Nous présentons ici un protocole pour analyser l’ultrastructure des mégacaryocytes in situ en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM). Les moelles osseuses murines sont collectées, fixées, incorporées dans de la résine époxy et coupées en sections ultraminces. Après coloration par contraste, la moelle osseuse est observée au microscope TEM à 120 kV.
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Article de méthode
In situ Exploration de la mégacaryopoïèse murine à l’aide de la microscopie électronique à transmission
Dans cet article
Résumé
Résumé
La différenciation et la maturation des mégacaryocytes se produisent en étroite association avec les composants cellulaires et extracellulaires de la moelle osseuse. Ces processus sont caractérisés par l’apparition progressive de structures essentielles dans le cytoplasme mégacaryocytaire telles qu’un noyau polyploïde et polylobulé, un réseau membranaire interne appelé système membranaire de démarcation (DMS) et les granules denses et alpha que l’on trouvera dans les plaquettes circulantes. Dans cet article, nous décrivons un protocole standardisé pour l’étude ultrastructurale in situ des mégacaryocytes murins à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM), permettant l’identification de caractéristiques clés définissant leur stade de maturation et leur densité cellulaire dans la moelle osseuse. Les moelles osseuses sont rincées, fixées, déshydratées dans de l’éthanol, incorporées dans de la résine plastique et montées pour générer des sections transversales. Des sections semi-minces et minces sont préparées pour les observations histologiques et TEM, respectivement. Cette méthode peut être utilisée pour n’importe quelle cellule de moelle osseuse, dans n’importe quelle installation EM et présente l’avantage d’utiliser de petites tailles d’échantillons permettant la combinaison de plusieurs approches d’imagerie sur la même souris.
Introduction
Les mégacaryocytes sont de grandes cellules polyploïdes spécialisées, localisées dans la moelle osseuse, responsables de la production deplaquettes 1. Ils proviennent de cellules souches hématopoïétiques par un processus de maturation complexe, au cours duquel les précurseurs de mégacaryocytes augmentent progressivement en taille, tout en subissant d’importants changements morphologiques concomitants dans le cytoplasme et le noyau2. Au cours de la maturation, les mégacaryocytes développent un certain nombre d’éléments structurels distincts, notamment: un noyau polylobulé, des invaginations de la membrane de surface qui f....
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Protocole
Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux normes européennes 2010/63/UE et au Comité CREMEAS d’Éthique de l’Expérimentation Animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg). Le protocole est schématiquement illustré à la figure 1.
1. Collecte et fixation de la moelle osseuse ( Figure 1A)
ATTENTION: Cette procédure comprend des substances cancérigènes, mutagènes et / ou toxiques et est effectuée sous une hotte d’extraction chimique. Portez un équipement de protect....
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Résultats
Histologie de la moelle osseuse
L’observation de l’histologie bleue de la toluidine de la moelle osseuse au microscope optique est essentielle pour analyser rapidement l’architecture tissulaire globale en termes de compacité tissulaire, de continuité des microveux, ainsi que de taille et de forme des mégacaryocytes (Figure 1D). Il est effectué avant les sections ultraminces pour déterminer la nécessité de couper plus profondément dans le bloc de moelle os.......
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Discussion
L’examen direct des mégacaryocytes dans leur environnement natif est essentiel pour comprendre la mégacaryopoïèse et la formation de plaquettes. Dans ce manuscrit, nous fournissons une méthode de microscopie électronique à transmission combinant le rinçage de la moelle osseuse et la fixation par immersion, permettant de disséquer in situ les caractéristiques morphologiques de l’ensemble du processus de morphogenèse des mégacaryocytes se déroulant dans la moelle osseuse.
Le rinçage de .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), l’Union Européenne à travers le Fonds Européen de Développement Régional (FEDER) et par la Subvention ANR-17-CE14-0001-01 à H.d.S.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-Tri(diméthylaminométhyl)phénol (DMP-30) | Ladd Research Industries, États-Unis | 21310 | |
| Type d’agarose LM-3 à faible point de fusion Agar | Electron Microscopy Sciences, | États-Unis 1670-B | |
| CaCl2 Chlorure de calcium hexahydraté | Merck, Allemagne | 2083 | |
| Grilles de cuivre 200 mailles à barre mince | Oxford Instrument, Agar Scientifics, Angleterre | T200-CU | |
| Sel de sodium trihydraté d’acide diméthylarsinique | Merck, Allemagne | 8.20670.0250 | |
| Anhydride dodécénylsuccinique (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Lame de rasoir en acier inoxydable à double tranchant | Microscopie électronique Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Absolut d’éthanol | VWR International, France | 20821296 | |
| Filtre papier, diamètre 90 mm | Whatman, Angleterre | 512-0326 | |
| Moule en silicone à encastrement plat | Oxford Instrument, Agar Scientific, Angleterre | G3533 | |
| Glutaraldéhyde 25 % | Microscopie électronique Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Plaque chauffante Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Autriche | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° ; | Diatomée, Suisse | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus Microscope TEM | JEOL, Japon | EM-21001BU | |
| Citrate de plomb - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Autriche | 70 55 30 22 | |
| LX-112 résine | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Chlorure de magnésium hexahydraté | Sigma, France | M2393-100g | |
| Support de montage - Poly(méthacrylate de butyle-méthacrylate de co-méthyle) | Microscopie électronique Sciences-EMS, États-Unis | 15320 | |
| Anhydride de méthyle nadique (NMA) | Ladd Research Industries, États-Unis | 21350 | |
| Tétroxyde d’osmium 2 % | Merck, Allemagne | 19172 | |
| Oxyde de propylène (1.2-époxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Solution injectable saline 0.9 % NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Lame en acier chirurgical | Swann-Morton, | Angleterre.0508 | |
| Tétraborate de sodium - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Saccharose | Merck, Allemagne | 84100-1KG | |
| Filtre à seringue 0.2µ ; m | Pall Corporation, États-Unis | 514-4126 | |
| Bleu toluidine | Ladd Research Industries, États-Unis | N10-70975 | |
| Tondeuse EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Autriche | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Autriche | 656201 | |
| Acétate d’uranyle | Ladd Research Industries, États-Unis | 23620 |
Références
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C.
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Réimpressions et autorisations
