types de choses qui peuvent être accomplies. Bien sûr, des méthodes d’analyse quantitative d’images sont constamment développées et des outils disponibles dans le commerce et sur mesure peuvent être utilisés. Si l’on n’a jamais utilisé de telles méthodes auparavant, il faut être prêt à travailler à travers une certaine optimisation pour s’assurer que les ensembles de données acquis sont adéquats pour l’approche d’analyse quantitative de choix.

La visualisation et l’évaluation quantitative des ensembles de données 4D peuvent être difficiles, en raison de la taille des fichiers. Le logiciel d’acquisition peut être utilisé pour séparer les ensembles de données en embryons individuels, et ImageJ/Fiji peut être utilisé pour convertir des fichiers confocaux de formats commerciaux en piles tif plus standard, dans lesquelles chaque point temporel est enregistré dans un fichier séparé. Cela réduira la taille des fichiers et normalisera les formats de fichiers. Des sections optiques individuelles de chaque point temporel peuvent être assemblées sous forme de timelapse 2D (XY) à l’aide d’ImageJ/Fiji, ce qui permet une visualisation et une évaluation 2D rapides des données. Le film 1 en est un exemple précis : une seule section optique au fil du temps assemblée en tant que timelapse de l’échantillon optimal illustré à la figure 4I– I'''. À partir de là, pour la visualisation 3D et 4D, nous utilisons couramment FluoRender35,36, qui est disponible gratuitement mais a des exigences spécifiques en matière de carte graphique. En utilisant FluoRender, on peut faire pivoter des données rendues en 3D dans n’importe quel axe, visualiser le jeu de données en 4D au fil du temps, générer des découpes dans n’importe quel plan et enregistrer les rotations et les visualisations sous forme de film ou de série d’images tif.

En termes d’analyse quantitative, il y a de nombreuses questions auxquelles il faut répondre. Nous avons développé un logiciel en interne pour nous aider à atteindre nos propres objectifs spécifiques de compréhension des comportements cellulaires sous-jacents à la morphogenèse de la coupe optique. Notre programme, LongTracker, utilise le signal nucléaire comme proxy pour la position pour suivre les cellules13. Avec ces données, nous pouvons déterminer quand, où et comment les cellules se déplacent; à quelle vitesse et à quelle distance les cellules se déplacent; et la fréquence à laquelle les cellules se divisent. En plus de notre propre logiciel, il existe plusieurs options disponibles dans le commerce et personnalisées pour le suivi des cellules 4D. Nous avons également développé le programme LongAxis pour effectuer la segmentation cellulaire et quantifier la forme et l’organisation des cellules au sein de la rétine neurale37. Les jeux de données entrés dans LongAxis, cependant, sont des piles Z uniques, prises à une haute résolution. Un défi persistant a été de générer des ensembles de données timelapse avec une résolution suffisamment élevée pour que les cellules puissent être segmentées en toute confiance et leur morphologie extrapolée. Une alternative est le profilage en mosaïque (clairsemée) à l’aide d’un fluorophore photoconvertible tel que Kaede pour la visualisation directe de la forme cellulaire, comme nous et d’autres l’avons effectué dans l’œil en développement8,11,13. Cela simplifie le problème de segmentation des cellules, et la forme et la taille des cellules peuvent être facilement quantifiées grâce au rendu 3D dans FluoRender.

Chaque étape de ce protocole a été optimisée spécifiquement pour nos besoins. La spécificité de ce protocole entraîne plusieurs limitations : le protocole, tel qu’il est rédigé, n’est pas optimisé pour l’imagerie d’autres aspects du développement oculaire du poisson-zèbre (comme la neurogenèse rétinienne), d’autres structures oculaires, d’autres stades de développement ou d’autres compartiments subcellulaires. L’orientation de l’intégration, la vitesse d’imagerie et les étiquettes sont toutes conçues pour nous permettre de répondre à nos questions biologiques. Afin d’imager la neurogenèse rétinienne, par exemple, l’orientation dorsale de l’embryon telle que décrite ici peut ne pas permettre la visualisation de caractéristiques spécifiques d’intérêt, et la vitesse d’imagerie peut ne pas être appropriée. De nombreux aspects du protocole peuvent être adaptés et modifiés pour une variété de besoins, en fonction de ses intérêts et objectifs spécifiques. Tout d’abord, l’utilisation d’injections d’ARN rend le processus de étiquetage très flexible. Les constructions de fusion de protéines fluorescentes peuvent être utilisées pour étiqueter les structures subcellulaires d’intérêt, et la quantité d’injection d’ARN peut être modifiée pour optimiser le marquage. Sur la base de nos travaux avec le fluorophore photoconvertible Kaede, les injections d’ARN semblent soutenir une explosion de traduction qui est supérieure de 12 hpf11,13. Des niveaux élevés d’expression de protéines fluorescentes provenant de l’injection d’ARN pourraient lutter contre le photobleaching, mais une telle approche ne soutient pas l’expression soutenue de l’étiquette fluorescente d’intérêt. Si une expression soutenue est nécessaire, par exemple lors de l’imagerie d’embryons à des stades ultérieurs, les lignées transgéniques sont une option, et la construction de nouvelles lignées chez le poisson-zèbre est simple24.

Ensuite, le protocole peut être adapté pour les étapes ultérieures du développement. Parce que le pigment peut entraver l’imagerie à des stades ultérieurs, les embryons peuvent être traités avec de la phénylthiourée (PTU) pour inhiber la formation de pigments, ou des mutants génétiques pour la synthèse des pigments peuvent être utilisés. Pour prévenir les contractions embryonnaires, la tricaïne peut être ajoutée aux solutions de superposition d’agarose et de milieu embryonnaire, et le pourcentage d’agarose peut être ajusté si nécessaire. Au fur et à mesure que l’œil grandit, il peut être nécessaire de changer l’orientation du montage; ici, nous montons des embryons dorsalement, mais à des stades ultérieurs, il peut être plus logique de monter latéralement ou antérieurement, selon la structure d’intérêt. Étant donné que différents processus se produisent sur différentes échelles spatiales et temporelles, on peut également optimiser l’étape Z et l’étape temporelle de l’acquisition d’images. Ces caractéristiques ne peuvent vraiment être déterminées empiriquement que pour les besoins de chaque laboratoire.

Enfin, ce protocole a été développé spécifiquement pour un microscope confocal à balayage laser, avec des embryons incorporés dans un pourcentage relativement élevé d’agarose à un stade précoce du développement oculaire. Si l’on image à différents moments ou à différents endroits au cours du développement oculaire, ce protocole devra être adapté au processus d’intérêt. De nombreuses approches d’imagerie différentes sont actuellement possibles, et d’autres sont développées par des ingénieurs en optique. Chaque approche apporte son propre ensemble de défis, allant de différentes façons d’intégrer et de monter des embryons pour l’imagerie, à différentes tailles et formats de fichiers. Nous décrivons les considérations dans l’introduction pour guider le processus d’optimisation, dans lequel la résolution spatiale et temporelle maximale est équilibrée avec le photobleaching, la phototoxicité et les tailles de fichiers immenses. Nous espérons que ces principes généraux, en plus des informations pratiques décrites ci-dessus, aideront d’autres personnes à établir des approches d’imagerie timelapse pour étudier les nombreuses questions ouvertes dans le développement des yeux.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants aux membres passés et présents du Kwan Lab pour leur travail sur les approches timelapse et les discussions sur ce protocole. Ce travail a été soutenu par les NIH (R01 EY025378 et R01 EY025780 à KMK; F31 EY030758 à SL; et T32 GM007464 à MAC).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Delta TPG Dish 0.17mm transparentBioptechs0420041500Cfond en verre de couverture pour compatibilité optique
Pipettes jetablesPasteur VWR14672-608longueur totale 14.6 cm (53/4")
Dumont #5, #55 ou #5SF FineScience Tools11254-20Pour le style #5 : pointe droite, pointe de 0,05 x 0,01 mm, inox, 11 cm de long
Extracteurde micropipette flamboyant/marronSutterP-97
Immersol WCarl Zeiss Microscopie4449690000000fluide d’immersion pour objectifs d’émission d’eau, sans halogène, à faible fluorescence
Moule de micro-injectionOutils de science adaptativeTU-1Six rampes, une à 90 degrés et une à 45 degrés sur un côté biseauté.
Eppendorf930001007Microloader, pointe pour le remplissage de microcapillaires en verre, 0,5 &ndash ; 20 & micro ; L
mMessage mMachine SP6 TranscriptionKit InvitrogenAM1340contient un mélange d’enzymes SP6, un tampon de réaction 10X, 2XNTP&frasl ; La solution de cap, la solution GTP, le pTRI-Xef, la TURBO DNase, la solution d’arrêt d’acétate d’ammonium, la solution de précipitation de chlorure de lithium et le tampon de chargement de gel sont tous stockés dans &ndash ; 20°C. L’eau sans nucléases peut être stockée à n’importe quelle température.
Stéréomicroscope Nikon SMZ645SMZ645utilisé pour l’injection d’embryons (voir Fig. 2B)
Enzyme NotI-HFNEBR3189Sest livré avec un colorant de chargement de gel, violet (6X)
NuSieve GTG AgaroseLonza50081résolution fine, agarose à faible point de fusion
Objectif LD « C-Apochromat » 40x/1.1 W Korr M27Carl Zeiss Microscopie421867-9970-000
Stéréomicroscope Olympus SZX16OlympusSZX2-ZB16utilisé pour le dépistage, l’enrobage d’embryons (voir Fig. 3A)
Solution de rouge de phénolSigma-AldrichP02900,5 % dans DPBS, filtré stérilement, testé aux endotoxines, testé en culture cellulaire
Micro-injecteur Pico-litreAppareil HarvardPLI-100Injections de femtolitre à microlitre ; affichages numériques du nombre d’injections, du temps et de la pression ; contient 5 pressions, y compris l’injection, l’équilibre, le nettoyage, le remplissage et la maintien.
Pipette Pompe PipetteSP Bel-ArtF37898s’adapte à une pipette pasteur jetable, contient une molette sur le côté pour l’aspiration ou la distribution et un piston pour une vidange rapide
Capillariers en verre borosilicaté à paroi mince de qualité supérieureWarner InstrumentsG100T-41,0 x 0,78 mm
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106contient QIAquick Spin Columns, Buffers, Tubes de collecte (2 ml)
Sans RNase-H2OInvitrogenAM9906Sans DNase, Biologie moléculaire, Sans RNase
Mini KitQiagen74104contient des colonnes RNeasy Mini Spin, des tubes de collecte (1,5 ml et 2 ml), des réactifs et des tampons sans RNase
Accessoire de scène Z PIEZO WSB 500Microscopie Carl Zeiss432339-9000-000
Insert de platine Z PIEZO WSBMicroscopie universelle Carl Zeiss432339-9030-000
Zeiss LSM 880 avec AiryscanMicroscopie Carl ZeissN/Ainversé Axio Observer
Black 2.3 SP1 LogicielCarl Zeiss MicroscopieN/AZeiss Efficient Navigation (ZEN) contrôle tous les systèmes de microscope optique de Zeiss
Nikon . microscope Zen

Références

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