Air-Gonflage des poumons murins avec perfusion vasculaire-Fixation

Résumé

Présenté est une méthode de gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation des poumons qui préserve l’emplacement des cellules dans les voies respiratoires, les alvéoles et l’interstitium pour les analyses structure-fonction. La pression constante des voies respiratoires est maintenue avec une chambre de gonflage de l’air tandis que le fixateur est perfusé via le ventricule droit. Les poumons sont traités pour des études histologiques.

Résumé

L’histologie pulmonaire est souvent utilisée pour étudier les contributions fournies par les cellules de l’espace aérien au cours de l’homéostasie pulmonaire et de la pathogenèse de la maladie. Cependant, les méthodes de fixation basées sur l’instillation couramment utilisées peuvent déplacer les cellules de l’espace aérien et le mucus dans les voies respiratoires terminales et peuvent modifier la morphologie des tissus. En comparaison, les techniques de perfusion-fixation vasculaire sont supérieures pour préserver l’emplacement et la morphologie des cellules dans les espaces aériens et la muqueuse. Cependant, si la pression positive des voies respiratoires n’est pas appliquée simultanément, des régions des poumons peuvent s’effondrer et les capillaires peuvent gonfler dans les espaces alvéolaires, entraînant une distorsion de l’anatomie pulmonaire. Ici, nous décrivons une méthode peu coûteuse de gonflage de l’air pendant la perfusion vasculaire-fixation afin de préserver la morphologie et l’emplacement des cellules alvéolaires et de l’interstitium dans les poumons murins pour les études histologiques en aval. Une pression d’air constante est délivrée aux poumons via la trachée à partir d’une chambre scellée remplie d’air qui maintient la pression via une colonne de liquide réglable tandis que le fixateur est perfusé à travers le ventricule droit.

Introduction

L’histologie pulmonaire représente l’étalon-or pour évaluer l’architecture pulmonaire pendant la santé et la maladie et est l’un des outils les plus couramment utilisés par les chercheurs en^{pneumologie 1}. L’un des aspects les plus critiques de cette technique est l’isolement et la préservation appropriés du tissu pulmonaire, car la variabilité de cette étape peut entraîner une mauvaise qualité des tissus et des résultats erronés^1,2,3. Chez les animaux vivants, le volume pulmonaire est déterminé par l’équilibre entre le recul élastique vers l’intérieur ....

Protocole

Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de National Jewish Health.

REMARQUE : Le protocole est organisé en trois composants. Le premier composant détaille la construction du gonflage de l’air avec un équipement de perfusion/fixation. Une deuxième section décrit comment configurer l’équipement pour une expérience. La dernière section décrit comment préparer l’animal et effectuer l’expérience.

1. Construction de l’appareil à colonne d’eau (Figure 1B)

1. Retirez le piston d’une se....

Résultats

Dans un thorax intact, les poumons sont maintenus ouverts par des forces extérieures appliquées par la paroi thoracique via l’espace pleural^6,14. Lorsque le diaphragme est entré pendant la dissection, l’intégrité de l’espace pleural est abolie et les poumons doivent s’effondrer (Figure 2A, 2B). Pour réatenser les poumons, un gonflage de l’air est effectué. Dans un premier temps, 25 cm de pression d’eau sont appliqués.......

Discussion

Bien que couramment utilisées, les méthodes de fixation intratrachéales déplacent les leucocytes des voies respiratoires et peuvent modifier l’architecture pulmonaire normale. La méthode de gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation qui est fournie dans ce protocole surmonte ces pièges et préserve plus précisément l’anatomie pulmonaire. Les clés pour obtenir des tissus de haute qualité à partir de la méthode de perfusion-fixation vasculaire comprennent une surveillance attentive des pressions de gonflage de l’a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
00117XF-Robinet d’arrêt 1 voie 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N &ndash ; Article # EW-00117-XF	Robinet
d’arrêt BD Seringue de 60 mL, embout coulissant	BD	309654	Seringue utilisée pour construire la colonne d’eau
Aiguille BD PrecisionGlide 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Aiguille pour perfusion/fixation vasculaire
Femelle Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF à Luer mâle	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Luer
femelleSel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine	Sigma-Aldrich	H3393	Solution d’héparine.
Adaptateur Luer-Stub BD Intramedic Calibre 20	BD Biosciences	427564	Adaptateur Luer-Stub
Mâle Luer (2) vers Filetage Luer Femelle Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Mâle Luer
Nalgene 180 Tube en PVC en plastique transparent	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tube
Paraformaldéhyde Solution Aqueuse - 32 %	Microscopie électronique Sciences	15714-S	Solution fixatrice. Dilué à 4 % avec une solution saline tamponnée au phosphate
Permatex Ultra Blue Fabricant de joints en silicone RTV polyvalents	Permatex	81724	Fabricant de joints en silicone pour l’étanchéité à l’air des chambres
Solution saline tamponnée au phosphate, 1x sans calcium ni magnésium	Bouteille Corning	21-040-CV	utilisée pour construire la chambre de gonflage à air et tampon utilisé pour l’héparine et les solutions fixatrices
Sterilite Ultra Seal 16,0 tasse récipient rectangulaire de conservation des aliments	Sterilite	0342	Récipient de transformation animale