Spectroscopie d’écho de spin neutronique en tant que sonde unique pour la dynamique de la membrane lipidique et les interactions membrane-protéine

La compréhension des membranes cellulaires et de leur fonction a remarquablement évolué au cours des dernières décennies. L’ancienne vision des membranes cellulaires en tant que bicouches lipidiques passives qui définissent les limites cellulaires et abritent les protéines membranaires¹ s’est progressivement transformée en un modèle dynamique dans lequel les bicouches lipidiques jouent un rôle important dans la régulation des processus biologiques vitaux, y compris la signalisation cellulaire, l’échange moléculaire et la fonction protéique – pour n’en nommer que quelques-uns^2,3,^4,5,6. Cette prise de conscience que les membranes cellulaires sont très dynamiques, en constante évolution et redistribution moléculaire, a poussé les explorations scientifiques au-delà des structures d’équilibre des membranes^7,8,9. En conséquence, de multiples approches ont été développées pour étudier les différents modes dynamiques dans les membranes lipidiques biologiques et bioinspirées. À ce jour, la majorité de ces études se sont principalement concentrées sur les mouvements moléculaires diffusifs^10,11,12,13 et les fluctuations de forme macroscopiques^14,15,16, laissant une lacune significative dans la compréhension de la dynamique membranaire intermédiaire, c’est-à-dire les fluctuations collectives des assemblages lipidiques constitués de quelques 10 à 100 molécules lipidiques. Ces dynamiques se produisent sur des échelles de longueur de quelques dizaines à quelques 100 Å et sur des échelles de temps de sous-ns à quelques centaines de ns (voir figure 1),appelées ici échelles mésoscopiques. C’est en effet à ces échelles que l’activité biologique clé a lieu au niveau de la membrane^17. Cela inclut le bourgeonnement viral¹⁸, le canal gating¹⁹et les interactions membrane-protéine²⁰. Il est également important de souligner que le paysage énergétique des protéines membranaires^21,22 montre que les changements conformationnels dans les protéines – nécessaires à leur rôle régulateur – se produisent sur les échelles de temps ns²³ des fluctuations membranaires collectives, soulignant davantage l’importance de la dynamique mésoscopique dans la fonction biologique des membranes cellulaires et de leurs analogues bioinspirés²⁰. Cet article se concentre sur les deux principaux modes dynamiques mésoscopiques dans les membranes lipidiques, à savoir les fluctuations de flexion et les fluctuations d’épaisseur.

Le principal défi pour sonder directement ces modes de fluctuation est la difficulté d’accéder simultanément à leurs échelles spatiales et temporelles à l’aide de méthodes de spectroscopie standard. L’autre défi est que les techniques de contact direct pourraient avoir un impact sur les mêmes fluctuations qu’elles sont censées mesurer¹⁶. Ceci est encore exacerbé par la complexité compositionnelle et structurelle des membranes biologiques^24,25, qui se traduit par des caractéristiques membranaires non homogènes, y compris la formation de domaine lipidique^{26,27,28,29,30} et l’asymétrie membranaire^31,32,33- exigeant des sondes sélectives pour comprendre la dynamique des différentes caractéristiques de la membrane. Heureusement, ces défis peuvent être surmontés avec des méthodes de spectroscopie neutronique non invasives, telles que l’écho de spin neutronique (NSE), qui accèdent intrinsèquement aux échelles de longueur et de temps requises, et permettent d’autres études des caractéristiques sélectives de la membrane sans modifier leur environnement physico-chimique³⁴. En effet, au cours des dernières années, la spectroscopie NSE a évolué pour devenir une sonde unique et puissante de dynamique membranaire collective^35. Les résultats des études NSE sur les membranes lipidiques ont produit de nouvelles connaissances sur les propriétés mécaniques^36,37 et viscoélastiques^38,39 des membranes lipidiques et ont jeté un nouvel éclairage sur leur rôle potentiel dans la fonction biologique^40,41.

La technique de spectroscopie NSE est basée sur une conception d’instrument interférométrique, proposée pour la première fois par Mezei^42,utilisant une série de spin-flippers et de bobines magnétiques pour contrôler la précession du spin neutronique lorsque les neutrons traversent l’instrument. La conception repose sur la mise en miroir magnétique des éléments du champ magnétique par rapport à la position de l’échantillon(Figure 1A). Cela implique qu’en l’absence d’échange d’énergie entre le neutron et l’échantillon, le neutron effectue le même nombre de précessions de spin, dans des directions opposées, dans la première et la deuxième moitié de l’instrument (remarquez le π-flipper entre les deux bobines de précession). En conséquence, l’état de spin final du neutron reste inchangé par rapport à l’état initial - un phénomène appelé écho de spin (voir neutron transparent à la figure 1A). Cependant, lorsque le neutron interagit énergétiquement avec l’échantillon, l’échange d’énergie modifie le nombre de précessions de spin dans la seconde moitié de l’instrument, conduisant à un état de spin final différent (voir Figure 1A). Ceci est détecté expérimentalement comme une perte de polarisation, comme nous le verrons plus loin dans cet article. Pour plus de détails sur la technique NSE, le lecteur est référé aux documents techniques dédiés^42,43,44,45.

Ici, une description simplifiée est présentée pour fournir une estimation approximative de la durée et des échelles de temps accessibles avec NSE. Les échelles de longueur sont déterminées par la gamme des transferts de vecteurs d’onde réalisables, Q = 4π sin θ/λ, où 2θ est l’angle de diffusion et λ est la longueur d’onde du neutron. On peut voir que Q est défini par la gamme de longueurs d’onde et l’étendue de rotation du deuxième bras du spectromètre (voir Figure 1A). Une plage Qtypique sur les spectromètres NSE est ~0,02-2 Å^-146,47, et jusqu’à 0,01-4 Å^-1 avec des mises à niveau récentes^48,49, correspondant à des échelles spatiales de ~ 1-600 Å. D’autre part, l’échelle de temps accessible est calculée à partir de l’angle total de précession (ou phase) acquis par le neutron à l’intérieur des bobines de précession magnétique, et se trouve être^{de 50}: . Dans cette expression, t est le temps de Fourier défini comme , où est le rapport gyromagnétique des neutrons, est la longueur de la bobine et est la force du champ magnétique de la bobine. Il convient de souligner que le temps de Fourier est une quantité qui dépend strictement de la géométrie de l’instrument, de l’intensité du champ magnétique et de la longueur d’onde des neutrons. Par exemple, en utilisant des neutrons de longueur d’onde = 8 Å et des réglages d’instrument de   = 1,2 m et = 0,4 T, le temps de Fourier est calculé à t ~ 50 ns. Expérimentalement, le temps de Fourier est réglé en modifiant le courant dans les bobines de précession (c’est-à-dire l’intensité du champ magnétique) ou en utilisant différentes longueurs d’onde de neutrons, ce qui donne des échelles de temps NSE typiques de ~ 1 ps à 100 ns. Cependant, les récentes mises à niveau des spectromètres NSE ont permis d’accéder à des temps de Fourier plus longs, jusqu’à ~400 ns sur le spectromètre J-NSE-Phoenix au Heinz Maier-Leibnitz Zentrum⁵¹ et le spectromètre SNS-NSE au Oak Ridge National Lab^48,et jusqu’à ~1 000 ns au spectromètre IN15 NSE à l’Institut Laue-Langevin (ILL)⁴⁹. 

Outre l’accès direct à la durée et à l’échelle de temps de la dynamique membranaire, NSE a les capacités inhérentes de la sensibilité isotopique^{neutronique 52}. Plus précisément, la capacité des neutrons à interagir différemment avec les isotopes de l’hydrogène, l’élément le plus abondant dans les systèmes biologiques, entraîne une densité de longueur de diffusion des neutrons différente,³⁴ ou NSLD (l’équivalent de l’indice optique de réfraction^50),lorsque le protium est substitué par du deutérium. Cela permet une approche connue sous le nom de variation de contraste, qui est couramment utilisée pour mettre en évidence des caractéristiques spécifiques de la membrane ou en dissimuler d’autres – ce dernier scénario est appelé correspondance de contraste. Une application fréquente de variation/correspondance de contraste est la substitution de l’eau (NSLD = -0,56 × 10^-6 Å^-2) par de l’eau lourde ou_D2O (NSLD = 6,4 × 10^-6 Å^-2) pour amplifier le signal neutronique des membranes lipidiques protiées (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). Cette approche est très efficace dans les études de la structure membranaire car la pénétration de D₂O dans la région du groupe de tête de la membrane permet de déterminer avec précision les épaisseurs de membrane (voir Figure 2A,panneau de gauche) et de l’emplacement des différents sous-groupes lipidiques lorsque des modèles plus sophistiqués sont appliqués^53,54. Cet article met en évidence quelques exemples sur l’utilisation de la variation de contraste pour les études de la dynamique collective dans les membranes biomimétiques et certaines caractéristiques membranaires.

Ici, l’efficacité de NSE à fournir des informations uniques sur les propriétés dynamiques et fonctionnelles des membranes est illustrée par des exemples tangibles d’études NSE sur des systèmes de membranes lipidiques modèles et biologiquement pertinents en mettant l’accent sur la dynamique à méso-échelle dans les membranes autoportantes, sous la forme de suspensions liposomales. Pour les mesures NSE de la dynamique des membranes dans le plan, le lecteur est référé à des publications dédiées sur la spectroscopie d’écho-spin neutronique d’incidence de pâturage (GINSES)^55,56 et d’autres études de piles de membranes multilamellaires alignées^57,58,59,60.

Pour simplifier, cet article met en évidence trois schémas différents de deutération membranaire illustrés sur un système de bicouche lipidique bien étudié formant ou séparant les phases de mélanges de 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) et de 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)^61,62. Les deux lipides sont caractérisés par un décalage dans leur longueur de chaîne hydrocarbonée (14 carbones/queue en DMPC vs 18 carbones/queue en DSPC) et leur température de transition gel-fluide (T_{m, DMPC} = 23 °C vs T_{m, DSPC} = 55 °C). Il en résulte une séparation latérale de phase dans les membranes DMPC:DSPC à des températures comprises entre les températures de transition supérieures et inférieures du mélange⁶³. Les schémas de deutération considérés ici sont choisis pour démontrer les différents modes dynamiques accessibles dans les mesures NSE sur les membranes liposomales, à savoir les fluctuations de flexion, les fluctuations d’épaisseur et les fluctuations sélectives de flexion / épaisseur des domaines latéraux. Toutes les compositions lipidiques sont rapportées pour les bicouches DMPC:DSPC préparées à une fraction molaire de 70:30, en utilisant des variantes protiées et perdeuterées de DMPC et DSPC disponibles dans le commerce. Toutes les étapes de préparation de l’échantillon sont basées sur 4 mL de suspension liposomale, en D₂O, avec une concentration lipidique de 50 mg/mL, pour une masse lipidique totale de M_tot = 200 mg par échantillon.

1. Schéma de deutération requis pour l’expérience

1. Pour les mesures de fluctuation de flexion, faire des liposomes entièrement protiés dans D₂O (D 99,9%) ou D₂O-tampon (par exemple, tampon phosphate préparé avec D₂O au lieu de H_2O). Utilisez du DMPC entièrement protié (C₃₆H₇₂NO₈P) et du DSPC (C₄₄H₈₈NO₈P) avec 133,4 mg, où X_DMPC et X_DSPC sont les fractions molaires de DMPC et DSPC, ici réglés à 0,7 et 0,3, respectivement, et Mw_DMPC et Mw_DSPC sont les poids molaires donnés par 677,9 g/mol et 790,1 g/mol, respectivement. De même, m_DSPC = 66,6 mg. Ce schéma de deutération augmente le contraste de diffusion entre la membrane (NSLD ~ 0 × 10^{-6 Å -2}) et le tampon deutéré (NSLD ~ 6,4 × 10^{-6 Å -2}) et amplifie le signal des ondulations membranaires (voir le panneau de gauche de la figure 2A).
2. Pour mesurer la dynamique de flexion de certaines caractéristiques de la membrane latérale, par exemple la dynamique de la matrice dans les membranes DMPC:DSPC à séparation de phase, utilisez du DMPC protié (C₃₆H₇₂NO₈P) et deutéré, DSPC-d83 (C₄₄H₅NO₈₈₃, Mw 873,7 g/mol), de telle sorte que m_DMPC = 128,8 mg et m_DSPC-d83 = 71,2 mg. Ce schéma de deutération minimise la diffusion à partir des domaines riches en DSPC indésirables, ce qui permet de mesurer sélectivement les fluctuations de flexion de la matrice riche en DMPC (voir la figure 2B au milieu).
   REMARQUE: Pour trouver la deutération lipidique optimale requise pour un schéma d’appariement de contraste spécifique, utilisez les calculateurs de densité de longueur de diffusion (SLD) disponibles sur le Web, tels que celui développé par le NIST Center for Neutron Research⁶⁴. Ces interfaces web sont équipées d’outils conviviaux pour faciliter le calcul du SLD des lipides avec différents degrés de deutération, ainsi que celui des mélanges lipidiques.
3. Pour les mesures NSE des fluctuations moyennes de l’épaisseur de la membrane (sans contraste latéral), utiliser des variantes deutérées par la queue des lipides constitutifs, à dire DMPC-d54 (C₃₆H₁₈NO₈₅₄, 732,3 g/mol) et DSPC-d70 (C₄₄H₁₈NO₈₇₀, 860,1 g/mol)^35,38, de sorte que m_DMPC-d54 = 133,0 mg et m_DSPC-d70 = 67,0 mg. Ce schéma de contraste(Figure 2A,panneau de droite) amplifie le signal de diffusion des groupes de tête lipidiques (NSLD ~ 4,5 × 10^{-6 Å -2}) en faisant correspondre le groupe de queue (NSLD ~ 6,4 × 10^{-6 Å -2}) au tampon deutéré permettant la détection des fluctuations de l’épaisseur de la membrane.
4. Pour les études de fluctuation d’épaisseur de certains compartiments membranaires, par exemple la matrice riche en DMPC, utilisez la même stratégie décrite à l’étape 1.2 en remplaçant les lipides DMPC protiés par leurs analogues deutérés par la queue, c’est-à-dire DMPC-d54, de sorte que les domaines riches en DSPC correspondent au contraste avec le tampon deutéré et que le signal de diffusion primaire provient de la région du groupe de tête de la matrice riche en DMPC deutérée par la queue.

2. Préparation de la suspension lipidique pour l’extrusion

1. Calculer la masse de chaque constituant de l’échantillon, en fonction de la composition de l’échantillon. En règle générale, pour les échantillons à composantes moléculaires multiples, la masse d’un composant est donnée par sa masse molaire, Mw_i, pondérée par sa fraction molaire, X_i, et normalisée sur tous les composants de telle sorte que: où M_tot est la masse totale, fixée ici à 200 mg. Voir l’exemple ci-dessus pour les bicouches lipidiques DMPC-DSPC avec différents schémas de deutération.
2. À l’aide d’une semi-microbalance numérique, peser les masses calculées de lipides (et d’autres constituants de l’échantillon, par exemple des protéines, des nanoparticules, etc.) et les ajouter à un flacon ou à une fiole à fond rond – n’oubliez pas de peser le flacon ou la fiole au préalable. Ajouter 1 mL de solvant pour dissoudre les composants pesés en mélangeant manuellement à l’intérieur d’une hotte. Pour les échantillons de lipides purs, utilisez du chloroforme ou de l’éthanol. Pour les échantillons avec des composants non lipidiques supplémentaires (par exemple, des nanoparticules), choisissez un solvant commun qui disperse tous les composants.
   1. Pour les petites quantités de lipides (<10 mg), préparer une solution d’élevage et pipeter le volume requis dans le mélange.
      REMARQUE: N’ajoutez pas de quantités excessives de solvant car cela ralentira considérablement l’étape de séchage du solvant décrite ci-dessous.
3. Sécher la solution lipidique, à l’intérieur d’une hotte, en faisant couler doucement un gaz inerte (p. ex. azote, argon) dans le flacon tout en faisant tourner lentement le flacon en angle. Gardez les flacons en position inclinée pour créer une fine pellicule de lipides séchés sur les parois du flacon, ce qui permettra un séchage uniforme. Placez le flacon par intermittence dans un bain-marie à 35 °C pour éviter le refroidissement médié par évaporation, ce qui ralentira l’évaporation du solvant.
4. Placez les flacons pendant la nuit dans un four à vide à ~35 °C pour éliminer complètement le solvant résiduel. Pour les lipides insaturés, purger le vide avec un gaz inerte pour minimiser l’oxydation.
5. Pour assurer l’élimination complète du solvant, peser le flacon après séchage des lipides et confirmer qu’il n’y a pas d’excès de masse au-delà des quantités mesurées de matériaux. Pour ce faire, soustrayez la masse du flacon de la masse mesurée après séchage. S’il y a un excès de masse, sécher l’échantillon sous vide pendant encore 6 h. Répétez ce processus si nécessaire.
6. Hydrater le film lipidique avec 4 mL de tampon_D2O ou_D2O pour obtenir une concentration lipidique de 50 mg/mL. Pour les lipides à haute température de transition, tels que les mélanges DMPC-DSPC, chauffer le tampon au-dessus de la température de transition (60 °C) pour assurer un mélange uniforme.
   REMARQUE: Étant donné que les expériences NSE nécessitent des volumes d’échantillon relativement importants (~ 4 mL), envisagez d’hydrater l’échantillon en utilisant la moitié du tampon requis, c’est-à-dire 2 mL, afin de minimiser le nombre d’extrusions par échantillon (voir rubrique 3). Dans ce cas, ajoutez la moitié restante de la post-extrusion tampon. Notez que la capacité des seringues utilisées dans l’extrusion est limitée à 1 mL. Ainsi, l’hydratation avec 4 mL de tampon nécessiterait quatre ensembles d’extrusion.
7. Mélangez en vortex la solution lipidique hydratée jusqu’à ce que le film lipidique soit complètement dissous et ne soit plus visible sur les parois du flacon. À ce stade, les lipides hydratés forment des vésicules multilamellaires et des piles multilamellaire de la taille d’un micron et la suspension apparaît d’un blanc laiteux.
8. Pour faciliter la rupture des piles lipidiques et réduire la multilamellité, effectuer cinq cycles de congélation/décongélation en plaçant le flacon de solution lipidique hydratée dans un congélateur de laboratoire (de préférence un congélateur de qualité -80 °C) jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé, puis en transférant le flacon dans un bain-marie à 35 °C jusqu’à ce que la solution lipidique soit complètement décongelée. Vortex la solution décongelée jusqu’à homogénéisme. Répétez quatre fois de plus.
   REMARQUE: Alternativement, un bain de glace carbonique peut être préparé pour une congélation rapide en combinant de l’acétone et de la glace sèche.

3. Extrusion de la solution lipidique hydratée

1. Assemblez la configuration de l’extrudeuse à l’aide d’une membrane en polycarbonate entre deux supports de membrane et en ajoutant deux filtres en papier de chaque côté pour fournir un support supplémentaire. Utilisez une membrane en polycarbonate avec une taille de pore qui correspond à la taille liposomale cible (les tailles de pores courantes pour les expériences NSE sont de 50 nm et 100 nm – généralement, les liposomes de 100 nm de diamètre permettent des fluctuations membranaires moins contraintes, mais des liposomes plus petits de 50 nm pourraient être utilisés pour les études de courbure). Assurez-vous que la membrane en polycarbonate est complètement étirée avant de terminer l’assemblage et de serrer le boîtier externe de l’extrudeuse.
2. Hydrater la membrane en polycarbonate en passant environ 0,3 mL de tampon D₂O ou D₂O à travers l’assemblage de la membrane à l’aide de seringues en verre hermétiques. Utilisez le même tampon que celui utilisé dans la préparation des échantillons. Laissez-le pendant au moins 10 minutes, puis aspirez complètement le tampon avant d’introduire l’échantillon.
3. Remplissez une seringue étanche aux gaz de 1 mL avec la solution lipidique préparée et insérez-la dans une extrémité de l’appareil d’extrusion. Ensuite, insérez une seringue vide à l’extrémité opposée. Une fois les seringues connectées à l’ensemble de l’extrudeuse, placez-le dans le bloc de l’extrudeuse.
4. Si des températures élevées sont nécessaires pour l’extrusion, comme dans le cas de lipides saturés avec des températures de transition élevées (par exemple, DSPC, T_m = 55 °C), préchauffez le bloc chauffant de l’extrudeuse au-dessus de la température de transition lipidique (par exemple, 60 °C), en plaçant le bloc chauffant sur une plaque chauffante ou en utilisant un bain de circulation comme indiqué à la figure 3A.
   REMARQUE: Cette étape est cruciale pour assurer un mélange homogène des lipides et éviter d’exercer une pression extrême lors de l’extrusion, ce qui pourrait rompre la membrane en polycarbonate. Pour les échantillons lipidiques à basse température de transition (<25 °C), effectuez l’extrusion à température ambiante.
5. Pour extruder la solution lipidique, fixez l’ensemble de l’extrudeuse à une pompe à seringue programmable avec un cadre en aluminium/acier, comme illustré à la figure 3A. Pour les extrusions à température contrôlée, ajoutez une base d’extrudeuse sur mesure avec un canal de fluide et fixez-la à un bain-marie circulant.
6. Programmez la pompe à seringue pour effectuer 15 à 20 cycles d’extrusion en suivant le manuel du fabricant. Une fois extrudée, la couleur de la solution lipidique passe du blanc laiteux au bleu opale transparent(Figure 3B,C),indiquant une taille liposomale finale inférieure à la longueur d’onde de la lumière visible, comme prévu. Pour le type de pompe à seringue illustré à la figure 3A,suivez les étapes ci-dessous.
   1. Commencez par ajuster les paramètres de la pompe. Maintenez le bouton Taux enfoncé et entrez le taux d’extrusion (50,99 mL/h), puis appuyez sur le bouton Diamètre et entrez le diamètre de la seringue (4,606 mm). Utilisez les flèches vers le haut sous chaque chiffre à l’écran pour modifier la valeur de ce chiffre.
   2. Placez l’ensemble d’extrudeuses avec la seringue d’échantillonnage vers la droite (voir Figure 3A). Appuyez sur le bouton Retirer jusqu’à ce que le voyant de retrait s’allume. Appuyez sur Démarrer et attendez que l’échantillon soit distribué dans la seringue gauche (vide).
   3. Appuyez sur le bouton Arrêter juste avant que la seringue d’échantillon (droite) ne soit complètement vide. Enregistrez le volume distribué et utilisez-le pour programmer le cycle d’extrusion. Maintenez le bouton Taux enfoncé jusqu’à ce que la phase 1 (PH:01) apparaisse à l’écran. Appuyez sur le bouton Volume pour entrer le volume distribué enregistré précédemment. Dans cette phase, assurez-vous que la lumière Withdraw est éteinte – cela distribue l’échantillon dans la bonne direction.
   4. Appuyez à nouveau sur le bouton Taux et utilisez la flèche la plus à droite vers le haut pour accéder à la phase 2 (PH:02). Appuyez sur Volume pour entrer la même valeur que le volume distribué enregistré précédemment. Dans cette phase, appuyez sur le bouton Retirer jusqu’à ce que le voyant Retirer soit allumé – cela distribue l’échantillon à gauche.
   5. Pour répéter ce cycle, appuyez à nouveau sur le bouton Taux et utilisez la flèche vers le haut la plus à droite pour accéder à la phase 3 (PH:03). Appuyez sur le bouton Volume jusqu’à ce que LP:SE apparaisse à l’écran et réglez-le sur 20. Il s’agit du nombre de boucles ou de répétitions que la pompe effectuera. Enfin, appuyez sur le bouton Taux, accédez à la phase 4 (PH: 04) et appuyez sur le bouton Volume pour accéder à la fonction Arrêter. La pompe est maintenant configurée pour l’extrusion automatisée.
   6. Appuyez sur Démarrer pour démarrer le cycle d’extrusion.
7. Videz la seringue contenant la suspension lipidique extrudée dans un flacon propre et préparez-la pour le stockage ou les mesures. Pour les échantillons lipidiques à température de fusion élevée, conservez l’échantillon au-dessus de la transition de phase du fluide jusqu’à mesure qu’il soit mesuré. Sinon, conservez les échantillons à température ambiante.
8. Ne congelez pas les échantillons extrudés, car la congélation provoquera l’éclatement des vésicules (la suspension redevisera blanc laiteux).

4. Mesures NSE pour le(s) échantillon(s) et réduction des données collectées

1. Avant l’expérience NSE, caractériser l’échantillon liposomal extrudé de l’étape 3.7 en utilisant les méthodes disponibles pour assurer une qualité d’échantillon adéquate. Une liste des méthodes de charcatérisation potentielles qui peuvent être utilisées pour évaluer la qualité des suspensions liposomales pour les expériences NSE, par exemple, la distribution de taille, la multilamellaire, la structure de la membrane latérale, est incluse dans la section de discussion.
2. Déterminez la plage Q et les paramètres d’instrument correspondants requis pour l’expérience. Pour les mesures de rigidité en flexion des bicouches lipidiques, utilisez une plage Q de ~(0,04 - 0,2) Å^-1. Pour les études des fluctuations d’épaisseur de membrane, utilisez une plage Q de ~(0,04 - 0,2) Å^-1 correspondant à l’épaisseur de membrane^35,66,67.
   REMARQUE: Discutez de la configuration expérimentale avec le scientifique de l’instrument avant le début de l’expérience. Comme mentionné précédemment, la caractérisation SANS de l’échantillon est nécessaire, en particulier si l’information préalable du signal de diffusion n’est pas disponible, comme dans les membranes deutérées sélectivement. Alternativement, exécutez des mesures statiques (également connues sous le nom de diffraction) sur une plage Q limitée sur l’instrument NSE, avec la mise en garde que ces mesures prennent beaucoup plus de temps que SANS.
3. À l’aide d’une seringue ou d’une pipette de transfert, chargez la ou les suspensions liposomales extrudées dans les cellules d’échantillon désignées disponibles aux lignes de faisceau NSE. Notez que les cellules d’échantillon NSE standard sont disponibles en épaisseurs de 1, 2, 3 et 4 mm. Choisissez l’épaisseur de la cellule de manière à optimiser le signal de diffusion tout en maintenant le signal de fond incohérent à une intensité raisonnable.
   REMARQUE: En règle générale, utilisez des cellules d’échantillon avec une longueur de trajet de 1 ou 2 mm pour les liposomes protisés dans un tampon deutéré - des cellules plus épaisses pourraient entraîner de multiples effets de diffusion difficiles à corriger. Pour les liposomes présentant des niveaux plus élevés de deutérations (p. ex., liposomes appariés au contraste de la queue ou liposomes asymétriques avec des feuillets protifés uniques), envisagez d’utiliser une cellule d’échantillon plus épaisse (p. ex., longueur de chemin de 3 ou 4 mm) pour améliorer les statistiques de comptage si l’échantillon est disponible en plus grandes quantités – parfois, cela peut être prohibitif.
4. Préparez une cellule d’échantillon identique pour le tampon. Utilisez le même tampon que dans la suspension liposomale. Des mesures sur le tampon sont nécessaires pour la normalisation de l’intensité et les corrections de fond (BKG).
5. Placez la ou les cellules d’échantillon dans le porte-échantillon du spectromètre NSE, programmez les séries de mesure et collectez les données d’écho. Consultez le scientifique de l’instrument au sujet de la programmation des mesures si vous utilisez un nouvel utilisateur de NSE.
6. Effectuez deux ensembles supplémentaires de mesures nécessaires à la réduction des données : les mesures de résolution (R) et de transmission (T).
   1. Effectuer une mesure de résolution (R) sur une référence de diffusion élastique (par exemple, le carbone) - à exécuter dans les mêmes paramètres; c’est-à-dire les mêmes vecteurs d’onde et les mêmes temps de Fourier que les mesures d’échantillon et de tampon.
   2. Effectuer des mesures de transmission (T) sur l’échantillon et le tampon pour calculer l’intensité du faisceau de neutrons transmis (voir l’étape 4.9. ci-dessous). La transmission est calculée comme le rapport des nombres de neutrons de l’échantillon ou du tampon divisé par les comptes de neutrons pour un faisceau ouvert (c.-à-d. avec une position d’échantillon vide).
7. Utilisez le logiciel de réduction de données dédié pour le spectromètre NSE sur lequel les mesures sont effectuées afin de réduire les données collectées.
   REMARQUE: Différents spectromètres peuvent utiliser différents logiciels ou interfaces utilisateur. Vous trouverez ci-dessous un exemple de réduction des données NSE à l’aide de l’environnement d’analyse et de visualisation des données (DAVE)⁶⁸ logiciel spécialement écrit pour le spectromètre NSE du NIST Center for Neutron Research.
   1. Ouvrez le logiciel DAVE et sélectionnez Réduire les données NSE dans le menu de réduction des données. Plusieurs fenêtres pop-up apparaîtront.
   2. Téléchargez les fichiers de données sur différentes valeurs Q à l’aide du fichier Ouvrir .echo dans le menu Fichier. Ces fichiers correspondent aux fichiers de données brutes avec les signaux d’écho de spin et ont l’extension .echo dans le nom du fichier. Une fois le téléchargement du fichier terminé, les fichiers s’afficheront sous les ensembles de données disponibles.
   3. Faites un clic droit sur le fichier sélectionné et étiquetez-le en fonction de la mesure à laquelle il correspond; c’est-à-dire Échantillon, Cellule (pour cellule vide ou tampon) ou Résolution.
   4. Regroupez les pixles du détecteur en 2 x 2 pour améliorer le rapport signal/bruit à l’aide de l’onglet Ensemble de données. Appliquez le même binning à tous les fichiers ; c’est-à-dire Résolution, Cellule et Échantillon.
   5. Inspectez les données sur tous les groupes de pixels et masquez ceux dont les signaux sont faibles (voir Figure 4B)en appuyant sur la touche m du clavier. Appuyez sur Entrée pour accéder à une fenêtre contextuelle afin d’appliquer le même masque à toutes les fois de Fourier ou aux heures de Fourier suivantes. Cela peut également être appliqué à des pixels individuels à tout moment pendant la réduction des données. Les pixels masqués deviennent verts.
   6. S’assurer que les données recueillies se présentent sous la forme d’un signal d’écho, c’est-à-dire d’une fonction cosinus en termes de courant de phase, sur chaque pixel du détecteur (voir la figure 4A).
      NOTE: Le courant de phase est proportionnel à l’angle de précession du spin du neutron; par conséquent, il est courant de représenter le courant de phase sous la forme d’un angle de phase, comme le montre la figure 4A. Pour les mesures sur des sources pulsées, des calculs de temps de vol supplémentaires sont appliqués aux données pour obtenir les signaux d’écho en fonction de la longueur d’onde des neutrons incidents dans une impulsion neutronique.
   7. Commencez par ajuster le fichier de résolution. Sélectionnez un fichier de résolution dans la liste des fichiers téléchargés et cliquez avec le bouton droit sur le fichier. Sélectionnez Ajuster les opérations : Ajuster les échos (résolution) dans le menu contextuel.
   8. Assurez-vous que les ajustements des signaux d’écho produisent un certain nombre de paramètres d’ajustement, y compris le paramètre A, requis à l’étape 4.8. Les ajustements sont automatiquement effectués à l’aide de l’expression suivante.
      
      Ici, ζ est la période du signal d’écho (c’est-à-dire la fonction cosinus de la figure 4A),σ est la largeur de l’enveloppe gaussienne déterminée par la longueur d’onde moyenne et la propagation de longueur d’onde du faisceau de neutrons incident, Φ_c est le courant de phase et Φ₀ est le point d’écho qui dépend du chemin de champ expérimenté par les neutrons⁵⁰. Les informations physiques sur l’échantillon sont codées dans l’amplitude Ade la fonction cosinus dans l’équation (1).
      REMARQUE: La largeur de l’enveloppe gaussienne est basée sur des valeurs prédéterminées par le scientifique de l’instrument et ne doit pas être modifiée. Les autres paramètres sont des variables qui sont ajustées au signal d’écho spécifique sur chaque pixel.
   9. Inspectez les résultats de l’ajustement en cliquant sur chaque pixel pour afficher les paramètres d’ajustement résultants, la qualité de l’ajustement et l’écart carré moyen de l’ajustement. Pour inspecter l’erreur associée à chaque paramètre de raccord sur l’ensemble du détecteur, sélectionnez Options d’image, puis sélectionnez le paramètre d’ajustement qui vous intéresse. Cela générera une carte avec la valeur du paramètre d’ajustement sur chaque pixel. Faites un clic droit sur l’image du détecteur. Une fenêtre contextuelle apparaîtra montrant une carte de barre d’erreur du paramètre d’ajustement sélectionné.
   10. Si l’ajustement sur un pixel spécifique n’est pas satisfaisant (par exemple, ajuster des paramètres avec de grandes barres d’erreur), réajustez le signal sur ce pixel spécifique. Sélectionnez ce pixel, appuyez sur l’onglet Raccord, puis appuyezsur Ajuster le pixel . Entrez de nouveaux paramètres de départ pour la phase (Φ₀) et la période (ζ) dans l’onglet Raccord pour obtenir un ajustement plus satisfaisant.
       REMARQUE: Il est utile de tracer la phase ajustée en fonction du temps de Fourier. Pour ce faire, accédez à la fenêtre principale du tracé et sélectionnez Ajuster la phase v. Temps de Fourier. Cette intrigue doit être lisse et continue. Inspectez les discontinuités dans ce tracé et réajustez les pixels auxquels elles correspondent.
8. Réduisez le fichier Sample ou Cell en sélectionnant le fichier correspondant dans la liste des fichiers téléchargés et étiquetés.
   1. Inspectez tous les pixels et masquez ceux qui ont de mauvaises statistiques comme décrit à l’étape 4.7.5.
   2. Cliquez avec le bouton droit sur le fichier et sélectionnez Ajuster les opérations : Phases d’importation (exemple, cellule). Cela importe les phases et le masque appliqué à partir du fichier de résolution.
   3. Ajustez les signaux d’écho en utilisant la même procédure décrite précédemment pour le fichier de résolution (étapes 4.7.8-4.7.10). Lors de l’ajustement des fichiers Sample et Cell, ne modifiez pas les valeurs de la période et du point de phase d’écho importés à partir des ajustements de résolution. Ces paramètres dépendent des paramètres instrumentaux et ne doivent pas varier d’un échantillon à l’autre.
   4. Avant de procéder à la réduction des données, entrez le centre de faisceau pour tous les fichiers de données. Sélectionnez le fichier de données, accédez à l’onglet Général et entrez les valeurs centrales des poutres X et Y. Ces valeurs sont enregistrées au cours de l’expérience.
   5. Une fois les ajustements aux fichiers Échantillon, Cellule et Résolution terminés, calculez la fonction de diffusion intermédiaire normalisée à utiliser ultérieurement dans l’analyse et l’interprétation des données. Pour ce faire, faites un clic droit sur le fichier Exemple à réduire dans la liste des fichiers ajustés, puis sélectionnez Calculer I(Q) dans le menu contextuel. Une fenêtre apparaîtra avec des choix d’entrée pour les fichiers Résolution et Cellule (c’est-à-dire mémoire tampon) et le nombre d’arcs Q (voir l’étape 4.9). Après avoir entré toutes les informations requises, appuyez sur le bouton OK. Les résultats apparaîtront dans une nouvelle fenêtre.
      REMARQUE: La réduction des données est effectuée selon l’équation suivante pour obtenir la fonction de diffusion intermédiaire normalisée⁶⁹.
      
      où t est le temps de Fourier, N vers le _haut et N vers le _bas sont les nombres de neutrons dans les configurations sans spin-flip et spin-flip (mesurées avec les π/2-flippers désactivés et les π-flipper éteints et activés, respectivement), et les exposants, BKG et R, correspondent respectivement aux mesures d’arrière-plan et de résolution, telles que définies aux étapes 4.4 et 4.6. Notez que la polarisation du faisceau, donc les changements dans l’état de spin dus à l’échange d’énergie entre le neutron et l’échantillon est détectée comme une baisse de la polarisation (de l’unité).
9. Enfin, regroupez les pixels du détecteur en arcs Q-comme le montre la figure 4B pour obtenir la Q-dépendancede la fonction de diffusion intermédiaire normalisée, S(Q,t)/ S(Q,0). C’est ce qu’on appelle techniquement le regroupement de données et cela doit être fait judicieusement, c’est-à-dire en tenant compte des statistiques de comptage de l’échantillon et de l’écart-type attendu des données sur les pixels groupés.
10. Pour les échantillons à forte diffusion, divisez le détecteur en plus d’arcs Q tout en maintenant des barres d’erreur raisonnables sur la fonction de diffusion intermédiaire résultante, S(Q,t) / S(Q, 0 ). Cela donne plus de points de données Q et est important pour la procédure d’analyse des données décrite ci-dessous. Sachez que pour les échantillons à faible diffusion, un binning excessif entraîne de mauvais signaux de désintégration, c’est-à-dire de grandes barres d’erreur sur S(Q,t) / S(Q, 0 ), ce qui pourrait entraîner de grandes incertitudes.

5. Analyse et interprétation des données

1. Ajuster les fonctions de diffusion intermédiaire normalisées, S(Q,t) / S(Q, 0 ), obtenues à partir de la réduction des données ci-dessus à une fonction exponentielle étirée avec un exposant d’étirement de 2/3⁷⁰.
   
   REMARQUE : Un exemple de ces ajustements est fourni à la figure 5B. Les ajustements de S(Q,t) / S(Q, 0 ) à l’équation (3) donnent les taux de relaxation dépendants de Q Γ (Q).
2. Tracer Γ(Q) en fonction de Q et s’adapter à un modèle approprié pour extraire les paramètres de membrane pertinents.

Les études NSE accédant aux fluctuations de flexion sont généralement réalisées sur une plage Q de ~ (0,04 - 0,2) Å-1. Cette gamme Q correspond à des échelles de longueur intermédiaires entre l’épaisseur de la membrane et le rayon liposomal, où la dynamique de flexion domine. La mesure sur une plage Q étendue peut donner accès à des modes dynamiques supplémentaires, y compris la diffusion liposomale et la dynamique intramembranaire. Pour plus de détails sur le cross-over dans la dynamique membranaire accessible par NSE, consultez ces publications pertinentes25,71. Il est important de souligner que les signaux NSE sont proportionnels à: , où Icoh et Iinc sont, respectivement, l’intensité de diffusion cohérente et incohérente de l’échantillon. Par conséquent, il est conseillé de préparer des échantillons liposomaux NSE dans des tampons deutérés (c’est-à-dire des tampons préparés avec D2O au lieu de H2O) afin de minimiser le signal de diffusion incohérent, principalement contribué par la teneur en hydrogène de l’échantillon. Cependant, dans certains cas, des schémas de deutération intermédiaires (c’est-à-dire utilisant des mélanges deD2O et H2O) peuvent être nécessaires pour obtenir des conditions de contraste optimales. En règle générale, les mesures NSE des fluctuations de flexion de la membrane sont effectuées sur des liposomes entièrement protiés dans un tampon deutéré, appelés liposomes entièrement contrastés dans la figure 5. Ce schéma de deutération entraîne une grande différence NSLD entre le noyau de la membrane (~0 × 10-6 Å-2) et son environnement fluide deutéré (~6,4 × 10-6 Å -2), ce qui améliore considérablement le signal de diffusion des membranes liposomales et améliore les statistiques de mesure de la dynamique de flexion. Ce schéma de contraste(figure 2A panneau de gauche) est fréquemment utilisé dans les études de rigidité de flexion des membranes lipidiques avec des composants lipidiques simples38,72 et multiples39,66 et dans les études de ramollissement / raidissement de la membrane par des inclusions biologiques (par exemple, cholestérol, molécules médicamenteuses, peptides / protéines)36,37,73,74,75et des additifs synthétiques (par exemple, nanoparticules)76,77.

Les mesures des fluctuations de flexion entraînent des taux de relaxation qui suivent une dépendance Q3, comme prédit par Zilman et Granek pour les feuilles minces élastiques ondulantes thermiquement70. Une forme affinée de cette Q-dépendanceest obtenue à partir de corrections théoriques de Watson et Brown78,qui prennent en compte les effets du frottement intermonouche proposé par Seifert et Langer79. En définissant en outre le plan neutre comme faisant partie de l’interface entre les groupes de têtes hydrophiles et les queues hydrophobes de la membrane, les taux de relaxation en flexion peuvent alors être ajustés à l’expression suivante38.

où ηbuff est la viscosité tampon, kBT est l’énergie thermique, κ et est la rigidité de flexion de la membrane mesurée (ou de la partie contrastée de la membrane dans les systèmes deutérés sélectivement). Ce type de mesure permet le calcul direct des propriétés élastiques de la membrane sous la forme du module de rigidité de flexion. Notez que κ est extrait de la pente de l’ajustement linéaire de Γ vs Q3, comme le montre la figure 5C.

D’autre part, les mesures NSE des fluctuations d’épaisseur de membranemontrent des écarts par rapport à la dépendance Q3dans Γ( Q ) autour de valeurs Q qui correspondent à l’épaisseur de la membrane (voir figure 2 dans la réf.66). Pour isoler le signal de fluctuation d’épaisseur, on peut diviser Γ(Q) par Q3, comme le montre la figure 5D. Les données résultantes montrent que la dynamique excédentaire due aux fluctuations d’épaisseur suit une fonction lorentzienne dans Q, comme récemment corroboré dans les simulations de dynamique moléculaire à grains grossiers (MD)67. Pour s’adapter à la dynamique excessive observée, Nagao et al.38 ont développé une expression basée sur le cadre théorique des fluctuations membranaires par Bingham et al.80 comme suit.

Dans cette expression, Q0 est la valeur Qde crête correspondant à l’épaisseur de la membrane (qui peut être obtenue indépendamment à partir de mesures SANS), μ est la viscosité de la membrane dans le plan, AL est la surface par lipide (mesurée avec SANS/SAXS), et KA est le module de compressibilité de l’aire. En supposant que KA puisse être calculé à partir de κ à l’aide du modèle de brosse polymère, cette expression se réduit à un paramètre d’ajustement, à savoir la viscosité de la membrane μ, présentant une nouvelle approche pour mesurer la viscosité de la membrane sans avoir besoin de marquage de fluorescence ou d’attache/suivi des particules13. La prémisse est que selon les modèles de déformation des feuilles minces élastiques81, κ et KA sont interdépendantes telles que: , où tm est l’épaisseur mécanique (ou déformable) de la membrane et β est une constante qui décrit le couplage interleaflet. L’hypothèse est que   β = 12 pour les folioles entièrement couplées, β = 48 pour les folioles complètement découplées et β = 24 pour les folioles à couplage intermédiaire. Ce dernier est appelé le modèle de brosse polymère81 et il a été démontré qu’il s’applique dans les membranes lipidiques fluides monocomposantes et binaires39. Cependant, cela doit être abordé avec prudence. Par exemple, des simulations récentes de Doktorova et al. 82 a montré que pour que le modèle de brosse en polymère maintienne dans des membranes lipidiques insaturées contenant du cholestérol, une expression modifiée de l’épaisseur mécanique de la membrane doit être utilisée. Idéalement, si une mesure indépendante de KA est possible, par exemple en utilisant l’aspiration par micropipette83, la combinaison des résultats KA avec des mesures de rigidité de flexion NSE présenterait une occasion unique d’étudier le couplage entre les feuilles dans les membranes modèles et biologiques – une question de longue date en biophysique membranaire et en biologie structurale. Une fois les valeurs de KA validées, elles peuvent être utilisées dans l’équation 5 pour obtenir la viscosité mésoscopique de la membrane.

Figure 1: Conception del’instrument NSE et chevauchement synergique avec les échelles longueur/temps de la dynamique membranaire mésoscopique. (A) Schéma des différents éléments magnétiques d’un instrument NSE, utilisé pour manipuler le spin des neutrons traversant l’instrument de gauche à droite. Le neutron mis en évidence indique un changement d’orientation de spin (ou une perte de polarisation) dû à l’échange d’énergie entre le neutron et l’échantillon, tandis que le neutron transparent représente l’écho de spin, c’est-à-dire aucun changement dans le spin du neutron dû à un échange d’énergie nul. La flèche grise indique la possibilité de faire pivoter le deuxième bras du spectromètre pour accéder à des angles de diffusion plus grands. (B) Représentation picturale de la dynamique hiérarchique dans les membranes lipidiques, montrant divers modes dynamiques qui s’étendent sur plusieurs échelles de longueur et de temps. La zone ombrée représente les échelles de longueur et de temps auxquelles accède NSE, qui chevauchent les méso-échelles des fluctuations membranaires collectives, à savoir les fluctuations de flexion et d’épaisseur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Exemples de schémas de deutération possibles dans les expériences NSE sur membranes lipidiques. (A) Gauche: Membranes entièrement contrastées, par exemple membranes protées dans un tampon deutéré, montrant le profil NSLD le long de la normale à la surface de la membrane. La différence dans la NSLD entre la région de la queue (~0 × 10-2 Å-2) et la région du groupe de tête (~4,5 × 10-6 Å-2) de la membrane est due à l’hydratation du groupe de tête avec tampon deutéré. Droite : Membranes appariées au contraste de la queue de telle sorte que la région de la queue d’hydrocarbure de la membrane a la même LNDS que le tampon, comme indiqué dans le profil NSLD correspondant le long de la membrane normale. (B) Membranes formant un domaine avec deux schémas de contraste neutronique où les domaines (au centre) ou la matrice (à gauche) sont assortis au tampon, permettant des études sélectives de la matrice ou de la dynamique du domaine, respectivement. Cette figure a été modifiée à partir de Nickels et al., JACS 201541. (C) Membranes asymétriques préparées par échange de cyclodextrine entre des vésicules lipidiques protées et deutérées, entraînant la deutération d’une feuillet membranaire tout en maintenant l’autre feuillet protiée. Cela permet d’études de la dynamique de flexion de la feuillet protiée et fournit des informations sur le couplage mécanique entre les folioles opposées dans les membranes asymétriques. Cette figure a été modifiée à partir de Rickeard et al., Nanoscale 202040. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Illustration de la configuration pour l’extrusion automatisée de liposomes. (A) Extrudeuse automatisée sur mesure utilisant une pompe à seringue, un mini ensemble d’extrudeuses et un cadre en aluminium / acier pour permettre des extrusions cycliques. (B) et (C) montrent la différence d’aspect visuel des suspensions lipidiques avant (blanc laiteux) et après (bleu opale transparent) extrusion. Cela est dû à la formation initiale de piles lipidiques de la taille d’un micron ou de vésicules géantes qui sont de l’ordre ou supérieures à la longueur d’onde de la lumière visible. Après extrusion, la suspension comprendra des vésicules nanoscopiques (~100 nm), qui sont plus petites que la longueur d’onde de la lumière visible, donnant une suspension transparente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Données représentatives d’expériences NSE sur suspensions liposomiques. (A) Exemple d’un signal d’écho sur un seul pixel de détecteur (pixel marqué dans le panneau B), montrant les ajustements du signal d’écho à l’aide de l’équation (1), avec une illustration des différents paramètres requis dans l’ajustement de l’écho. Notez que le signal d’écho est tracé en fonction de l’angle de phase au lieu du courant de phase comme indiqué à l’étape 4.7 du protocole. (B) Image du détecteur NSE montrant la variation du nombre de neutrons par pixel. L’image montre également des pixels de détecteur éliminés (vert) en raison de mauvais signaux d’écho. Le binning des pixels du détecteur dans les arcs Q (également connus sous le nom d’anneaux de Debye-Scherrer) donne la Q-dépendance de la fonction de diffusion intermédiaire, nécessaire à l’analyse et à l’interprétation des données NSE. Cette figure a été modifiée à partir de Ashkar, J. Appl. Phys. 202050. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Résultats représentatifs d’expériences NSE sur suspensions liposomales avec différents schémas de deutération. (A) Géométrie de diffusion d’un neutron interagissant avec un liposome, montrant l’angle de diffusion, 2θ, et le transfert du vecteur d’onde, . (B) Les fonctions de diffusion intermédiaires, S(Q,t) / S(Q,0), présentent des désintégrations en fonction du temps de Fourier. L’ajustement des désintégrations mesurées à une fonction exponentielle étirée donnée par l’équation 3 donne les taux de relaxation, Γ(Q). (C) Pour les liposomes entièrement protiés dans un tampon deutéré, Γ(Q) suit une dépendance Q3, typique de la dynamique de flexion. L’ajustement linéaire des données obtenues à un modèle de Zilman-Granek donne le module de rigidité de flexion de la membrane. (D) Pour les liposomes deutérés de la queue, une dynamique excessive est observée en plus des fluctuations de flexion et sont plus prononcées à des valeurs Q qui correspondent à l’épaisseur de la membrane. L’ajustement de l’excès de dynamique à une fonction lorentzienne (équation 5) permet d’extraire la viscosité de la membrane. Des ensembles de données ont été recueillis sur le spectromètre NSE du NIST. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts et n’ont rien à divulguer.