Dynamique de formation proplaquettaire des explants de moelle osseuse fraîche de souris

Résumé

Ici, nous détaillons la méthode d’explantation de moelle osseuse, de la préparation de l’échantillon à l’analyse microscopique des lames, afin d’évaluer la capacité des mégacaryocytes qui se sont différenciés dans leur environnement physiologique à former des proplaquettaires.

Résumé

La dernière étape de la mégacarylopoïèse conduit à des extensions cytoplasmiques à partir de mégacaryocytes matures, appelés proplaquettaires. On a beaucoup appris sur la formation de proplaquettaires à l’aide de mégacaryocytes différenciés in vitro; cependant, il existe de plus en plus de preuves que les systèmes de culture conventionnels ne récapitulent pas fidèlement le processus de différenciation/maturation qui a lieu à l’intérieur de la moelle osseuse. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode d’explantation initialement décrite en 1956 par Thiéry et Bessis pour visualiser les mégacaryocytes qui ont mûri dans leur environnement natif, contournant ainsi les artefacts potentiels et les mauvaises interprétations. Les moelles osseuses fraîches sont collectées en rinçant les fémurs des souris, tranchées en sections transversales de 0,5 mm et placées dans une chambre d’incubation à 37 °C contenant un tampon physiologique. Les mégacaryocytes deviennent progressivement visibles à la périphérie de l’explantation et sont observés jusqu’à 6 heures sous un microscope inversé couplé à une caméra vidéo. Au fil du temps, les mégacaryocytes changent de forme, certaines cellules ayant une forme sphérique et d’autres développant des extensions épaisses ou étendant de nombreuses proplaquettaires minces avec une ramification étendue. Des enquêtes qualitatives et quantitatives sont menées. Cette méthode a l’avantage d’être simple, reproductible et rapide car de nombreux mégacaryocytes sont présents, et classiquement la moitié d’entre eux forment des proplaquettaires en 6 heures contre 4 jours pour les mégacaryocytes de souris en culture. En plus de l’étude de souris mutantes, une application intéressante de cette méthode est l’évaluation simple des agents pharmacologiques sur le processus d’extension proplaquettaire, sans interférer avec le processus de différenciation qui peut se produire dans les cultures.

Introduction

La technique de l’explantation de moelle osseuse a été développée pour la première fois par Thiéry et Bessis en 1956 pour décrire la formation d’extensions cytoplasmiques mégacaryocytaires de rat comme un événement initial dans la formation de plaquettes¹. En utilisant le contraste de phase et des techniques cinématographiques, ces auteurs ont caractérisé la transformation de mégacaryocytes ronds matures en cellules thrombocytogènes « semblables à des calmars » avec des extensions cytoplasmiques montrant des mouvements dynamiques d’allongement et de contraction. Ces bras deviennent progressivement plus minces jusqu’à ce qu’ils deviennent filifo....

Protocole

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux normes européennes 2010/63/UE et au Comité CREMEAS d’Éthique de l’Expérimentation Animale de l’Université de Strasbourg (Comité Régional d’Ethique en Matière d’Expérimentation Animale Strasbourg).

1. Préparation des réactifs

1. Préparer les réactifs comme décrit dans le tableau 1.
   1. Pour le Stock I, dissoudre chaque poudre séparément. S’assurer que l’osmolarité de la préparation est supérieure à 295 mOsm/L. Cette solution peut être conservée à 4 °C pendant un an.
   2. Pour la préparation tampon du Tyrode, faire la solution comme décri....

Résultats

Résultats qualitatifs. Au début de l’expérience, toutes les cellules sont compactées dans la section de la moelle osseuse. Il faut 30 min pour que les cellules deviennent clairement visibles à la périphérie des explants. Les mégacaryocytes sont alors reconnaissables à leur grande taille et leur évolution peut ensuite être étudiée dans le temps (taille, forme, dynamique, extension proplaquettaire et libération plaquettaire)(Figure 2A). Les petits mégacaryocytes ont un diamètr.......

Discussion

Nous décrivons ici une méthode in vitro simple et peu coûteuse pour évaluer l’efficacité des mégacaryocytes pour étendre les proplaquettaires qui se sont développées dans la moelle osseuse. Le modèle d’explantation de moelle osseuse pour souris présente quatre avantages principaux. Tout d’abord, aucune compétence technique avancée n’est requise. Deuxièmement, le temps nécessaire pour obtenir des proplaquettaires étendant les mégacaryocytes est assez court, seulement 6 heures pour la méthode explantation, contre .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringues de 5 mL	Terumo	SS+05S1
Aiguilles de calibre 21	BD Microlance	301155
CaCl2.6H2O	Sigma	21108
Coverwall Chambres d’incubation	Microscopie électronique Sciences	70324-02	Profondeur : 0,2 mm
HEPES	Sigma	H-3375	pH ajusté à 7.5
Albumine sérique humaine	VIALEBEX	médicament autorisé : n° ; 3400956446995	20 % (200mg/mL -100mL)
KCl	Sigma	P9333
MgCl2.6H2O	Sigma	BVBW8448
Micro Cover Glass	Electroscopy Sciences	72200-40	Microscope
	22 mm x 55 mmLeica Microsystems SA, Westlar, Allemagne	DMI8 - Caméra microscope à	lentille 514341
	Leica Microsystems SA, Westlar, Allemagne	K5 CMS GmbH -14401137	résolution de l’image : 4,2 mégapixels
Sérum de souris	BioWest	S2160-010
NaCl	Sigma	S7653
NaH2PO4. H2O	Sigma	S9638
NaHCO3	Sigma	S5761
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10 000 unités/ml de pénicilline, 10 000 &mu ; g/mL de streptomycine et 29,2 mg/mL de glutamine
Lame de rasoir	Microscopie électronique Sciences	72000
Saccharose D (+)	Sigma	G8270

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