Analyse de suivi des nanoparticules pour la quantification et la détermination de la taille des vésicules extracellulaires

Summary

Nous montrons comment utiliser un nouvel instrument d’analyse de suivi des nanoparticules pour estimer la distribution de taille et la concentration totale de particules de vésicules extracellulaires isolées du tissu adipeux périgornadique de souris et du plasma humain.

Abstract

Les rôles physiologiques et physiopathologiques des vésicules extracellulaires (VE) sont de plus en plus reconnus, faisant du domaine des VÉHICULES électriques un domaine de recherche en évolution rapide. Il existe de nombreuses méthodes différentes pour l’isolation des véhicules électriques, chacune présentant des avantages et des inconvénients distincts qui affectent le rendement en aval et la pureté des véhicules électriques. Ainsi, caractériser la préparation EV isolée d’une source donnée par une méthode choisie est importante pour l’interprétation des résultats en aval et la comparaison des résultats entre les laboratoires. Diverses méthodes existent pour déterminer la taille et la quantité de VE, qui peuvent être modifiées par des états pathologiques ou en réponse à des conditions externes. L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est l’une des principales technologies utilisées pour l’analyse à haut débit des véhicules électriques individuels. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la quantification et la détermination de la taille des VE isolés du tissu adipeux périgornadique de souris et du plasma humain à l’aide d’une technologie révolutionnaire pour la NTA représentant des avancées majeures dans le domaine. Les résultats démontrent que cette méthode peut fournir des données reproductibles et valides sur la concentration totale des particules et la distribution granulométrique pour les VE isolés de différentes sources à l’aide de différentes méthodes, comme le confirme la microscopie électronique à transmission. L’adaptation de cet instrument à la NTA permettra de répondre à la nécessité d’une normalisation des méthodes de la NTA afin d’accroître la rigueur et la reproductibilité dans la recherche sur les VE.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont de petites vésicules membranaires (0,03-2 μm) sécrétées par presque tous les types de cellules^1. Ils sont souvent appelés « exosomes », « microvésicules » ou « corps apoptotiques » en fonction de leur mécanisme de libération et de leur taille^2. Alors qu’on pensait au départ que les VE étaient simplement un moyen d’éliminer les déchets de la cellule pour maintenir l’homéostasie^3,nous savons maintenant qu’ils peuvent également participer à la communication intercellulaire via le transfert de matériel moléculaire - y compris l’ADN, l’ARN (ARNm, microARN), les lipides et les protéines^4,5 - et qu’ils sont d’importants régulateurs de la physiologie normale ainsi que des processus pathologiques^{1, 5,6,7,8}.

Il existe de nombreuses méthodes différentes pour isoler et quantifier les VE, qui ont été décrites^{ailleurs 9,10,11,12}. Le protocole d’isolement utilisé ainsi que la source des véhicules électriques peuvent avoir un impact considérable sur le rendement et la pureté des véhicules électriques. Même la centrifugation différentielle, longtemps considérée comme l’approche « étalon-or » pour l’isolement des exosomes, peut être sujette à une variabilité substantielle ayant par la suite un impact sur la population de VE obtenue et les analyses en aval^13. Ainsi, les différentes méthodologies d’isolement et de quantification des VE rendent difficile la comparaison, la reproduction et l’interprétation des résultats des expériences rapportées dans la littérature^14. En outre, la libération de VE peut être régulée par des conditions cellulaires ou divers facteurs externes. Il a été suggéré que les VE jouent un rôle dans le maintien de l’homéostasie cellulaire en protégeant les cellules contre le stress intracellulaire¹⁵, car plusieurs études ont montré que le stress cellulaire stimule la sécrétion de VE. Parexemple, une augmentation de la libération de VE a été rapportée après une exposition cellulaire à l’hypoxie, au stress du réticulum endoplasmique, au stress oxydatif, au stress mécanique, à l’extrait de fumée de cigarette et à la pollution de l’air par les particules^16,17,18^,19, 20^,21,22. Il a également été démontré que la libération de VE est modifiée in vivo; les souris soumises à un régime riche en graisses ou à un jeûne pendant seize heures ont libéré plus de VE adipocytaires²³. Pour déterminer si un traitement ou une affection spécifique modifie la libération de VE, le nombre de VE doit être déterminé avec précision. L’évaluation de la distribution de la taille des VE peut également indiquer l’origine subcellulaire prédominante des VE (p. ex., fusion d’endosomes/corps multivésiculaires tardifs avec la membrane plasmique par rapport au bourgeonnement de la membrane plasmique)²⁴. Il est donc nécessaire de mettre au point des méthodes robustes pour mesurer avec précision la concentration totale et la distribution granulométrique de la préparation ev étudiée.

Une méthode rapide et très sensible pour la visualisation et la caractérisation des véhicules électriques en solution est l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Une explication détaillée des principes de cette méthode et une comparaison avec d’autres méthodes d’évaluation de la taille et de la concentration des VE ont été décrites précédemment^25,26,27,28. En bref, lors de la mesure NTA, les véhicules électriques sont visualisés par la lumière diffusée lorsqu’ils sont irradiés avec un faisceau laser. La lumière diffusée est focalée par un microscope sur une caméra qui enregistre le mouvement des particules. Le logiciel NTA suit le mouvement thermique aléatoire de chaque particule, connu sous le nom de mouvement brownien, pour déterminer le coefficient de diffusion qui est utilisé pour calculer la taille de chaque particule à l’aide de l’équation de Stokes-Einstein. La NTA a été appliquée pour la première fois à la mesure des VE dans un échantillon biologique en 2011²⁵. Jusqu’à récemment, il n’y avait que deux sociétés grand public offrant des instruments NTA commerciaux²⁹ jusqu’à l’introduction du ViewSizer 3000 (ci-après dénommé l’instrument de suivi des particules) qui utilise une combinaison de nouvelles solutions matérielles et logicielles pour surmonter les limites importantes d’autres techniques NTA.

L’instrument de suivi des particules caractérise les nanoparticules dans les échantillons liquides en analysant leur mouvement brownien et caractérise les particules plus grosses de la taille d’un micron en analysant la décantation gravitationnelle. Le système optique unique de cet instrument, qui comprend un éclairage multispectral avec trois sources de lumière laser (à 450 nm, 520 nm et 635 nm), permet aux chercheurs d’analyser simultanément un large éventail de tailles de particules (par exemple, exosomes, microvésicules). Un schéma de la configuration de l’instrument est illustré à la figure 1.

Ici, nous montrons comment effectuer des mesures de distribution granulométrique et de concentration de véhicules électriques isolés de souris et d’humains à l’aide d’un nouvel instrument NTA.

Figure 1: Système optique d’instrument de suivi des particules. L’instrument NTA éclaire les particules à l’aide de trois lasers avec les longueurs d’onde suivantes : 450 nm, 520 nm, 635 nm. L’enregistrement vidéo de la lumière diffusée à partir de particules individuelles est détecté et suivi par une caméra vidéo numérique orientée à 90 ° de la cuvette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Tous les travaux avec ces échantillons ont été effectués conformément aux lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement et du Comité d’examen de l’établissement. Une vue d’ensemble schématique de la méthode NTA est illustrée à la figure 2.

Figure 2: Vue d’ensemble de la méthode NTA à l’aide de l’instrument de suivi des particules. L’échantillon est préparé et inséré dans l’instrument. Le logiciel NTA est ouvert, les paramètres d’enregistrement sont ajustés et l’échantillon est concentré. Ensuite, les données sont enregistrées, traitées et affichées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Isolement des vésicules extracellulaires

REMARQUE: Les VE du tissu adipeux périgornadique de souris ont été isolés comme décrit précédemment²³. Les VE plasmatiques ont été isolés à partir de 1 mL de plasma humain à l’aide du protocole suivant :

1. Prélever le plasma et centrifuger à 3 000 x g pendant 15 min pour éliminer les débris cellulaires. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
   REMARQUE: Si des débris supplémentaires restent détectables, centrifugez le surnageant pendant 10 minutes supplémentaires à 12 000 x g et transférez le surnageant dans un nouveau tube.
2. Ajouter 67 μL du réactif d’isolement des exosomes par 250 μL de plasma. Bien mélanger en inversant ou en agitant le tube.
3. Incuber sur de la glace à la verticale pendant 30 min.
4. Centrifuger le mélange réactif/plasma d’isolement des exosomes à 3 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   REMARQUE: La centrifugation peut être effectuée à température ambiante ou à 4 ° C avec des résultats similaires, mais 4 ° C est préférable. Après centrifugation, les véhicules électriques peuvent apparaître sous la forme d’une pastille beige ou blanche au fond du tube.
5. Aspirer soigneusement le surnageant. Faites tourner toute solution résiduelle d’isolation des exosomes et éliminez toute trace de liquide par aspiration, en prenant grand soin de ne pas perturber les véhicules électriques précipités dans la pastille.
6. Resuspendez la pastille dans 200 μL de tampon B (fourni par le fabricant). Mesurez et enregistrez la concentration en protéines de l’échantillon (pour l’étape 2.8) à l’aide d’un spectrophotomètre, d’un fluoromètre, d’un test de Bradford ou d’une autre méthode préférée.

2. Purification des ve électriques isolés

1. Ajouter 200 μL de tampon A (fourni par le fabricant) aux véhicules électriques suspendus.
2. Retirez la colonne de purification (fournie), desserrez le bouchon à vis et enclenchez la fermeture inférieure. Placez la colonne dans un tube de collecte.
   REMARQUE: Enregistrez la fermeture inférieure pour les étapes 2.7 à 2.9.
3. Centrifuger à 1 000 x g pendant 30 s pour retirer le tampon de stockage.
4. Jetez le flux et replacez la colonne dans le tube de collecte.
5. Pour laver la colonne, retirez le bouchon et appliquez 500 μL de tampon B sur le dessus de la résine et centrifugez à 1 000 x g pendant 30 s. Jetez le flux à travers. Enregistrez le bouchon pour les étapes 2.7 à 2.9.
6. Répétez les étapes 2.4 à 2.5 une fois de plus pour laver la colonne.
7. Branchez le bas de la colonne avec la fermeture inférieure (à partir de l’étape 2.2). Appliquez 100 μL de tampon B sur la résine pour la préparer au chargement de l’échantillon.
8. Ajouter la totalité du contenu de l’étape 1.6 (ou jusqu’à l’équivalent volumique de 4 mg de protéines totales) à la résine. Placez le bouchon à vis sur le dessus de la colonne.
9. Mélanger à température ambiante sur un agitateur rotatif pendant 5 min au plus.

3. Élution de l’échantillon

1. Desserrer le bouchon à vis et retirer la fermeture inférieure, puis transférer immédiatement dans un tube de microcentrifugation de 2 mL.
   REMARQUE: L’échantillon commencera à éluer dès que la fermeture inférieure sera retirée. Veuillez vous assurer que des tubes de microcentrifugation de 2 mL sont prêts à recevoir de l’éluat pour minimiser la perte d’échantillon.
2. Centrifuger à 1 000 x g pendant 30 s pour obtenir des VÉHICULES purifiés. Ignorez la colonne.

4. Préparation des échantillons pour l’analyse de suivi des nanoparticules

1. Utilisez un matériau non pelucheux comme un chiffon en microfibre pour couvrir l’espace de travail et empêcher les fibres de pénétrer dans les cuvettes.
2. En portant des gants, placez la cuvette sur le gabarit de cuvette magnétique, puis placez la barre de remuage dans la cuvette. Manipulez toujours les cuvettes avec des gants pour éviter que des empreintes digitales et des taches n’apparaissent sur la surface de la cuvette.
3. Utilisez l’outil crochet pour placer l’insert dans la cuvette, comme illustré à la figure 3. Il est important de noter l’orientation de l’insert pour plus tard (étape 5.4).

Figure 3: Orientation correcte de l’insert dans la cuvette de quartz. L’encoche de l’insert doit être visible de l’avant de la cuvette. Celui-ci doit être inséré dans l’instrument face à la caméra. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. À l’aide d’une pipette, ajouter lentement 400 à 500 μL du diluant ou de l’échantillon dilué à température ambiante à la cuvette à travers le trou de l’insert. Pipetter doucement de haut en bas pour mélanger. Évitez d’introduire des bulles d’air.
   1. Préparez d’abord une cuvette chargée du diluant choisi (blanc) pour mesurer la concentration en particules du diluant. Cela doit être fait avant de mesurer l’échantillon afin que la concentration de fond de l’échantillon puisse être corrigée.
      REMARQUE: Un bon blanc (solution saline tamponnée au phosphate [PBS] dans ce cas) aura une concentration <9 x 10⁶ (selon le diluant) et affichera 1 à 10 particules par écran dans la vue en direct (Figure 4). Il est recommandé que la concentration réelle de particules de l’échantillon soit au moins 3 fois supérieure à la concentration de fond.
   2. En option, avant d’enregistrer l’échantillon, amorcer la cuvette avec 400-500 μL du diluant ou de l’échantillon dilué avant la mesure. Pour ce faire, chargez 400 à 500 μL de l’échantillon dilué dans la cuvette, jetez la solution, puis ajoutez 400 à 500 μL de plus de l’échantillon pour la mesure. Cela peut aider à éliminer les résidus dans la cuvette.

Figure 4: Vue représentative en direct d’un diluant dans la plage de concentration appropriée d’un blanc. Diluer les préparations EV dans du PBS filtré (0,02 μm ou 3 kDa, de préférence). Un bon blanc affichera ~ 1-10 particules par écran dans la vue en direct, ce qui donne une concentration comprise entre 10⁵et 10⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Coiuchez la cuvette et vérifiez la ne pas y avoir de bulles. Appuyez sur les bulles si nécessaire. Utilisez un chiffon non pelucheux pour essuyer les faces extérieures de la cuvette.

5. Procédure de démarrage de l’instrument de suivi des particules

1. Allumez le poste de travail et l’instrument de l’ordinateur, attendez quelques minutes avant d’exécuter le premier échantillon et démarrez le programme en cliquant sur l’icône du logiciel. Lorsque vous y êtes invité, cliquez sur NTA à l’écran pour effectuer une analyse de suivi des nanoparticules. Commencez dans l’onglet Enregistrement et cliquez sur les différents onglets logiciels(Enregistrement, Processus, Tracé)pour basculer entre eux tout au long du protocole. Enregistrez d’abord l’échantillon (diluant ou préparation EV), puis traitez les enregistrements et enfin tracez les résultats.
2. Suivez les instructions à l’écran pour remplir toutes les informations nécessaires sur l’échantillon. Vérifiez que tous les champs nécessaires sont remplis et exacts, c’est-à-dire le nom de l’échantillon, la description, la préparation de l’échantillon, le facteur de dilution [1000], la température cible (réglée sur 22 °C) et le diluant : Sélectionnez le diluant dans le menu déroulant et utilisez PBS comme diluant pour les VE. La sélection de PBS dans le menu déroulant remplira automatiquement la salinité à 9%. Ces informations sont nécessaires pour déterminer la viscosité dynamique du liquide.
   REMARQUE: Il peut prendre jusqu’à 3 minutes pour que la température s’équilibre à l’intérieur de la cuvette même si la sonde indique déjà la température souhaitée (c’est-à-dire que le point vert devient stable). Les lectures d’échantillons peuvent varier considérablement si la température cible n’est pas définie, car les différences de température des échantillons pourraient modifier considérablement le mouvement brownien des particules.
3. Ouvrez le couvercle de l’instrument et retirez le couvercle du capuchon de protection à l’endroit où la cuvette sera placée.
   ATTENTION : L’instrument de suivi des particules est certifié comme un produit laser de classe 1 (21 CFR Ch. I partie 1040), contenant des lasers qui peuvent être dangereux et pourraient causer des blessures graves telles que des brûlures et / ou des dommages permanents à la vue. Pour éviter tout accident ou blessure, ne retirez pas le couvercle de l’instrument en dévissant les boulons sur le côté. Notez que pendant le fonctionnement, les faisceaux laser sont complètement fermés, ne représentant aucune menace pour les utilisateurs. En outre, un verrouillage de sécurité magnétique est intégré dans le porte-échantillon de l’instrument pour empêcher les lasers de fonctionner lorsque le capuchon du porte-échantillon est retiré.
4. Placez la cuvette (à partir de l’étape 4.3) à l’intérieur de l’instrument dans la bonne orientation (voir Figure 5). Replacez le capuchon sur la cuvette et fermez le couvercle de l’instrument. Utilisez toujours l’instrument avec le capuchon en place sur le porte-échantillon. Ne désactivez pas et ne tentez pas de contourner la fonction de verrouillage de sécurité.

Figure 5: Orientation correcte de la cuvette dans l’instrument de suivi des particules. La face de la cuvette (avec l’encoche de l’insert visible) doit faire face à la caméra. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Allumez l’appareil photo en cliquant sur la flèche au-dessus de Streaming.
6. Cliquez sur la flèche en chevron pour développer les paramètres d’enregistrement. Réglez gain et puissance laser sur des valeurs appropriées pour l’application. Voir le tableau 1 (et la figure supplémentaire 1)pour les paramètres utilisés pour la NTA des petits véhicules électriques (100 nm).
   REMARQUE: Ces paramètres avancés accessibles en cliquant sur la flèche du chevron peuvent être protégés par mot de passe. Utilisez les mêmes paramètres pour l’enregistrement et le traitement du diluant (blanc) que ceux utilisés pour les échantillons suivants.
7. Ajustez la mise au point jusqu’à ce que les particules soient correctement focalées. La mise au point doit être faite sur des particules relativement petites (Figure 6). Pour la quantification des petits VE (compatible avec les exosomes), les paramètres d’enregistrement suivants sont recommandés : Fréquence d’images : 30 ips, Exposition : 15 ms, Temps d’agitation : 5 s, Temps d’attente : 3 s, Puissance laser - Bleu : 210 mW, Vert : 12 mW, Rouge : 8 mW, Images par vidéo : 300 images et Gain : 30 dB.
   REMARQUE: L’utilisateur peut augmenter le zoom à 1x et / ou augmenter le gain pour aider à la mise au point. N’oubliez pas de redéfinir ces paramètres sur les valeurs recommandées avant d’enregistrer des vidéos.

Figure 6: Vues représentatives en direct montrant la focalisation des particules. (A) Exemple de vue en direct des particules non focales. Les particules ont un halo semblable à une lueur ou semblent floues. Ajustez la mise au point. (B) Un exemple de vue en direct des particules dans la mise au point appropriée. Les plus petites particules sont au point. Commencez l’enregistrement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Effectuez un contrôle de qualité visuelle pour vous assurer que l’échantillon est correctement dilué. Si l’échantillon est trop concentré, retirez la cuvette de l’instrument et diluez l’échantillon séquentiellement. Répétez l’opération jusqu’à ce que l’échantillon soit correctement dilué avant de passer à l’étape 6.
   REMARQUE: Ne diluez pas trop l’échantillon! Faites toujours des dilutions séquentiellement. L’ébauche idéale n’affichera que quelques particules à l’écran (1-4) comme illustré à la figure 4. En ce qui concerne les échantillons EV, un échantillon correctement dilué aura environ 20 à 100 particules visibles à l’écran, sans images brillantes ou nuageuses en arrière-plan (voir la figure 7 à titre d’exemple). Cela devrait se traduire par une concentration optimale de particules comprise entre 5 x 10⁶ et 2 x 10⁸ particules par mL (sans ajustement pour le facteur de dilution).

Figure 7: Vues représentatives en direct illustrant différentes dilutions de particules. (A) Exemple de vue en direct d’un échantillon trop concentré. L’enregistrement d’un échantillon trop concentré donnera des résultats inexacts. (B) Exemple de vue en direct d’un échantillon correctement dilué. Il y a 60-100 particules visibles à l’écran et l’enregistrement donne une concentration brute de 5 x 10⁶- 2 x 10⁸ particules / mL. (C) Exemple de vue en direct d’un échantillon trop dilué. Si un échantillon est aussi dilué, il n’y aura pas assez de particules suivies, ce qui réduira la taille de l’échantillon et, par conséquent, les résultats seront statistiquement invalides. Dans ce cas, il est recommandé d’augmenter le nombre de vidéos enregistrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Acquisition de données vidéo

1. (Facultatif) Réglez le paramètre de zoom sur 0,5x pour économiser de la bande passante et éviter les images perdues.
2. Commencez à enregistrer les vidéos en cliquant sur Enregistrer (voir le tableau 1 pour les paramètres d’enregistrement recommandés).
   REMARQUE: Par défaut, l’instrument remue l’échantillon pendant 5 s, attend 3 s, puis enregistre pendant 10 s avant de répéter ce processus. Le temps de mesure typique pour 50 vidéos est d’environ 15 minutes à enregistrer et d’environ 13 minutes à traiter.
3. Ne touchez pas l’instrument lors de l’enregistrement de vidéos. Assurez-vous que la surface du banc de laboratoire ne vibre pas.
   REMARQUE: Il est préférable que l’instrument soit placé sur une plate-forme ou une table anti-vibration pour réduire les perturbations vibratoires provenant de l’équipement à proximité qui interféreront avec la détermination du mouvement des nanoparticules. Évitez de faire fonctionner des centrifugeuses, des mélangeurs de vortex ou d’autres dispositifs générateurs de vibrations potentiels sur le même banc que l’instrument de suivi des particules. Les vibrations sont facilement visibles à l’écran sous forme d’allongement de particules généralement rondes. S’il est exposé à de fortes vibrations, l’instrument peut nécessiter un réalignement des éléments optiques. L’instrument n’a pas été conçu pour être entretenu ou étalonné par le client; contactez le fabricant pour la maintenance, l’entretien et l’étalonnage.
4. Notez toute vidéo enregistrée qui a de très grosses particules visibles sous forme de grosses taches blanches irrégulières. Supprimez ces vidéos du traitement à l’étape 7.3.

7. Traiter les données acquises

1. Lorsqu’une invite s’affiche indiquant que des vidéos ont été enregistrées, cliquez sur OK pour terminer l’enregistrement. Sélectionnez ensuite l’onglet Processus.
   REMARQUE: Le protocole peut être arrêté ici. Le traitement des données acquises peut être redémarré ultérieurement en passant directement à l’onglet Processus après avoir ouvert le logiciel de l’instrument de suivi des particules et en spécifiant le répertoire dans lequel les vidéos enregistrées sont enregistrées.
2. Lors de l’analyse des véhicules électriques, cochez la case Désactiver le remplacement de la détection automatique et définissez le diamètre de la fonction sur 30. Cliquez sur Processus. (Voir le tableau 2 pour les paramètres de traitement et la figure supplémentaire 2 pour l’affichage du traitement). Un graphique de distribution en direct s’affichera afin que l’utilisateur puisse visualiser le traitement en temps réel.
   1. Pour les exosomes, traitez avec le seuil de détection défini sur l’échantillon polydispersépar défaut . Traitez les données avec le manuel de seuil de détection défini sur 0,8 au lieu d’un seuil standard de 0,99 uniquement pour les solutions présentant de très grandes différences de taille de particules.
3. Si des vidéos avaient visiblement de très grosses particules (voir l’étape 6.4), accédez au répertoire des vidéos enregistrées et supprimez la vidéo problématique. Après avoir modifié la liste des fichiers vidéo, modifiez le nombre de vidéos enregistrées dans d’autres journaux conservés par l’utilisateur.
4. Une fois le traitement terminé, cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez l’onglet Tracé. Pour les véhicules électriques, affichez le graphique principal sous la forme LogBinSilica.
   REMARQUE: Ici, dans l’onglet Tracé, l’utilisateur peut personnaliser d’autres fonctionnalités du graphique, telles que la définition de la plage de l’axe des x (diamètre des particules, nm) pour définir la zone d’intégration de la figure produite.

8. Afficher et interpréter les résultats

1. Pour créer un rapport PDF, cliquez sur le bouton Rapport. La mesure est maintenant terminée et les résultats peuvent être consultés.
   REMARQUE: N’oubliez pas d’enregistrer et de traiter d’abord le blanc afin que la concentration de fond des échantillons suivants puisse être corrigée. Si cette étape est oubliée, le blanc peut être enregistré après des échantillons et la concentration de particules de l’échantillon corrigée manuellement.
2. Examinez le rapport PDF qui affiche la taille moyenne, médiane et de mode ainsi que la concentration ajustée pour le facteur de dilution et corrigée en soustrayant la concentration de particules du diluant. La largeur de distribution (écart type) est également affichée.
   REMARQUE : Il existe très peu d’applications où une seule valeur est appropriée et représentative. Il est donc recommandé de décrire la distribution de taille entière et de déclarer la largeur de la distribution pour tout échantillon analysé (comme le montre le tableau 3 par exemple).
3. Enregistrez les paramètres d’instrument suivants utilisés pour générer les données qui doivent être indiquées lors de la communication des résultats : Diluant, Puissance laser de chaque laser [mW], Exposition [ms], Gain [dB], Fréquence d’images [fps], Images par vidéo, Nombre de vidéos enregistrées, Réglage de traitement (par exemple, LogBinSilica), Plage d’intégration [nm min, max nm] (recommandé de régler min à 50 nm) et Nombre de particules suivies (souhaitable pour analyser au moins ~ 150 particules par vidéo; minimum 3 750 pistes totales par échantillon recommandé d’éviter les pics artéfactuels dans la distribution granulométrique et de générer des données statistiquement significatives).

9. Nettoyage des cuvettes

1. Nettoyez les cuvettes manuellement entre les échantillons. Tout d’abord, videz la cuvette.
   REMARQUE: L’échantillon peut être récupéré à partir de la cuvette et enregistré ou jeté.
2. Une fois la cuvette vide, nettoyez la cuvette en la rinçant 10 à 15 fois avec de l’eau désionisée (DI). Ensuite, rincez 3 fois avec de l’éthanol (70-100%). Ce faisant, assurez-vous de remplir complètement la cuvette avec du solvant.
3. Séchez l’extérieur de la cuvette avec un chiffon en microfibre non pelucheux. Évitez les taches sur les surfaces. Sécher à l’air libre l’intérieur de la cuvette ou sécher à l’aide d’un filtre à air comprimé.
   REMARQUE: Seul le papier de nettoyage des lentilles ou le chiffon en microfibre non pelucheux doit être utilisé pour essuyer les surfaces optiques de la cuvette, car la plupart des produits en papier contiennent de petites fibres de bois qui peuvent rayer ou endommager la surface de la cuvette.
4. Préparez deux flacons de scintillation en verre: l’un rempli de 70 à 100% d’éthanol et l’autre d’eau DI. Rincez d’abord les inserts et les barres d’agitation dans l’éthanol (puis l’eau DI) en plaçant l’insert/la barre de remuage dans le flacon de scintillation approprié et en agitant vigoureusement le flacon. Séchez les inserts et remuez les barres à l’aide de chiffons non pelucheux ou de dusters à air comprimé.
   REMARQUE: La cuvette et l’insert peuvent également être nettoyés à l’aide d’un bain-marie sonique. Pour ce faire, assurez-vous d’abord que l’unité de sonication contient suffisamment d’eau (au moins 5 cm de profondeur). Placez ensuite la cuvette et insérez-la à l’intérieur d’un bécher en verre (50 mL ou plus), remplissez le bécher d’alcool au même niveau que le bain-marie, placez le bécher dans l’eau et allumez l’alimentation. Sonicate pendant un maximum de 5 minutes à la fois, permettant à la machine de reposer >5 minutes entre chaque rafale de 5 minutes si des temps plus longs sont nécessaires.
5. Une fois terminé, rangez immédiatement tous les composants nettoyés et séchés pour les stocker.

Results

Avant cette démonstration, l’étalonnage de l’instrument a d’abord été testé pour s’assurer de la validité des données acquises en mesurant la distribution granulométrique des étalons de billes de polystyrène. Nous avons testé la distribution de taille des billes de 100 nm et 400 nm en utilisant les paramètres d’enregistrement par défaut et les paramètres de traitement recommandés dans ce protocole (Figure 8).

Pour l’étalon de billes de polystyrène de 100 nm, une c...

Discussion

Ici, nous démontrons un protocole pour la NTA des VE pour mesurer simultanément la distribution granulométrique d’une large gamme de tailles de particules et mesurer la concentration totale de VE dans un échantillon polydispersé. Dans cette étude, le tissu adipeux périgornadique de souris et le plasma humain ont été utilisés comme source de VE. Cependant, les VE isolés d’autres tissus ou liquides biologiques tels que le sérum, l’urine, la salive, le lait maternel, le liquide amniotique et le surnageant de culture cellula...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X dPBS	VWR	02-0119-1000	Pour diluer des échantillons
Étalon de billes de 100 nm	Thermo Scientific	3100A	Pour tester l’étalonnage du ViewSizer 3000
Étalon de billes de 400 nm	Thermo Scientific	3400A	Pour tester l’étalonnage du ViewSizer 3000
Unité de filtration centrifuge	Amicon	UFC901024	Pour filtrer le diluant PBS
Tubes de collecte, 2 mL	Qiagen	19201	Pour l’isolement du plasma humain : vésicules extracellulaires
Dépoussiéreur à air comprimé	DustOff	DPSJB-12	Pour nettoyer les cuvettes
Insert de cuvette	HORIBA	Scientific-Fourni	à l’achat de ViewSizer 3000
Gabarit de cuvette	HORIBA	Scientific-Pour	aligner la barre d’agitation magnétique tout en plaçant les inserts à l’intérieur de la cuvette ; Fourni à l’achat de ViewSizer 3000
Eau désionisée	VWR	02-0201-1000	Pour nettoyer les cuvettes
Ordinateur de bureau avec moniteur, clavier, souris et tous les câbles nécessaires		Dell-Fourni	à l’achat de ViewSizer 3000
Éthanol (70-100 %)	Millipore Sigma-Pour		nettoyer les cuvettes
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	Pour l’isolement du plasma humain : vésicules extracellulaires
Flacons à scintillation en verre avec couvercles	Thermo Scientific	B780020	Pour nettoyer les cuvettesOutil
« Crochet »	Excelta-Fourni		à l’achat de ViewSizer 3000
Chiffon en microfibre non pelucheux	Texwipe	TX629	Pour nettoyer les cuvettes et couvrir le plan de travail
Tubes à microcentrifuger, 2 mL	Eppendorf	22363344	Pour l’isolement des vésicules extracellulaires du plasma humain Barre d’agitation
	Sp Scienceware	F37119-0005
Suprasil Cuvette en quartz avec capuchon	Agilent Technologies	AG1000-0544	Initialement fourni à l’achat de ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA	Scientific-Instrument	suivi des nanoparticules