Génération d’organoïdes pulmonaires entiers 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites pour la modélisation de la biologie et de la maladie du développement pulmonaire

Le poumon est un organe compliqué, hétérogène et dynamique qui se développe en six stades distincts - maturation embryonnaire, pseudoglandulaire, canaliculaire, sacculaire, alvéolaire et microvasculaire1,2. Les deux dernières phases se produisent avant et après la naissance dans le développement humain, tandis que les quatre premières étapes se produisent exclusivement pendant le développement du fœtus, à moins qu’une naissance prématurée ne se ^produise3. La phase embryonnaire commence dans la couche germinale endodermique et se termine par le bourgeonnement de la trachée et des bourgeons pulmonaires. Le développement pulmonaire se produit en partie par signalisation entre les cellules épithéliales et mésenchymateuses4. Ces interactions entraînent la ramification pulmonaire, la prolifération, la détermination du devenir cellulaire et la différenciation cellulaire du poumon en développement. Le poumon est divisé en zones conductrices (trachée aux bronchioles terminales) et zones respiratoires (bronchioles respiratoires aux alvéoles). Chaque zone contient des types uniques de cellules épithéliales; y compris les cellules basales, sécrétoires, ciliées, de brosse, neuroendocrines et ionocytaires dans les voies respiratoires ^{conductrices5}, suivies des cellules alvéolaires de type I et II dans l’épithélium ^{respiratoire6}. On ignore encore beaucoup de choses sur le développement et la réponse aux blessures des différents types de cellules. Les modèles d’organoïdes pulmonaires dérivés de la CSPi permettent d’étudier les mécanismes qui stimulent le développement pulmonaire humain, les effets des mutations génétiques sur la fonction pulmonaire et la réponse de l’épithélium et du mésenchyme aux agents infectieux sans avoir besoin de tissu pulmonaire humain primaire.

Les marqueurs correspondant aux différents stades de la différenciation embryonnaire comprennent CXCR4, cKit, FOXA2 et SOX17 pour l’endoderme définitif (DE)⁷, FOXA2, TBX1 et SOX2 pour l’endoderme antérieur de l’intestin antérieur (AFE)⁸, et NKX2-1 pour les cellules progénitrices pulmonaires ^précoces9. Dans le développement pulmonaire embryonnaire, l’intestin antérieur se divise en œsophage dorsal et trachée ventrale. Les bourgeons des poumons droit et gauche apparaissent comme deux outpouchings indépendants autour du bourgeon ^trachéal10. Au cours de la morphogenèse ramifiée, le mésenchyme entourant l’épithélium produit du tissu élastique, du muscle lisse, du cartilage et du système ^vasculaire11. L’interaction entre l’épithélium et le mésenchyme est essentielle au développement normal des poumons. Cela inclut la sécrétion de ^FGF1012 par le mésenchyme et de ^SHH13 produit par l’épithélium.

Ici, nous décrivons un protocole pour la différenciation dirigée des hiPSC en organoïdes pulmonaires entiers (WLO) tridimensionnels (3D). Bien qu’il existe des approches similaires qui intègrent l’isolement des cellules progénitrices pulmonaires par tri au stade LPC pour fabriquer des organoïdes ^{alvéolaires14,15} (distaux) ou des organoïdes des voies ^{respiratoires16} (proximaux), ou génèrent des sphéroïdes ventraux-antérieurs de l’intestin antérieur pour fabriquer des organoïdes pulmonaires humains exprimant des marqueurs alvéolaires et mésenchymateux et des organoïdes progénitrices de la pointe des ^bourgeons17 , la force de cette méthode est l’inclusion des deux types de cellules épithéliales et mésenchymateuses pulmonaires pour modéliser et orchestrer la morphogenèse, la maturation et l’expansion des ramifications pulmonaires in vitro.

Ce protocole utilise de petites molécules et des facteurs de croissance pour diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes à travers l’endoderme définitif, l’endoderme de l’intestin antérieur et les cellules progénitrices pulmonaires. Ces cellules sont ensuite induites en organoïdes pulmonaires entiers 3D à travers des étapes de développement importantes, y compris la ramification et la maturation. Le résumé du protocole de différenciation est illustré à la figure 1a avec des images représentatives en champ clair de la différenciation endodermique et organoïde illustrées à la figure 1b. La figure 1c,d montre les détails de l’expression génique de la différenciation endodermique ainsi que l’expression génique des populations proximales et distales des cellules épithéliales pulmonaires après avoir terminé la différenciation.

Ce protocole d’étude a été approuvé par l’Institutional Review Board du Human Research Protections Program de l’UCSD (181180).

1. Induction définitive de l’endoderme à partir de cellules souches pluripotentes induites (Jour 1 - 3)

1. Décongeler lentement le facteur de croissance réduit (DFG)-milieu de la matrice de membrane basale (BM) sur la glace 30 minutes avant l’utilisation. Dans le mélange DMEM/F12 froid, diluer le milieu de matrice GFR BM 1:1 de telle sorte qu’il constitue 50% de ce milieu. Placez les embouts de pipette P1000 au congélateur pour les refroidir avant utilisation.
2. Recouvrir chaque puits d’une plaque de 12 puits avec 500 μL de milieu de matrice de membrane basale GFR à 50 % préparé dans du DMEM/F12 glacé. Une fois que le nombre souhaité de puits est revêtu, retirez tout excès de mélange de milieu et/ou de bulles des puits et placez la plaque sur de la glace ou un réfrigérateur à 4 °C pendant 20 min pour fixer. Ensuite, déplacez la plaque vers l’incubateur à 37 °C pendant la nuit pour geler et sécher.
3. Une fois que les hiPSC atteignent 70 à 90 % de confluence, ajoutez 10 μM d’inhibiteur de la kinase rho-associée (ROCK) Y-27632 une heure avant la dissociation. Aspirer le milieu et laver une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Dissocier les cSH en ajoutant un milieu de détachement cellulaire (0,5 mL/puits d’une plaque de 12 puits) et incuber pendant 20 min à 37 °C dans un incubateur à _CO2 à 5 %.
4. Retirer les plaques de l’incubateur et ajouter 0,5 mL/12 puits de milieu de passage des cellules souches (tableau 1) aux puits; triturez doucement les cellules à l’aide d’une pointe P1000 pour obtenir une suspension unicellulaire. Transférer des cellules dissociées dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL; centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
5. Aspirer le milieu et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu mTeSR Plus complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM (Y-27632). Effectuez un comptage de cellules. Ajouter 2,0 x ¹⁰⁵ hiPSC dans 1 mL de mTeSR complété par un inhibiteur de ROCK Y-27632 par puits d’une plaque enduite de milieu de membrane basale GFR de 12 puits. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
   REMARQUE: Le nombre de semis de cellules doit être optimisé par lignée cellulaire. 24 h après le placage, les puits doivent être confluents à 50% à 70%.
6. Le jour 1, aspirez le mTeSR Plus et ajoutez le milieu d’induction de l’endoderme définitif (DE) (tableau 1) complété par 100 ng/mL d’activine A humaine et 5 μM d’inhibiteur de GSK3β/activateur Wnt CHIR99021.
   REMARQUE: Les milieux DE avec inhibiteur de GSK3β / activateur Wnt CHIR99021 doivent être retirés dans les 20 à 24 heures suivant le jour 1 de l’induction DE pour une différenciation réussie.
7. Le jour 2 et le jour 3, passez au milieu d’induction DE complété par 100 ng / mL d’activine A uniquement.
   REMARQUE: La différenciation DE ne doit pas dépasser un total de 72 h, sinon l’efficacité diminuera. Le jour 4, si l’on observe une mort cellulaire importante, diminuer le temps total d’exposition au milieu DE de 6 à 12 h.
8. Pour analyser l’efficacité du DE, confirmer une expression supérieure à 90 % de CXCR4 et/ou de cKit par cytométrie en flux ou immunofluorescence de FOXA2 et/ou SOX17 (Figure 2a).

2. Induction de l’endoderme de l’intestin antérieur (AFE) (Jour 4 - 6)

1. Le jour 4, changer le milieu en milieu basal libre sérique (SFBM) (tableau 1) complété par 10 μM SB431542 et 2 μM dorsomorphine pour l’induction de l’AFE. Changez de média AFE tous les jours pendant 3 jours (jour 4, jour 5 et jour 6).
2. Pour analyser l’efficacité de l’AFE, confirmez l’expression robuste de SOX2, TBX1 et FOXA2 par coloration par immunofluorescence (Figure 2b).

3. Différenciation des cellules progénitrices pulmonaires (LPC) (Jour 7 - 16)

1. Le jour 7, décongeler le milieu de la matrice de membrane basale GFR sur la glace. Aspirer le support AFE et bien laver avec 1x PBS. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire et incuber pendant 10 min à 37 °C.
2. Ajouter 1 mL de milieu de trempe (2 % de FBS dans le DMEM/F12) aux puits contenant une solution de détachement cellulaire. Gardez les cellules sous forme d’agrégats en pipetant doucement de haut en bas. Assurez-vous que toutes les cellules sont délogées et transférées dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. Centrifuger pendant 5 min à 300 x g.
3. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de trempe complété par 10 ng/mL de protéine morphogénique osseuse recombinante humaine 4 (BMP4), 0,1 μM d’acide rétinoïque tout trans (PR), 3 μM d’inhibiteur de GSK3β/activateur Wnt CHIR99021 et 10 μM d’inhibiteur de roche Y-27632.
4. Effectuez un comptage de cellules. Ajouter 2,5 x ¹⁰⁵ cellules à 100 μL de milieu de matrice de membrane basale GFR froid, bien mélanger et placer la gouttelette dans un puits d’une plaque de 12 puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 à 60 min pour permettre au milieu de polymériser. Ajouter 1 mL de milieu LPC complété par 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632 par puits en veillant à ce que la goutte moyenne soit complètement immergée et incuber à 37 °C pendant la nuit.
5. Le jour 8, 24 h après l’induction du LPC, changez le milieu du LPC pour éliminer l’inhibiteur de ROCK Y-27632. Changez le support LPC tous les deux jours pour un total de 9 à 11 jours.
   REMARQUE: Si le milieu devient jaune dans les 24 heures, changez de milieu tous les jours.
6. Pour analyser l’efficacité du LPC, confirmer l’expression robuste du facteur de transcription intracellulaire NKX2-1 ou effectuer une cytométrie en flux pour les marqueurs de surface CD47hi/CD26low15 ou ^CPM18 (Figure 2c). En gros, les sphéroïdes LPC doivent être ronds et transparents (Figure 2c).
   REMARQUE: Ne procédez pas à la différenciation organoïde pulmonaire si l’efficacité de NKX2-1 est inférieure à 30%.

4.3D induction organoïde pulmonaire (Jour 16 - 22)

1. Le jour 17, décongeler le milieu de la matrice de la membrane basale GFR sur la glace. Aspirer le milieu d’induction LPC. Ajouter ensuite 2 μg/mL de dispase (1 mL) au puits et remettre en suspension le mélange milieu/dispase avec une pipette P1000. Incuber à 37 °C pendant 15 min. Triturer à nouveau le mélange et incuber à 37 °C pendant encore 15 min.
2. Transférer la dispase et les cellules dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. Utilisez du PBS réfrigéré (2-3 ml) pour laver le puits et remettre en suspension le mélange dispase/cellule. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g. Retirez manuellement le surnageant, en prenant soin de ne pas désenduire la couche de granulés de milieu / cellule. Répétez le lavage PBS réfrigéré et centrifugez le tube de centrifugeuse conique pendant encore 5 minutes à 400 x g.
3. Retirez manuellement le surnageant, puis ajoutez 2 mL de solution de dissociation à base de trypsine au tube de centrifugeuse conique. Incuber à 37 °C pendant 12 min.
4. Après l’incubation, remettez en suspension les cellules avec une pointe de pipette P1000. Ajoutez ensuite un volume égal de milieu de trempe au tube de centrifugeuse conique et faites tourner vers le bas à 400 x g pendant 5 min. Aspirer les cellules surnageantes et les remettre en suspension dans un milieu de trempe + 10 μM de l’inhibiteur de ROCK Y-27632.
   REMARQUE: L’induction réussie des organoïdes pulmonaires se produit lorsque les cellules sont incorporées sous forme d’agrégats, et non de cellules individuelles, ajustant le pipetage en conséquence.
5. Effectuez un comptage de cellules. Calculer le volume nécessaire pour obtenir 5,0-8,0 x ¹⁰⁴ cellules par puits. Aliquoter les agrégats de la cellule LPC en tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger pendant 5 min à 400 x g. Enlevez l’excès de surnageant, en prenant soin de ne pas agiter la pastille cellulaire. Ne laisser que 10 μL de milieu résiduel.
6. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de milieu de matrice de membrane basale GFR froid et ajoutez-la aux inserts de membrane de culture cellulaire (6,5 mm de diamètre, pore de 0,4 μm, membrane de polyester). Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 à 60 min pour permettre au milieu de la matrice de la membrane basale GFR de polymériser.
7. Ajouter 1 mL de milieu d’induction organoïde 3D (tableau 1) complété par le facteur de croissance des fibroblastes-7 (FGF7) (10 ng/mL), le FGF10 (10 ng/mL), l’inhibiteur GSK3β/activateur Wnt CHIR (3 μM), le facteur de croissance épidermique (EGF) (10 ng/mL) et 10 μM d’inhibiteur de ROCK Y-27632 à la chambre basolatérale de l’insert membranaire. Changez le support tous les deux jours pendant 6 jours.

5.3D Ramification organoïde pulmonaire (Jour 23 - 28)

1. Le jour 23, le passage au milieu ramifié 3D (tableau 1) est complété par FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), inhibiteur de GSK3β/activateur Wnt CHIR99021 (3 μM), PR (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) et facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) / facteur de croissance placentaire (PlGF) (10 ng/mL). Changez le support tous les deux jours pendant 6 jours.
   REMARQUE: Au jour 6 de la différenciation des ramifications 3D, il devrait y avoir plusieurs organoïdes ramifiés (Figure 2).

6.3D maturation organoïde pulmonaire (Jour 29 - 34)

1. Le jour 29, passer au milieu de maturation 3D (tableau 1), qui est le même que le milieu ramifié 3D, mais avec l’ajout de dexaméthasone (50 nM), d’AMPc (100 μM) et de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), un inhibiteur de la phosphodiestérase également appelé isobutylxanthine (100 μM). Changez le support tous les deux jours pendant 6 jours.
   REMARQUE: Dans les 24 heures suivant la maturation 3D, les organoïdes ramifiés devraient se dilater et se transformer en sphères transparentes.

7.3D Immunocytochimie organoïde pulmonaire

1. Pour l’analyse 3D des organoïdes pulmonaires entiers, fixez le milieu de la matrice de la membrane basale GFR dans les inserts membranaires avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 1 h à 4 °C. Intégrer dans de la cire de paraffine et monter sur des diapositives selon les protocoles standard publiés.
2. Effectuer la récupération de l’antigène avant la coloration. Les marqueurs des voies respiratoires comprennent KRT5, MUC5AC et SCGB3A2. Les marqueurs alvéolaires comprennent SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 et HOPX (Figure 3).

8. Retrait d’organoïdes pulmonaires entiers du milieu de la matrice de la membrane basale DU DFG pour le passage, le FACS ou la cryoconservation

1. Pour dissocier les organoïdes du milieu de la matrice de la membrane basale GFR, retirez le milieu de la chambre basale et ajoutez 2 μg/mL de dispase (1 mL) dans la chambre apicale.
2. Triturez délicatement le mélange milieu/dispase avec une pipette P1000 et placez-le dans l’incubateur pendant 15 min. Triturez doucement le mélange à nouveau et incubez pendant encore 15 min.
3. Ajouter 1 mL de PBS réfrigéré (4 °C) et transférer les organoïdes avec le milieu matriciel dans un tube de centrifugeuse conique de 15 mL. Tourner à 400 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant pour ne pas déranger la pastille cellulaire.
4. Laver une fois de plus avec 1 mL de PBS réfrigéré et tourner à 400 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant pour ne pas perturber le mélange milieu/cellule.
5. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire au tube de centrifugeuse conique, rallumer doucement le mélange de matrice de membrane GFR-Basal/ cellule. Placer dans l’incubateur pendant 12 min pour les cellules de passage sous forme d’agrégats ou pour la cryoconservation), ou 20 min pour la suspension monocellulaire.
6. Ajouter un volume égal de support de trempe et tourner vers le bas à 400 x g pendant 5 min. Remise en suspension dans un milieu de trempe + 10 μM de l’inhibiteur de ROCK Y-27632.
   REMARQUE: À cette étape, aucun milieu résiduel de la membrane basale ne doit être vu dans le tube. S’il reste du milieu résiduel, répétez les étapes 8.5 et 8.6.
7. Effectuez un comptage de cellules. Calculez le volume nécessaire pour les applications en aval.

24 heures après le placage, jour 1, les CSPi doivent être confluents à 50% à 90%. Le jour 2, DE devrait être confluent à 90% à 95%. Au cours de l’induction de DE, il est courant d’observer une mort cellulaire importante au jour 4, mais les cellules attachées conserveront une morphologie pavée compacte (Figure 2b). Arrêter la différenciation si la majorité des cellules adhérentes se détachent et envisager de raccourcir l’exposition aux milieux DE avec l’activine A de 6 à 12 h. Pendant l’induction de l’AFE, la mort cellulaire est minime et les cellules restent adhérentes, mais apparaîtront plus petites et plus hétérogènes. Le passage des cellules au jour 7 ne doit être effectué que si le rendement de SOX2 et FOXA2 double positif est de >80%. Après avoir passé dans la matrice de la membrane basale pour l’induction LPC 3D, de petits sphéroïdes apparaîtront d’abord, puis se développeront et certains peuvent commencer à se ramifier. Les profils d’expression génique pour une différenciation endodermique réussie comprennent une augmentation de SOX17 à DE, une augmentation de FOXA2 et SOX2 avec une diminution de SOX17 et la première apparition de NKX2-1, et une augmentation de NKX2-1, ainsi que la présence de SOX2 et FOXA2. Conformément au développement embryonnaire précoce, la ventralisation de l’AFE se produit pour le développement des bourgeons pulmonaires (NKX2-1+) et la dorsalisation de l’AFE se produit pour le développement gastro-intestinal (SOX2+). Les cultures au LPC auront un mélange de progéniteurs pulmonaires et gastriques.

L’induction organoïde pulmonaire à partir de LPC a été réalisée en utilisant diverses méthodes. Certains groupes trient les cellules à l’aide de rapporteurs fluorescents NKX2-1 ou d’un proxy d’antigène de surface (CPM, CD26lowCD47high). Mais ces organoïdes pulmonaires contiennent des cellules alvéolaires de type II sans cellules alvéolaires de type I ni mésenchyme. D’autres groupes ont recueilli des amas de cellules qui bourgeonnent sur la monocouche AFE/LPC et les ont incorporés dans la matrice de la membrane basale. Ces organoïdes contiennent une population mixte de cellules épithéliales et mésenchymateuses pulmonaires, mais il faut des mois pour les mettre en culture19. Notre protocole inclut à la fois la présence de cellules épithéliales et mésenchymateuses. Les WHO expriment les marqueurs cellulaires épithéliaux proximaux p63 et KRT5 (cellules basales) et SCGB3A2 (cellules club) ainsi que les marqueurs cellulaires épithéliaux distaux HOPX (ATI) et proSPC, SPB et NKX2-1 (ATII). Ils expriment également le marqueur mésenchymateux Vimentin au stade LPC, ainsi que dans l’ensemble des organoïdes pulmonaires. PDGFRα est un marqueur pour les fibroblastes qui ont une fonction importante dans le poumon pendant la sacculation et l’alvéolarisation20 et est co-exprimé avec le facteur de transcription important dans la différenciation des cellules distales, SOX9 (Figure 3).

Notre méthode génère efficacement des cultures LPC 3D exprimant NKX2-1 en utilisant des molécules de signalisation qui se produisent dans le développement pulmonaire fœtal pour former des organoïdes pulmonaires précoces. Lors du passage des LPC dans un milieu de matrice membranaire basale GFR pour l’induction organoïde pulmonaire, il est impératif de ne pas trop se dissocier en une suspension à cellule unique, mais plutôt de conserver de petits amas de cellules (10 cellules / amas). Le comptage cellulaire ne sera pas complètement précis, mais toujours nécessaire pour éviter une confluence excessive pendant la différenciation organoïde pulmonaire de 3 semaines.

L’induction organoïde pulmonaire devrait donner de petits organoïdes ramifiés au jour 6 de l’induction (jour 23 de la différenciation). Ceux-ci devraient continuer à croître pendant l’étape de ramification organoïde et l’étape de maturation. Vingt-quatre heures après l’introduction de la dexaméthasone, de l’AMPc et de l’IBMX, les branches devraient s’étendre dans des sphères transparentes. L’analyse des organoïdes pulmonaires entiers peut être effectuée à la fin de la différenciation, ou les WHO peuvent être passés dans une matrice de membrane basale fraîche avec DFG ou cryoconservés par congélation dans 10% de DMSO.

Figure 1: Schéma global de la différenciation des organoïdes pulmonaires entiers (WLO) à partir des hiPSC et des données représentatives. (a) Schéma de la différenciation WLO des hiPSC. Les cercles représentent le type de cellule endodermique avec des marqueurs d’identification. La chronologie de la différenciation est indiquée dans des barres noires. Facteurs de croissance et/ou petites molécules pour l’induction de populations organoïdes endodermiques et pulmonaires. En résumé, les cellules souches sont différenciées en endoderme définitif, en endoderme de l’intestin antérieur et en cellules progénitrices pulmonaires en environ 16 jours. Ces cellules sont ensuite passées dans un milieu de matrice membranaire basale GFR contenant des inserts de milieu et subissent une induction, une ramification et une maturation organoïdes pulmonaires. La différenciation totale prend environ 35 jours. b) Images représentatives en phase contrastée des cellules aux principaux stades endodermiques et images 3D d’organoïdes pulmonaires entiers. Taille de la barre d’échelle comme indiqué dans le panneau. c) analyse qRT-PCR des marqueurs du développement pulmonaire au cours de l’endoderme et d) différenciation organoïde pulmonaire entière des marqueurs cellulaires proximaux et distaux. Toutes les données représentent en moyenne 3 à 5 réplications biologiques. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne et sont normalisées en actine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Caractérisation de la différenciation des endodermes par cytométrie en flux et immunocytochimie. (a) Cytométrie en flux du marqueur endodermique définitif CXCR4. Le panneau de gauche montre la barrière contre la population non tachée tandis que le panneau du milieu montre la population positive CXCR4. Le panneau de droite montre l’image immunocytochimique de SOX17 (rouge) recouverte de noyaux (bleu). (b) Image immunocytochimique des marqueurs AFE FOXA2 et SOX2 superposés avec des noyaux (bleu). c) Expression endogène de NKX2-1-GFP dans une lignée cellulaire rapporteure en LPC 3D. Images prises à partir d’une culture de cellules vivantes en champ clair et GFP. Cytométrie en flux du marqueur intracellulaire du progéniteur pulmonaire NKX2-1 après fixation et perméabilisation. Taille de la barre d’échelle = 50 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation d’organoïdes pulmonaires entiers 3D après 3 semaines de différenciation par immunocytochimie. (a) Marqueurs pulmonaires proximaux. Le panneau de gauche montre SOX2 (blanc) et SOX9 (rouge) superposés par des noyaux (bleu). Ces marqueurs sont importants dans la morphogenèse ramifiée et représentent les populations épithéliales proximales et distales. Les panneaux du milieu montrent P63 (rouge) et KRT5 (rouge), deux marqueurs des cellules basales. Le panneau de droite montre SCGB3A2, un marqueur de cellules de club. b) Marqueurs pulmonaires distaux. Le panneau de gauche représente des marqueurs pro-SPC (PSPC) (vert) et HOPX (rouge), des marqueurs de cellules alvéolaires de type II et I, respectivement, recouverts de noyaux (bleu). Le panneau du milieu montre des marqueurs pro-SPC (PSPC) (vert) et SPB (rouge), des cellules alvéolaires de type II, recouvertes de noyaux (bleu). Le panneau de droite montre NKX2-1 (rouge) et ZO1 (vert) recouverts de noyaux (bleu). c) Marqueurs du mésenchyme pulmonaire. Le panneau de gauche montre PDGFRA (rouge) et SOX9 (blanc), représentant le mésenchyme distal. Le panneau de droite montre Vimentin (rouge), qui est dispersé dans tout le poumon. Taille de la barre d’échelle = 50 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1 : Tableau des médias.

Tableau 2 : Dépannage.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.