Article de méthode
Ce protocole décrit l’extraction de composés organiques volatils à partir d’un échantillon biologique avec la méthode d’extraction par sorbant assistée par vide, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse à l’aide du rail de préparation d’échantillon Entech et l’analyse des données. Il décrit également la culture d’échantillons biologiques et le sondage d’isotopes stables.
Les composés organiques volatils (COV) provenant d’échantillons biologiques ont des origines inconnues. Les COV peuvent provenir de l’hôte ou de différents organismes de la communauté microbienne de l’hôte. Pour démêler l’origine des COV microbiens, une analyse de l’espace de tête volatile de monocultures et co-cultures bactériennes de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii, et un sondage d’isotopes stables dans des échantillons biologiques d’excréments, de salive, d’eaux usées et d’expectorations ont été effectués. Des monocultures et des co-cultures ont été utilisées pour identifier la production volatile d’espèces bactériennes individuelles ou en combinaison avec des sondages isotopiques stables pour identifier le métabolisme actif des microbes à partir des échantillons biologiques.
L’extraction par sorbant assistée par vide (VASE) a été utilisée pour extraire les COV. VASE est une méthode d’extraction de l’espace de tête facile à utiliser, commercialisée et sans solvant pour les composés semi-volatils et volatils. Le manque de solvants et les conditions de quasi-vide utilisées lors de l’extraction rendent le développement d’une méthode relativement facile et rapide par rapport à d’autres options d’extraction telles que la tert-butylation et la microextraction en phase solide. Le flux de travail décrit ici a été utilisé pour identifier des signatures volatiles spécifiques provenant de monocultures et de cocultures. De plus, l’analyse du sondage isotopique stable des échantillons biologiques associés à l’homme a permis d’identifier des COV qui étaient produits de manière courante ou unique. Cet article présente le flux de travail général et les considérations expérimentales de VASE en conjonction avec le sondage isotopique stable de cultures microbiennes vivantes.
Les composés organiques volatils (COV) sont très prometteurs pour la détection et l’identification bactériennes, car ils sont émis par tous les organismes et différents microbes ont des signatures COV uniques. Les molécules volatiles ont été utilisées comme mesure non invasive pour détecter diverses infections respiratoires, y compris la maladie pulmonaire obstructive chronique1, la tuberculose2 dans l’urine3 et la pneumonie associée au ventilateur4, en plus de distinguer les sujets atteints de mucoviscidose (FK) des sujets témoins sains 5,6
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1. Pen absorbant d’espace de tête (HSP) et considérations d’analyse d’échantillons
REMARQUE: Le HSP contenant le sorbant Tenax TA a été sélectionné pour capturer un large éventail de volatiles. Tenax a une affinité plus faible pour l’eau par rapport à d’autres sorbants, ce qui lui permet de piéger plus de COV à partir d’échantillons plus humides. Tenax a également un faible niveau d’impuretés et peut être conditionné pour la réutilisation. Le choix du sorbant a également été effectué en tenant compte de la colonne installée dans le GC-MS (voir le tableau des matériaux).
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Monocultures et co-cultures de S. aureus, P. aeruginosa et A. baumannii
Les monocultures et co-cultures étaient constituées des espèces bactériennes S. aureus, P. aeruginosa et A. baumannii. Ce sont des agents pathogènes opportunistes courants présents dans les plaies humaines et les infections chroniques. Pour identifier les molécules volatiles présentes dans les monocultu.......
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Pour identifier la production volatile dans les cultures in vitro et les échantillons associés à l’homme, une analyse volatile des monocultures et co-cultures de P. aeruginosa, S. aureus et A. baumanii et un sondage isotopique stable de différents échantillons biologiques ont été effectués. Dans l’analyse des monocultures et co-cultures, les volatiles ont été détectés en effectuant une courte extraction pendant 1 h à 70 °C. L’analyse volatile des monocultures et des co-cultures a permis d’étud.......
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V. L. V et S. J.B. D. étaient d’anciens employés d’Entech Instruments Inc., et K. W. est membre du programme universitaire d’Entech. J. P., J. K. et C. I. R. n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Nous remercions Heather Maughan et Linda M. Kalikin pour l’édition minutieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par NIH NHLBI (subvention 5R01HL136647-04).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| Pompe à diaph 2 étages | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| Flacons VOA de 20 mL | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Bouchons noirs avec trou, sans septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | maintient la doublure du couvercle en place sur la bouteille |
| Doublure de flacon de 24 mm pour stylos absorbants | Entech Instruments | SP-L024S | permet aux stylos de faire un joint sous vide au sommet du flacon |
| 5600 Unité d’extraction du stylo absorbant (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Unité d’extraction du stylo absorbant -120 VAC |
| Plaques d’essai à 96 puits | Genesee | 25-224 | |
| Milieu de perfusion cerveau-cœur (BHI) | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 colonne | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0,25 mm de diamètre intérieur, épaisseur de film de 1,40 micron, en GC-MS |
| Oxyde de deutérium | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC et 5975C inert XL MSD avec détecteur à trois axes) | Agilent | 7890A GC et 5975C inerte XL MSD avec triple axe | |
| HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Articles pour l’extraction de l’espace de tête inclus dans le paquet |
| espace de tête (HSP) - vierge | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Stylo absorbant pour espace de tête (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Tubes de microcentrifugation (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| Joints toriques | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Préparation des échantillons Rail | Entech Instruments | ||
| Stylo absorbant conditionneur | thermique Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) média | Sigma | T1438-500G |
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