Il est maintenant reconnu que l’environnement tridimensionnel des cellules peut jouer un rôle important dans leur comportement, leur maturation et/ou leur différenciation. Ce protocole décrit un modèle de culture cellulaire tridimensionnel conçu pour étudier l’impact du confinement physique et des contraintes mécaniques sur les mégacaryocytes.
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Article de méthode
Culture de mégacaryocytes dans un hydrogel 3D à base de méthylcellulose pour améliorer la maturation cellulaire et étudier l’impact de la rigidité et du confinement
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’environnement 3D conduisant à la fois au confinement et aux contraintes mécaniques est de plus en plus reconnu comme un déterminant important du comportement cellulaire. La culture 3D a ainsi été développée pour mieux aborder la situation in vivo. Les mégacaryocytes se différencient des cellules souches hématopoïétiques et progénitaires (HSPC) dans la moelle osseuse (BM). Le BM est l’un des tissus les plus mous du corps, confiné à l’intérieur de l’os. L’os étant peu extensible à l’échelle cellulaire, les mégacaryocytes sont concomitamment soumis à une faible rigidité et à un confinement élevé. Ce protocole présente une méthode de récupération des HSPC de lignée de souris négative (Lin-) par tri immuno-magnétique et leur différenciation en mégacaryocytes matures dans un milieu 3D composé de méthylcellulose. La méthylcellulose n’est pas réactive envers les mégacaryocytes et sa rigidité peut être ajustée à celle de la moelle osseuse normale ou augmentée pour imiter une moelle fibrotique pathologique. Le processus de récupération des mégacaryocytes pour d’autres analyses cellulaires est également détaillé dans le protocole. Bien que l’extension des proplaquettaires soit empêchée dans le milieu 3D, il est décrit ci-dessous comment remettre en service les mégacaryocytes en milieu liquide et quantifier leur capacité à étendre les proplaquettaires. Les mégacaryocytes cultivés en hydrogel 3D ont une plus grande capacité à former des proplaquettaires que ceux cultivés en milieu liquide. Cette culture 3D permet i) de différencier les progéniteurs vers les mégacaryocytes atteignant un état de maturation plus élevé, ii) de récapituler des phénotypes qui peuvent être observés in vivo mais passent inaperçus dans les cultures liquides classiques, et iii) d’étudier les voies de transduction induites par les signaux mécaniques fournis par un environnement 3D.
Introduction
Les cellules du corps subissent un microenvironnement 3D complexe et sont soumises à l’interaction entre les signaux chimiques et mécanophysiques, y compris la rigidité du tissu et le confinement dû aux cellules voisines et à la matrice environnante 1,2,3. L’importance de la rigidité et du confinement pour le comportement cellulaire n’a été reconnue qu’au cours des dernières décennies. En 2006, les travaux fondateurs d’Engler et al. 4 ont mis en évidence l’importance de l’environnement mécanique pour la différenciation cellulaire. Les auteurs ont démon....
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Protocole
Toutes les expériences doivent être effectuées conformément aux lignes directrices institutionnelles pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Tous les protocoles présentés dans la vidéo ont été réalisés dans le strict respect de la législation européenne et des recommandations de la Commission de révision de l’Etablissement Français du Sang (EFS). Une première version de ce protocole a été initialement publiée en 2018 dans Methods in Molecular Biology 8.
REMARQUE : La figure 1 présente une vue schématique de l’ensemble du processus. Ce processus comprend 1) la dissection....
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Résultats
Les données obtenues à l’aide de ce protocole ont été publiées à l’origine dans Blood en 20169.
Selon le protocole, les cellules ont été ensemencées dans un milieu liquide ou en hydrogel de méthylcellulose. Les cellules en milieu liquide ont toutes sédimenté au fond du puits, en contact avec la surface plastique rigide et parfois avec d’autres cellules. En revanche, les cellules incorporées dans l’hydrogel de méthylcellulose sont réparties de manière homogène dans le ge.......
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Discussion
Au cours de la décennie précédente, la mécanobiologie a suscité de plus en plus d’intérêt dans de nombreux domaines de la biologie. Il est maintenant communément admis que l’environnement mécanique entourant les cellules joue un rôle dans leur comportement, soulignant l’importance d’étudier comment les mégacaryocytes détectent et réagissent aux signaux mécaniques extracellulaires. Il est difficile de mesurer avec précision la rigidité du tissu de la moelle osseuse in situ11, surtout si l’.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Fabien Pertuy et Alicia Aguilar qui ont initialement développé cette technique en laboratoire, ainsi que Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Strasbourg) qui a caractérisé les propriétés viscoélastiques de l’hydrogel de méthylcellulose. Ce travail a été soutenu par l’ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) et par une subvention ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher est récipiendaire de la Fondation pour la Recherche Médicale (frM numéro FDT202012010422).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Aiguilles de calibre 18 | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| Aiguilles de calibre 21 | BD Microlance | 301155 | |
| Aiguilles de calibre 23 | Terumo | AN*2332R1 | |
| Neeldes de calibre 25 | BD Microlance | 300400 | |
| Boîtes de culture à 4 puits | Thermo Scientific | 144444 | |
| Seringues de 5 mL | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels équipés de cartes filtrantes | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin | centrifugeuse Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco stérile s aimants salins EasySep tamponnés au phosphate |
| Stem Cell Technologies | 18000 | ||
| Kit d’isolement de cellules progénitrices hématopoïétiques de souris | Stem Cell Technologies | 19856A | anticorps biotinylés (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7&ndash ; 4) et des billes magnétiques enrobées de streptavidine |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Sérum fœtal bovin | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Seringues Luer lock 1 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | ou seringues 309628 de BD MEDICAL |
| Connecteurs de seringues Luer lock | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3 % | R& ampère; D systems | HSC001 | |
| Lames revêtues de polylysine | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10 000 unités/mL de pénicilline, 10 000 &mu ; g/mL de streptomycine et 29,2 mg/mL de glutamine |
| sérum de rat | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Hirudin recombinante | Transgè ; | rHV2-Lys47 | |
| Tromboïétine humaine recombinante (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10 000 unités/mL |
| Tubes en plastique à fond rond de 10 mL Falcon | 352054 | ||
| Tubes |
Références
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblasto....
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Réimpressions et autorisations
