Article de méthode

Profilage de la modification H3K4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage

DOI :

10.3791/62534

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22 avril 2022

 ,  ,  , 
1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, 2Central Laboratory, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cotton Hybrid R & D Engineering Center (the Ministry of Education), College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, 4Hainan Institute of Zhejiang University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le clivage sous les cibles et le marquage (CUT&Tag) est une stratégie efficace de profilage épigénomique de la chromatine. Ce protocole présente une stratégie CUT&Tag affinée pour le profilage des modifications des histones chez les plantes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La régulation épigénomique au niveau chromatique, y compris les modifications de l’ADN et des histones, les comportements des facteurs de transcription et les ARN non codants avec leurs protéines recrutées, conduisent à un contrôle temporel et spatial de l’expression des gènes. Le clivage sous cibles et marquage (CUT&Tag) est une méthode d’attachement enzymatique dans laquelle la protéine spécifique de chromatine est d’abord reconnue par son anticorps spécifique, puis l’anticorps attache une protéine de fusion A-transposase (pA-Tn5), qui clive la chromatine ciblée in situ par l’activation d’ions magnésium. Ici, nous fournissons notre protocole CUT&Tag précédemment publié en utilisant des noyaux intacts isolés à partir de feuilles de coton allortetraploïdes avec modification. Ce protocole étape par étape peut être utilisé pour la recherche épigénomique chez les plantes. En outre, des modifications substantielles pour l’isolement des noyaux végétaux sont accompagnées de commentaires critiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les sites d’ADN de liaison au facteur de transcription et la chromatine ouverte associée aux marques de modification des histones jouent un rôle fonctionnel essentiel dans la régulation de l’expression des gènes et constituent les principaux axes de recherche épigénétique1. Classiquement, le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) couplé au séquençage profond (ChIP-seq) a été utilisé pour l’identification à l’échelle du génome de la modification spécifique de l’histone de la chromatine ou de cibles d’ADN avec des protéines spécifiques, et est largement adopté dans le domaine de l’épigénétique2. La technologie de clivage sous cibles et de marquage (CUT&Tag) a été développée à l’origine par le laboratoire Henikoff pour capturer les fragments d’ADN affiliés aux protéines dans tout le génome5. Par rapport au ChIP, CUT&Tag peut générer des bibliothèques d’ADN à haute résolution et avec un arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée3. À ce jour, des méthodes d’analyse des régions de chromatine avec des modifications spécifiques des histones à l’aide de CUT&Tag ont été établies dans des cellules animales4,5. Plus précisément, le CUT&Tag unicellulaire (scCUT&Tag) a également été développé avec succès pour les tissus et cellules humains6. Cependant, en raison de la complexité de la paroi cellulaire et des métabolites secondaires, CUT&Tag est toujours techniquement difficile pour les tissus végétaux.

Auparavant, nous avions signalé un protocole CUT&Tag utilisant des noyaux intacts isolés à partir de feuilles de coton allotétraploïdes4. Pour démontrer l’efficacité de l’isolement des noyaux et de la capture de l’ADN à l’aide de tissus végétaux, la procédure de profilage est présentée ici. Les principales étapes comprennent l’isolement des noyaux intacts, l’incubation in situ avec l’anticorps pour la modification de la chromatine, l’incubation de la transposase, l’intégration de l’adaptateur et la préparation de la bibliothèque d’ADN. Le dépannage se concentre sur la préparation de la bibliothèque CUT&Tag pour l’isolation des noyaux de la plante et le contrôle qualité.

Dans cette étude, nous présentons une stratégie CUT&Tag affinée pour les plantes. Non seulement nous fournissons un protocole étape par étape pour le profilage H3K4me3 dans les feuilles de coton, mais nous fournissons également une méthodologie optimisée pour l’isolement des noyaux végétaux, y compris la stratégie de sélection de la concentration de détergent pour une lyse cellulaire appropriée et la stratégie de filtrage des noyaux. Des étapes détaillées avec des commentaires critiques sont également incluses dans ce protocole mis à jour.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparer la transposase et les solutions mères (Jour 1)

REMARQUE: Dans cette partie, les adaptateurs oligonucléotidiques sont complexés avec la transposase Tn5 pour rendre la transposase active.

  1. Diluez les apprêts (apprêt A, apprêt B et apprêt C) jusqu’à une concentration de 100 μM à l’aide du tampon de recuit (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (voir le tableau 1 pour les informations de séquence des apprêts et le tableau 2 pour les recettes de solutions de travail). Conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
  2. Mettre en place les deux réactions suivantes dans les tubes PCR : Réaction 1 (adaptateur AB), 10 μL d’amorce A de 100 μM, 10 μL d’amorce B de 100 μM ; Réaction 2 (adaptateur AC), 10 μL de 100 μM amorce A, 10 μL 100 μM amorce C.
  3. Recuit les adaptateurs dans la machine PCR à l’aide du programme suivant: couvercle chauffant (102 °C), 75 °C pendant 15 min, 60 °C pendant 10 min, 50 °C pendant 10 min, 40 °C pendant 10 min, 25 °C pendant 30 min.
    REMARQUE: Les adaptateurs sont des molécules d’ADN partiellement double brin (concentration = 50 pmol / μL).
  4. Mettre en place la réaction suivante dans un tube centrifuge de 1,5 mL : 10 μL de transposase pA-Tn5 (500 ng/μL ou 7,5 pmol/μL), 0,75 μL d’adaptateur AB (50 pmol/μL), 0,75 μL d’adaptateur AC (50 pmol/μL), 7 μL de tampon de couplage. Pipette 20x doucement pour bien mélanger et incuber à 30 °C au bain-marie pendant 1 h. Concentration finale de transposase = 4 pmol/μL. Conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
    REMARQUE: Rapport molaire de l’adaptateur AB: adaptateur AC: transposase = 0,5: 0,5: 1.
  5. Préparer les solutions mères selon les recettes fournies dans le tableau 2 et autoclaver ou filtrer les solutions mères pour les stériliser.
  6. Autoclavez et stérilisez des ciseaux, du papier filtre, un tamis en acier inoxydable, un mortier, des pilons, etc.

2. Isolement des noyaux (Jour 2)

  1. Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C. Pour chaque 1 g de matière première (feuilles de coton), préparer 25 mL de tampon d’isolement nucléaire A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL de tampon d’isolement nucléaire B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL de tampon de lavage nucléaire (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail inhibiteur de protéase 0,1 %), 1 mL de tampon anticorps (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, 1 mg/mL BSA, cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,1 %, 0,05 % p/v digitonine). Laissez les tubes reposer sur la glace jusqu’à utilisation.
  2. Broyer les feuilles fraîches (~1 g) dans de l’azote liquide en une poudre fine et les transférer dans un tube de 50 mL contenant 25 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré A.
  3. Mélanger doucement la solution tampon et incuber le tube sur de la glace pendant 5 min en agitant doucement pour disperser le matériau uniformément.
  4. Centrifuger pendant 5 min à 500 rcf à 4 °C pour former la pastille de cellule.
  5. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 20 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré B complété par 0,5% de Triton X-100. Inverser doucement le tube pour remettre complètement la pastille en suspension.
    REMARQUE: Le tampon d’isolement nucléaire B de 20 mL est applicable pour 1 g de matière première, et ce volume peut être mis à l’échelle en conséquence.
    1. Effectuer un essai pilote pour tester l’effet de la concentration en série de Triton X-100 (p. ex., tampon d’isolement nucléaire B de 2 mL, chacun avec 0,1 %, 0,25 %, 0,5 % et 1 % de Triton X-100 pour 100 mg de tissus broyés). La concentration appropriée de Triton X-100 est indiquée par une accumulation de noyaux blancs/gris au fond et un surnageant vert foncé après lyse et centrifugation à basse vitesse (< 500 rcf pendant 4 min).
  6. Filtrer le lysat cellulaire résultant avec une combinaison de deux tamis: un tamis de 500 mailles sur le dessus pour éliminer les plus gros débris tissulaires et un tamis de 1000 mailles sur le fond pour recueillir les noyaux.
    REMARQUE: Choisissez un maillage approprié pour les tamis en fonction de la taille des noyaux des plantes.
  7. Utilisez du papier filtre stérile à l’arrière du tamis pour absorber les débris de petites cellules dans le lysat.
  8. Transférer les noyaux restants contenant du lysat sur la face supérieure du tamis à 1000 mailles dans quatre tubes centrifuges frais de 1,5 mL.
  9. Centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C pour recueillir les noyaux.
  10. Retirez autant de surnageant que possible à l’aide d’une pointe de pipette et lavez la pastille avec un tampon de lavage nucléaire.
  11. Ajouter 800 μL du tampon de lavage nucléaire et inverser doucement les tubes pour remettre en suspension la pastille. Faire tourner à nouveau le tube pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C.
  12. Effectuez un total de 3 lavages.
  13. (Facultatif) Imagez les noyaux sous un microscope pour la coloration DAPI.
    1. Transférer 100 μL de suspension de noyaux dans le tampon de lavage nucléaire à partir de l’étape 2.11. à un nouveau tube de 1,5 mL. Ajouter 900 μL de tampon de lavage nucléaire et 2 μL de solution mère de DAPI (1 mg/mL) pour obtenir une concentration de travail finale de 2 μg/mL pour le DAPI. Incuber le tube dans l’obscurité pendant 30 min à température ambiante.
    2. Après coloration, centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C pour recueillir les noyaux.
    3. Retirez autant de surnageant que possible à l’aide d’une pointe de pipette. Lavez 3 fois avec 800 μL du tampon de lavage nucléaire.
    4. Retirez autant de surnageant que possible et remettez en suspension les noyaux avec 100 μL de tampon de lavage nucléaire.
    5. Imagez les noyaux sous un microscope à fluorescence à l’aide du canal DAPI.
  14. Combinez les noyaux de deux tubes (~50 μL de noyaux en volume dans chaque tube de 1,5 mL). Centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez autant que possible le tampon restant à l’aide d’une pointe de pipette.

3. Incubation d’anticorps

  1. Remettre en suspension chaque 50 μL de noyaux dans un tube de 1,5 mL avec 1 mL de tampon d’anticorps.
  2. Mettre en place les réactions suivantes dans des tubes de 1,5 mL : deux répliques biologiques de groupes témoins d’IgG avec 150 μL de noyaux (~ 1 μg de chromatine) et 2 μL d’IgG (1 mg/mL) dans chaque tube, deux répliques biologiques de groupes de dosage H3K4me3 avec 150 μL de noyaux et 2 μL d’anticorps anti-H3K4me3 (1 mg/mL) dans chaque tube.
  3. Mélanger doucement la solution et laisser les tubes sur un agitateur horizontal pour l’hybridation pendant la nuit à 4 °C et 12 tr/min.
  4. Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C. Préparer 50 mL frais de tampon de lavage d’immunoprécipitation (IP) (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,1%, 0,05% p/v digitonine) dans un tube centrifuge de 50 mL. Laissez le tube reposer sur la glace.
  5. Centrifuger les tubes pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon d’anticorps de chaque tube.
  6. Ajouter 800 μL de tampon de lavage IP à chaque tube et mélanger doucement. Laissez les tubes sur un agitateur horizontal pendant 5 min à température ambiante et à 12 tr/min.
  7. Après lavage, centrifuger les tubes pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette.
    REMARQUE: Pour éviter toute perturbation de la pastille de noyaux, laissez ~ 50-80 μL du tampon avec les noyaux.
  8. Répétez les étapes 3.6.-3.7. deux fois de plus.
  9. Après le troisième lavage, centrifuger pendant 2 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon restant autant que possible.

4. Incubation de la transposase

  1. Préparer 1 mL de tampon d’incubation de transposase (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,1 %, 0,05 % p/v digitonine) en mélangeant 1 mL du tampon de lavage IP avec 30 μL de 5 M NaCl.
  2. Pour préparer le mélange de transposase Tn5 pour l’incubation, ajouter 1 μL de transposase à chaque 150 μL du tampon d’incubation de la transposase.
    REMARQUE: Préparer d’abord le mélange de solution de transposase en fonction du nombre de réactions, puis ajouter une aliquote de 150 μL à chaque tube.
  3. Remettre en suspension les noyaux avec 150 μL de solution de transposase.
  4. Laisser les tubes sur un agitateur horizontal à 12 tr/min pendant 2-3 h à température ambiante et mélanger toutes les 10-15 min.
  5. Après incubation de la transposase, centrifuger les tubes pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon d’incubation de la transposase dans chaque tube.
  6. Lavez les tubes avec un tampon de lavage IP. Pour ce faire, ajoutez 800 μL de tampon de lavage IP à chaque tube, mélangez doucement et laissez les tubes sur un agitateur horizontal à 12 tr/min pendant 5 min à température ambiante.
  7. Centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette.
  8. Répétez les étapes 4.6.-4.7. deux fois de plus.
  9. Après le troisième lavage, centrifuger pendant 2 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon restant autant que possible.

5. Balisage

  1. Préparer fraîchement 2 mL du tampon de marquage (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail inhibiteur de protéase 0,1 %, 10 mM MgCl2, 0,05 % p/v digitonine) en mélangeant 2 mL de tampon de lavage IP avec 60 μL de 5 M NaCl et 20 μL de 1 M MgCl2.
  2. Resuspendez les noyaux avec 300 μL de tampon de marquage.
  3. Mélanger la solution et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h pour le marquage.
  4. Arrêter le marquage avec 10 μL de 0,5 M d’EDTA (concentration finale ~15 mM) et 30 μL de FDS à 10 % (concentration finale 1 %).

6. Extraction de l’ADN et construction de la bibliothèque NGS

  1. Ajouter 300 μL de tampon d’extraction d’ADN CTAB comme décrit7. Incuber les tubes dans un bain-marie à 65 °C pendant 30 min. Inverser pour mélanger toutes les ~10 min.
  2. Ajouter 600 μL de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24:1) dans chaque tube. Mélanger.
  3. Pré-centrifuger les tubes de gel à verrouillage de phase pendant 2 min à 13 000 rcf à 4 °C. Transférer la solution ci-dessus dans des tubes de gel à verrouillage de phase.
  4. Centrifuger pendant 10 min à 13 000 rcf à 4 °C.
  5. Transférer le surnageant (~600 μL) dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  6. Ajouter 600 μL de chloroforme à chaque tube. Mélanger.
  7. Centrifuger pendant 10 min à 13 000 rcf à 4 °C.
  8. Transférer le surnageant (~600 μL) dans un nouveau tube de 1,5 ml.
  9. Ajouter 12 μL d’éthanol à 100 % et 2 μL de coprécipitant GlycoBlue. Bien mélanger et conserver à -20 °C pendant 1 h.
  10. Centrifuger pendant 10 min à 13 000 rcf à 4 °C.
  11. Décantez le surnageant. Laver la pastille d’ADN à l’aide d’éthanol à 75 % (v/v) et centrifuger pendant 5 min à 13 000 rcf à 4 °C.
  12. Décantez le surnageant. Séchez la pastille d’ADN à l’air libre et remettez en suspension l’ADN dans 25 μL de ddH2O.
  13. Configurez la réaction PCR comme suit. Pour un total de 50 μL de réaction, ajoutez 24 μL d’ADN, 11 μL de ddH2O, 10 μL de tampon TAE 5x, 2 μL d’amorce P5 (10 μM), 2 μL d’amorce P7 (10 μM) et 1 μL d’enzyme TruePrep Amplify. Programme PCR : 72 °C pendant 3 min, 98 °C pendant 30 s ; puis 14 cycles de 98 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivis de 72 °C pendant 5 min.
    REMARQUE: Les premiers 72 °C pendant 3 min pour l’extension ne peuvent pas être ignorés. La suramplification de la bibliothèque conduira à un niveau élevé de doublons PCR dans le NGS. Commencez à partir de 12-14 cycles de PCR dans la réaction pcrifique pour H3K4me3 en utilisant ~ 1 μg de chromatine dans chaque réaction.
  14. Chargez 2 μL des produits PCR sur un gel d’agarose à 1,5% pour l’électrophorèse.
  15. Purifier les produits pcr à l’aide de billes magnétiques de purification de l’ADN commerciales.
  16. Quantifiez la bibliothèque avec un fluoromètre et une électrophorèse sur gel d’agarose.
    REMARQUE: La concentration effective de la bibliothèque doit être >2 nM par qPCR pour assurer une bonne qualité.
  17. Effectuez le séquençage de nouvelle génération (NGS) et l’analyse des données.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figure 1 illustre le flux de travail CUT&Tag. La figure 2 montre la coloration DAPI des noyaux intacts. L’objectif de l’étape « isolement des noyaux » était d’obtenir les noyaux intacts en quantité suffisante pour la réaction CUT&Tag ultérieure. La figure 3 montre l’électrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR. Le contrôle négatif IgG est requis en parallèle lors de la mise en place de l’expérience. Par rapport au...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous avons décrit CUT&Tag, une technologie permettant de générer des bibliothèques d’ADN à haute résolution et en arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée par rapport à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Notre succès avec le profilage H3K4me3 dans les feuilles de coton suggère que CUT&Tag, qui a d’abord été conçu pour les cellules animales, peut également être utilisé pour les cellules végétales. Le système tampon Tris couramment utilis...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts avec une société négociant l’un des produits mentionnés ci-dessus.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu financièrement en partie par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), et des fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) et le projet JCIC-MCP.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps
Anti-H3K4me3Millipore07-473
IgG de lapin normalMillipore12-370
Produits chimiques
Albumine sérique bovine (BSA)Préparer 10 mg/ml de solution mère de BSA. Conserver à -20° ; C
digitonine (~50 % (TLC)Sigma-AldrichD141Préparez une solution mère de digitonine à 5 % (200 mg de digitonine [~50 % de pureté] pour 2 mL de DMSO). Remarque : Stérilisez à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Conserver à -20° ; C
diméthylsulfoxyde (DMSO)
chloroforme
éthylènediamineacide tétraacétique (EDTA)Produire 0,5 M EDTA (pH = 8,5) solution mère. Remarque : Pour fabriquer 100 ml d’EDTA 0,5-M (pH = 8,5), il faut environ 2 g de pastilles d’hydroxyde de sodium (NaOH) pour ajuster le pH de l’éthanol
Coprécipitant GlycoBlue (15 mg/mL)InvitrogenAM9516
chlorure de magnésium (MgCl2)Make 1 M MgCl2 cocktail
d’inhibiteurs de protéaseCalbiochem539133-1SET
chlorure de potassium (KCl)Fabriquer 1 M de KCl solution mère
phénol :chloroforme :alcool isoamylique (25:24:1,v :v :v)
chlorure de sodium (NaCl)Faire 5 M NaCl solution mère
spermidineFabriquer 2 M de spermidine solution mère, conserver à -20° ;C.
dodécylsulfate de sodium (SDS)Préparezune solution mère SDS à 10 %. Remarque : Ne pas autoclaver ; stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 micron
TrisPréparer 1 M de solution mère Tris (pH = 8,0)
Triton X-100Préparer 20 % de solution mère Triton X-100
enzyme
hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase pour CUT& TagVazymeS602/S603Vérifiez l’affinité des anticorps de la protéine A ou de la protéine G qui est fusionnée avec le Tn5. D’une manière générale, les protéines A et G ont une large affinité pour les anticorps. Cependant, la protéine A a une affinité relativement plus élevée pour les anticorps de lapin et la protéine G a une affinité relativement plus élevée pour les anticorps de souris. Sélectionnez les produits de transposase appropriés qui correspondent à votre anticorps.
TruePrep Amplify EnzymeVazymeTD601
Equipment
CentrifugeEppendorf5424R
PCRMachine Applied BiosystemsABI9700
Vibrateur orbitalMIULABHS-25
NanoDrop One  ; spectrophotomètreThermo ScientificND-ONE-W
Base

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
  2. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  3. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  4. Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120(2020).
  5. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  6. Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
  7. Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11(2007).
  9. Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).
  10. Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
  11. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).

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Réimpressions et autorisations

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Mots-clés

CUT And TagChromatin ProfilingPlant EpigenomicsNuclei IsolationHistone ModificationTn5 TransposaseAntibody IncubationDNA FragmentationHigh Throughput Sequencing

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