Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

Quentin Kimmerlin; Manuela Tavian; Christian Gachet; François Lanza; Nathalie Brouard

doi:10.3791/62498

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Article de méthode

Isolement des progéniteurs mégacarytaires de souris

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DOI :

10.3791/62498

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20 mai 2021

Quentin Kimmerlin¹ , Manuela Tavian² , Christian Gachet¹ , François Lanza¹ , Nathalie Brouard¹

¹Université de Strasbourg, INSERM UMR S1255, EFS Grand-EST, ²UMR-S1113 –IRFAC, Université de Strasbourg

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Résumé

Cette méthode décrit la purification par cytométrie en flux de MEP et de MKp à partir de fémurs, de tibias et d’os pelviens de souris.

Résumé

Les mégacaryocytes de la moelle osseuse sont de grandes cellules polyploïdes qui assurent la production de plaquettes sanguines. Ils proviennent de cellules souches hématopoïétiques par le biais de la mégacaryopoïèse. Les dernières étapes de ce processus sont complexes et impliquent classiquement les progéniteurs bipotents mégacaryocytes-érythrocytaires (MEP) et les progéniteurs mégacaryocytaires unipotents (MKp). Ces populations précèdent la formation de mégacaryocytes de bonne foi et, à ce titre, leur isolement et leur caractérisation pourraient permettre une analyse robuste et impartiale de la formation de mégacaryocytes. Ce protocole présente en détail la procédure de collecte des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris, l’enrichissement des progéniteurs hématopoïétiques par épuisement magnétique et enfin une stratégie de tri cellulaire qui donne des populations de MEP et de MKp hautement purifiées. Tout d’abord, les cellules de la moelle osseuse sont prélevées sur le fémur, le tibia et la crête iliaque, un os qui contient un grand nombre de progéniteurs hématopoïétiques. L’utilisation d’os de la crête iliaque augmente considérablement le nombre total de cellules obtenues par souris et contribue ainsi à une utilisation plus éthique des animaux. Une déplétion de la lignée magnétique a été optimisée à l’aide de billes magnétiques de 450 nm permettant un tri cellulaire très efficace par cytométrie en flux. Enfin, le protocole présente la stratégie d’étiquetage et de contrôle pour le tri des deux populations de progéniteurs mégacarytaires hautement purifiés : MEP (Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^dim) et MKp (Lin^- Sca-1^-c-Kit⁺CD16/32^-CD150⁺CD9^bright ). Cette technique est facile à mettre en œuvre et fournit suffisamment de matériel cellulaire pour effectuer i) la caractérisation moléculaire pour une connaissance plus approfondie de leur identité et de leur biologie, ii) les tests de différenciation in vitro, qui permettront de mieux comprendre les mécanismes de maturation des mégacaryocytes, ou iii) les modèles in vitro d’interaction avec leur microenvironnement.

Introduction

Les plaquettes sanguines sont produites par les mégacaryocytes. Ces grandes cellules polyploïdes sont situées dans la moelle osseuse et comme pour toutes les cellules sanguines, elles sont dérivées de cellules souches hématopoïétiques (CSH)^1. La voie classique de production de mégacaryocytes dans la moelle osseuse provient du HSC et implique la génération de différents progéniteurs qui restreignent progressivement leur potentiel de différenciation². Le premier progéniteur signant l’engagement envers la lignée mégacaryocytaire est le Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitor (MEP), un progéniteur bipotent capable de produire à....