Article de méthode

Criblage chromosomique d’embryons humains préimplantatoires à l’aide de milieux de culture épuisés : prélèvement d’échantillons et analyse de la ploïdie chromosomique

DOI :

10.3791/62619

⸱

7 septembre 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.

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Résumé

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La présente étude fait état d’un protocole de criblage chromosomique d’embryons humains qui utilise un milieu de culture épuisé, ce qui évite la biopsie embryonnaire et permet l’identification de la ploïdie chromosomique à l’aide du NGS. Le présent article présente la procédure détaillée, y compris la préparation du milieu de culture, l’amplification du génome entier (WGA), la préparation de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération (NGS) et l’analyse des données.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans la fécondation clinique in vitro (FIV), la méthode prédominante pour le PGT-A nécessite la biopsie de quelques cellules du trophectoderme (TE). C’est la lignée qui forme le placenta. Cette méthode, cependant, nécessite des compétences spécialisées, est invasive et souffre de faux positifs et de faux négatifs, car le nombre de chromosomes dans le TE et la masse cellulaire interne (ICM), qui se développe dans le fœtus, ne sont pas toujours les mêmes. Le NICS, une technologie nécessitant le séquençage de l’ADN libéré dans le milieu de culture à la fois par TE et par ICM, peut offrir une solution à ces problèmes, mais il a déjà été démontré qu’il avait une efficacité limitée. La présente étude rend compte du protocole complet du NICS, qui comprend les méthodes d’échantillonnage des milieux de culture, l’amplification du génome entier (WGA) et la préparation de la bibliothèque, ainsi que l’analyse des données NGS par un logiciel d’analyse. Compte tenu des différents temps de cryoconservation dans les différents laboratoires d’embryons, les embryologistes disposent de deux méthodes de collecte du milieu de culture embryonnaire qui peuvent être sélectionnées en fonction des conditions réelles du laboratoire de FIV.

Introduction

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Les techniques de procréation assistée (ART) sont de plus en plus utilisées pour le traitement de l’infertilité. Cependant, le taux de réussite des traitements antirétroviraux, tels que la FIV, a été limité et le taux de fausse couche est significativement plus élevé que celui de la population normale1. La principale cause de ces problèmes est les anomalies chromosomiques, qui existent couramment dans les embryons humains préimplantatoires2. Le PGT-A est une méthode efficace de dépistage de l’équilibre chromosomique des embryons avant l’implantation 3,4. Certaines études ont prouvé que le PGT-A peut réduire le taux d’avortement et améliorer le taux de grossesse 5,6,7,8. Cependant, le PGT-A nécessite une expertise technique complexe qui nécessite une formation et une expérience spécifiques. La procédure invasive de biopsie embryonnaire pourrait également causer des dommages aux embryons9. Des études ont montré que la biopsie du blastomère peut entraver le développement ultérieur et que le nombre de TE biopsiées peut affecter les taux d’implantation10. Bien que la question de la biosécurité à long terme de la biopsie embryonnaire n’ait pas encore été évaluée de manière approfondie chez l’homme, des études animales ont montré ses influences négatives sur le développement de l’embryon11,12,13.

Des rapports antérieurs indiquaient que des traces d’ADN étaient sécrétées dans le milieu de culture au cours du développement de l’embryon, et des efforts ont été faits pour effectuer un criblage chromosomique complet (CCS) à l’aide de milieux de culture embryonnaires épuisés 14,15,16,17,18. Cependant, les taux de détection et la précision des tests n’ont pas répondu aux exigences d’une utilisation clinique étendue. La présente étude a fait état d’une amélioration du test NICS pour augmenter les taux de détection ainsi que la précision du test NICS19. Au cours des dernières années, le liquide blastocoele (BF) a été étudié en tant qu’échantillon analytique de PGT-A mini-invasif. Cependant, la proportion d’amplification réussie à l’échelle du génome et d’ADN détectable dans les échantillons de liquide de blastocyste varie de 34,8 % à 82 %20,21,22. Le volume de BF rapporté dans diverses études varie de 0,3 nL à 1 μL. Compte tenu de la faible quantité d’ADN dans BF, il est possible d’augmenter la quantité d’ADN acellulaire en mélangeant le liquide du blastocyste et le milieu de culture pour améliorer le taux de réussite et la cohérence de la détection. Kuznyetsov et al.23 et Li et al.24 ont traité la zone pellucide avec un laser et ont libéré du liquide de blastocyste dans le milieu de culture pour améliorer la quantité totale d’ADN embryonnaire, et le taux d’amplification des échantillons combinés milieu/BF après WGA était de 100 % et 97,5 %, respectivement. Jiao et al.25 ont également obtenu un taux de réussite d’amplification de 100% en utilisant la même méthode.

La présente étude fait état d’un protocole détaillé qui comprend la préparation des échantillons de milieux usés, la préparation du NGS et l’analyse des données. En retirant soigneusement les cellules de cumulus des ovocytes, la présente étude a effectué une injection intracytoplasmique de spermatozoïdes uniques (ICSI) et une culture de blastocystes. Le support dépensé du jour 4, du jour 5 et du jour 6 a été collecté pour la préparation de la bibliothèque WGA et NGS. En utilisant la technologie NICS, la présente étude a rationalisé les étapes de préparation des bibliothèques WGA et NGS en environ 3 h et a obtenu des résultats CCS non invasifs en environ 9 h.

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Protocole

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L’autorisation éthique a été obtenue auprès du Comité d’éthique du Troisième Hôpital de l’Université de Pékin.

1. Préparation

REMARQUE : Le matériel et l’équipement requis sont énumérés dans le tableau des matériaux.

  1. Réactifs
    1. Préchauffer et équilibrer (équilibré) 20 à 30 μL de milieu de gamètes/milieu de fertilisation et milieu de culture de clivage/blastocyste (recouvert d’huile minérale) et de hyaluronidase (dans un tube hermétiquement fermé) à 37 °C, 5 % de CO 2 et 5 % d’O2 dans un incubateur tri-gaz pendant la nuit avant utilisation.
    2. Préchauffer la hyaluronidase à 37 °C sur un plan de travail dans une hotte.
    3. Préparez le tampon de vitrification et les réactifs de prélèvement d’échantillons conformément aux instructions du fabricant.
  2. Outils
    1. Préparer des pipettes de prélèvement et de transfert d’échantillons (diamètre intérieur de ~200 à 250 μm), des pipettes de dénudation/dénudage (diamètre intérieur de ≥150 μm, ~130-140 μm et ~120 μm) et des pipettes de lavage (diamètre intérieur de ~150 μm) en tirant des pipettes Pasteur en verre pour générer des pointes fines ouvertes polies au feu.
      REMARQUE : Les pipettes utilisées pour le prélèvement/transfert d’échantillons, la dénudation et le lavage peuvent être achetées directement. Les aiguilles de maintien et les aiguilles d’injection peuvent également être achetées directement.

2. Protocole 1 : Prélèvement d’échantillons

  1. Prétraitement du complexe ovocyte-corona-cumulus (OCCC) avant digestion avec la hyaluronidase
    1. Obtenir une stimulation ovarienne avec des préparations d’hormone folliculo-stimulante (FSH) et de gonadotrophine de la ménopause humaine (hMG). Lorsque le follicule principal mesure >18 mm, utilisez 10 000 UI de gonadotrophine chorionique (hCG) pour la maturation finale de l’ovocyte.
    2. Effectuer le prélèvement des ovocytes 36 h après la piqûre de déclenchement. Prélever et transférer les ovocytes dans des boîtes de culture tissulaire avec 2,5 mL de m-HTF préchauffé recouvert d’huile minérale.
    3. Transférer rapidement les OCCC dans le puits central d’une boîte de culture d’organes contenant 1 mL de milieu fertilisant à l’aide d’une pipette de transfert, puis incuber avec les ovocytes à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO 2 et 5 % d’O2 pendant2 à 4 h.
  2. Digérer les CCCO contenant de la hyaluronidase en ajoutant 1 mL de hyaluronidase préchauffée à 37 °C (80 UI/mL) dans le puits central d’une boîte de culture d’organes contenant des CCC (étape 2.1.3). Maintenir la concentration finale de hyaluronidase à 40 UI/mL et bien mélanger.
    1. Incuber les OCCC sur une plateforme thermique à 37 °C pendant 2 min. Observez les changements au microscope toutes les 30 s jusqu’à ce qu’il ne reste plus que 1 à 2 couches de cellules de la granulosa.
  3. Dénudation des cellules de la granulosa
    1. Transférez rapidement les OCCC digérés dans la boîte de culture pour la manipulation des ovocytes et recouvrez d’huile minérale dans chaque puits.
    2. Observez les cellules de la granulosa séparées au microscope. Aspirez doucement et libérez les ovocytes 5 fois pour éliminer les cellules résiduelles de la granulosa autour des ovocytes.
    3. Répétez l’étape précédente dans les 3 puits restants pour éliminer complètement les cellules de la granulosa.
      REMARQUE : Les étapes ci-dessus (2.1-2.3) peuvent être effectuées en fonction du fonctionnement de routine de chaque laboratoire.
  4. Évaluation de l’ovocyte
    1. Évaluer l’exhaustivité de l’élimination des cellules de la granulosa à l’aide d’un microscope. Si les cellules n’ont pas pu être complètement éliminées, la rétention de 5 cellules de la granulosa ou moins est acceptable à ce stade.
      REMARQUE : Si les cellules du cumulus sont toujours attachées à l’ovocyte, le reste peut être retiré plus tard le jour 3 avant que l’embryon ne soit transféré du milieu de culture au stade de clivage au milieu de culture au stade de blastocyste.
  5. Après avoir effectué l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI)26, transférer les ovocytes dans des microgouttelettes de milieu de culture embryonnaire de 20 à 30 μL (un ovocyte correspond à une microgouttelette) à l’aide de pipettes de transfert et incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO 2 et 5 % d’O2.
    1. Enregistrez le jour de l’ICSI comme jour 0. Vérifier les embryons et obtenir un score selon l’atelier de consensus d’Istanbul sur l’évaluation embryonnaire du jour 1 pour la fécondation (environ 18 h), du jour 2 (environ 45 h) et du jour 3 (environ 68 h) pour le clivage embryonnaire27.
  6. Lavage d’embryons
    1. Préparer 20 à 30 μL de microgouttelettes de milieu de culture de blastocystes pour chaque embryon recouvert d’huile minérale dans des boîtes de culture tissulaire au jour 2 dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO 2 et 5 % d’O2.
    2. Préparez trois autres microgouttelettes recouvertes d’huile minérale et étiquetez les nouvelles boîtes de culture tissulaire pour le lavage n° 1-3.
    3. Transférez les embryons du jour 3 dans les microgouttelettes de lavage. Aspirez doucement et libérez les embryons 3 fois dans chaque gouttelette à l’aide de pipettes à dénudation.
      REMARQUE : Cette procédure peut également aider à éliminer les cellules granulaires résiduelles attachées à l’embryon.
    4. Observer et évaluer les embryons au microscope le jour 3 avant que le milieu ne soit changé de milieu de culture au stade de clivage à milieu de culture de blastocyste pour le marquage morphologique. Si les cellules de cumulus étaient encore attachées à l’embryon, pipeter de haut en bas de manière appropriée dans une autre gouttelette de milieu de culture de blastocyste préchauffée et équilibrée recouverte d’huile minérale à l’aide d’une pipette à stripper jusqu’à ce que les cellules de cumulus soient complètement éliminées.
      NOTA : Toutes les cellules de cumulus attachées devaient être complètement retirées le jour 3 avant que l’embryon ne soit transféré de la plaque de milieu de culture au stade de clivage à la plaque de milieu de culture au stade de blastocyste. Toutes les cellules de cumulus restantes interféreront dans l’analyse finale et donneront des résultats faussement négatifs.
  7. Deux options pour la collecte des milieux de culture
    REMARQUE : Le centre de FIV peut choisir l’une des deux méthodes de collecte des milieux de culture en fonction des ressources, des demandes et des préférences du centre.
    1. Option 1 : Lavage et culture d’embryons
      REMARQUE : Cette option est destinée aux laboratoires de FIV qui effectuent la vitrification le matin du jour 5.
      1. Transférer l’embryon dans des microgouttelettes préchauffées (37 °C) de milieu de culture et laver délicatement chaque embryon en série dans 3 microgouttelettes par pipetage au jour 4 après-midi.
      2. Transférer chaque embryon dans une microgouttelette unique préchauffée (37 °C) de milieu de culture pour le prélèvement d’échantillons. Le volume d’une seule gouttelette de milieu de culture ne peut pas dépasser 25 μL.
      3. Réaliser une culture d’embryons de blastocyste le jour 5/jour 6 à 37 °C, 5 % de CO 2 et 5 % d’O2.
    2. Option 2 : Lavage et culture d’embryons
      REMARQUE : Cette option est destinée aux laboratoires de FIV qui effectuent la vitrification le jour 5 après-midi ou le jour 6.
      1. Transférer l’embryon dans des microgouttelettes préchauffées (37 °C) de milieu de culture de 10 à 15 μL et laver délicatement chaque embryon en série dans 3 microgouttelettes par pipetage au jour 5.
      2. Transférer chaque embryon dans une microgouttelette unique préchauffée (37 °C) de milieu de culture pour le prélèvement d’échantillons. Le volume d’une seule gouttelette de milieu de culture ne peut pas dépasser 15 μL.
      3. Réaliser une culture d’embryons de blastocyste le jour 5/jour 6 à 37 °C et 5 % de CO2.
  8. Prélèvement d’échantillons
    1. Ajustez doucement l’ICM à une distance considérable du point ciblé du faisceau laser, qui se concentre sur la jonction cellulaire du trophectoderme pour générer un petit trou dans le trophectoderme afin de libérer le liquide de la cavité du blastocèle. Ensuite, les embryons sont déplacés vers une solution de congélation pour la cryoconservation selon le processus conventionnel.
    2. Transférer le milieu de culture de chaque embryon en culture dans un tube PCR sans RNase/DNase contenant 5 μL de tampon de lyse cellulaire.
    3. Recueillir la même quantité de milieu de culture sans être utilisé pour la culture d’embryons comme témoin négatif. Congeler immédiatement tous les échantillons prélevés dans de l’azote liquide, puis les conserver à −80 °C après avoir été prélevés jusqu’à ce qu’ils soient soumis au test NICS.
  9. Effectuez la vitrification comme décrit dans le protocole.

3. Protocole 2 : Construction d’une bibliothèque

  1. Lyse du milieu de culture
    1. Diluer 1 μL de témoin positif (10 ng d’ADNg humain) avec 199 μL de milieu de culture frais. Bien mélanger et centrifuger brièvement le tube (200 x g pendant 5 s).
    2. Transférer 10 μL de milieu de culture de blastocyste de 5 jours à 6 jours, de témoin positif dilué et de milieu de culture frais dans de nouveaux tubes PCR de 0,2 mL.
    3. Ajouter 1 μL de MT Enzyme Mix dans chaque tube PCR et bien mélanger par pipetage et centrifugation immédiatement pendant 2-3 s à 200 x g.
    4. Placez le(s) tube(s) PCR de l’étape 3.1.3 dans une station de préparation d’échantillons NICS préchauffée et exécutez le programme de lyse comme suit : 10 min à 75 °C ; 4 min à 95 °C ; à 22 °C.
      REMARQUE : La station de préparation des échantillons est comparable à une machine PCR standard.
      1. Cliquez sur l’icône Lysis pour accéder à l’écran de configuration.
      2. Sélectionnez Tube pour le mode de contrôle ; entrée 10 μL pour le volume de l’échantillon ; sélectionnez Activé pour le contrôle du couvercle chauffant et entrez 105 °C pour la température. Sélectionnez Non pour Pause lors de la première séquence. Cliquez sur OK pour continuer.
      3. Patientez jusqu’à ce que l’heure de repos affiche -- :--  :--, qui indique la fin du programme, puis cliquez sur Arrêter pour arrêter le programme.
    5. Arrêtez le programme une fois le processus terminé. Passez immédiatement à l’étape suivante.
  2. Préparation préalable à la bibliothèque
    1. Décongeler le tampon pré-lib jusqu’à ce qu’il soit RT. Bien mélanger par pipetage et centrifuger immédiatement pendant 2 à 3 s à 200 x g.
    2. Préparez un mélange maître pour la réaction de pré-bibliothèque comme suit : ajoutez 2 μL de mélange enzymatique Pre-Lib à 60 μL de tampon Pre-Lib, mélangez bien la réaction et centrifugez brièvement.
    3. Ajouter 60 μL de mélange réactionnel de pré-bibliothèque dans chaque échantillon de milieu prétraité de l’étape précédente. Bien mélanger par pipetage et centrifuger immédiatement pendant 2-3 s à 200 x g.
    4. Placez le(s) tube(s) PCR de l’étape 3.2.3 dans la station de préparation des échantillons et exécutez le programme de prébibliothèque comme suit : 95 °C pendant 2 min ; 12 cycles de 15 °C pendant 40 s, 22 °C pendant 40 s, 33 °C pendant 30 s, 65 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 40 s, 95 °C pendant 10 s et 63 °C pendant 10 s ; et maintenir à 4 °C.
      1. Cliquez sur l’icône Pre_Lib pour accéder à l’écran de configuration.
      2. Sélectionnez Tube pour le mode de contrôle ; entrée 70 μL pour le volume de l’échantillon ; sélectionnez Activé pour le contrôle du couvercle chaud et entrez 105 °C pour la température. Sélectionnez Non pour Pause lors de la première séquence. Cliquez sur OK pour continuer.
      3. Patientez jusqu’à ce que l’heure de repos affiche -- :--  :--, qui indique la fin du programme, puis cliquez sur Arrêter pour mettre fin au programme.
    5. Arrêtez le programme lorsque le processus est terminé. Passez immédiatement à l’étape suivante.
  3. Préparation de la bibliothèque
    1. Décongeler le tampon de la bibliothèque jusqu’à ce qu’il soit RT. Bien mélanger par pipetage et centrifuger immédiatement pendant 2 à 3 s à 200 x g.
    2. Préparez un mélange maître pour la réaction de la bibliothèque comme suit : ajoutez 1,6 μL de mélange enzymatique de bibliothèque à 60 μL de tampon de bibliothèque, mélangez bien la réaction et centrifugez brièvement.
    3. Ajouter 60 μL de mélange réactionnel de bibliothèque et 2 μL d’apprêt pour codes-barres à chaque produit de prébibliothèque à partir de l’étape 3.2.3. Mélangez bien la réaction et centrifugez brièvement.
    4. Placez le(s) tube(s) PCR de l’étape 3.2.3 dans le thermocycleur et exécutez le programme de préparation de la bibliothèque comme suit : 94 °C pendant 30 s ; 17 cycles de 94 °C pendant 25 s, 62 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 45 s) ; puis maintenir à 4 °C.
      1. Cliquez sur l’icône Lib_Prep pour accéder à l’écran de configuration.
      2. Sélectionnez Tube pour le mode de contrôle ; entrée 130 μL pour le volume de l’échantillon ; sélectionnez Activé pour le contrôle du couvercle et entrez 105 °C pour la température correspondante. Sélectionnez Non pour Pause lors de la première séquence. Cliquez sur OK pour continuer.
      3. Patientez jusqu’à ce que l’heure de repos affiche -- :--  :--, qui indique la fin du programme, puis cliquez sur Arrêter pour mettre fin au programme.
  4. Purification de la bibliothèque
    1. Retirer Magbeads du stockage à une température de 2 à 8 °C pendant au moins 20 minutes avant l’étape de purification. Vortex et mélanger les Magbeads pendant 20 s. Distribuez suffisamment de billes pour l’étape de purification dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml et réchauffez les billes jusqu’à ce qu’elles soient RT.
    2. Ajoutez 1x Magbeads dans chaque bibliothèque. Mélanger en pipetant de haut en bas ≥10 fois et incuber à RT pendant 5 min.
      REMARQUE : Par exemple, ajoutez 100 μL de Magbeads à 100 μL d’échantillon de bibliothèque.
    3. Après l’incubation, centrifugez brièvement le tube et placez-le sur un support magnétique.
    4. Attendez environ 5 minutes jusqu’à ce que la solution devienne claire. Tout en gardant le tube sur le support magnétique, aspirez soigneusement la solution et jetez-la.
    5. Ajoutez 200 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé dans le tube. Incuber à RT pendant 30 s et retirer délicatement le surnageant. Répétez l’opération une fois de plus.
    6. Retirez l’éthanol aussi complètement que possible. Séchez les perles à l’air libre sur le support magnétique pendant environ 5 à 10 minutes à RT.
    7. Retirez le tube du support magnétique, ajoutez 17,5 μL de tampon d’élution et faites vortex le tube pour remettre les billes en suspension. Centrifuger brièvement le tube et incuber à RT pendant 5 min.
    8. Placez le tube sur le support magnétique et attendez que la solution devienne claire. Transférez délicatement 15 μL de surnageant dans un nouveau tube.
  5. Quantification de la bibliothèque
    1. Quantifier les banques purifiées à l’aide du fluorimètre conformément au guide d’utilisation des kits de test qubit dsDNA HS28. Le rendement des bibliothèques varie de ~15 à 300 ng.
  6. Mise en commun des bibliothèques
    1. Utilisez 10 nanogrammes de chaque échantillon de bibliothèque pour la mise en commun.
  7. Séquençage
    1. Reportez-vous au guide d’utilisation du séquençage (15027617 v01)29.
    2. Des séquences de bibliothèque purifiées de 50 pb à une seule extrémité de la plate-forme ont donné environ 2 millions de lectures pour chaque échantillon, et une profondeur de séquençage de 0,03 × a été recommandée.
  8. Analyse des données
    1. Entrez le nom et le mot de passe de l’utilisateur sur la page de connexion
    2. Après vous être connecté au système, cliquez sur Analyse et une nouvelle page apparaîtra. Cliquez sur Créer une soumission sous l’onglet NICS-A. Ensuite, choisissez NGS pour la plate-forme, sélectionnez corporation, choisissez NICSInst pour le réactif, entrez les informations du projet dans la zone sous ID de projet, définissez les préférences d’analyse et téléchargez les fichiers. Une fois que tous les fichiers de séquençage ont été téléchargés, cliquez sur Envoyer pour lancer l’analyse (Figure 3A).
    3. Cliquez sur Afficher les soumissions pour afficher la liste des projets soumis. Une fois l’analyse terminée, le statut d’un projet devient Terminé et un bouton Afficher apparaît dans le champ du rapport. Cliquez sur le bouton Afficher pour afficher le tableau récapitulatif de l’analyse NICS (Figure 3B).
    4. Cliquez sur le bouton Export report (Exporter le rapport ) pour enregistrer les rapports (Figure 3C).
      REMARQUE : Trois types de fichiers seront exportés pour chaque analyse. Un fichier graphique qui comprend tous les tracés de variation du nombre de copies (CNV) pour chaque chromosome et génome entier, qui sera stocké dans le dossier « graph » ; une feuille de calcul qui contient les détails de l’exemple de contrôle qualité de cette exécution d’analyse ; un fichier document qui contient les rapports NICS personnalisés par l’utilisateur ; et une feuille de calcul qui contient l’exemple d’informations récapitulatives de cette exécution d’analyse.

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Résultats

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La présente étude a appliqué la méthode proposée à un patient. L’approbation de la CISR et le consentement éclairé ont été obtenus avant l’application de l’analyse NICS. La présente étude a permis d’obtenir 6 blastocystes de patients et d’effectuer un NICS sur les 6 embryons du milieu du jour 4 au jour 5. Des anomalies chromosomiques causées par la translocation équilibrée des parents ont été détectées dans cinq des chromosomes avec le test NICS ; par conséquent, ils ne pouvaient pas être utilisés pour le transfert (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modifications et dépannage

Si les résultats du NICS sont contaminés par du matériel génétique parental, assurez-vous que toutes les cellules cumulus-corona radiata sont retirées et assurez-vous que l’ICSI est effectuée pour la fécondation. Les processus inadéquats de stockage du milieu ou de préparation des modèles sont évités, ce qui peut dégrader l’ADN. L’espace de travail a été purifié en profondeur avec des réactifs de décontamination DNase et RNase. Pour éviter la contami...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang et Sijia Lu sont des employés de Yikon Genomics Co., Ltd.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier Shiping Bo et Shujie Ma pour leur aide dans l’analyse des données NGS. Financement : ces travaux ont été financés par le Programme national de recherche et de développement clé (subvention n° 2018YFC1003100).

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Matériaux

Il est recommandé d’utiliser un kit de préparation de bibliothèque le de de

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
tube EP de 1,5 ml, un tube PCR de 0,2 mlAxygenMCT-150-C, un tube PCR-02-Csans DNase/RNase, un tube PCR à faible liaison et des tubes micro-centrifugeurs de 1,5 ml.
10 et micro ; L, 200 et micro ; L, 1000 et micro ; L DNase /RNase Free TipsAxygenT-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-SCela peut être remplacé par une autre marque/Pour le transfert d’échantillons
100 % éthanolSinopharm Chemical10009218Cela peut être remplacé par une autre marque/Pour la purification de la bibliothèque d’ADN
Barcode Primer1-48Yikon GenomicsRéactif dans NICSInstPour l’amplification de bibliothèque
BD Falcon Organ Culture Dish, StérileBD Bioscience363037Cela peut être remplacé par une autre marque / Pour la culture d’embryons
Boîtes de culture de tissus BD Falcon (Easy Grip) , StérileBD Bioscience353001Cela peut être remplacé par une autre marque / Pour la culture d’embryons
Boîtes de culture de tissus BD Falcon, StérileBD Bioscience353002Cela peut être remplacé par une autre marque / Pour la culture d’embryons
Tampon de lyse cellulaireYikon Réactif génomiquedans le NICSInst kit de préparation de banquePour le prétraitement du milieu de culture
Enzyme de lyse cellulaireYikon GenomicsRéactif dans le NICSIkit de préparation de la banque Pourprétraitement du milieu de culture
Logiciel ChromGoYikon Genomics Analyse desdonnées
CMPure MagbeadsYikon GenomicsRéactif dans le NICSIkit de préparation de la bibliothèque NstPour la purification de la bibliothèque
Cryotop open systerm  ; KITAZATO BioPharma81110Peut être remplacé par une autre marque/Pour la vitrification
l’embryon Distiller de l’eauYikon GenomicsRéactif dans le NICSInst kit de préparation de la banquePour dissoudre l’ADN
ES (kit de vitrification)  ; KITAZATO BioPharmaKit d’invitrification de réactifsCeci peut être remplacé par une autre marque/Pour la vitrification embryonnaire
HOLDNIGORIGIOMPH-MED-35Peut être remplacé par une autre marque
/Pour solution ICSI
Hyaluronidase, 80 U/mLSAGEART4007-APeut être remplacé par une autre marque/Digest ovocyte-corona-cumulus
complexe ICSIORIGIOMPH-35-35Celui-ci peut être remplacé par une autre marque/Pour ICSI
Illumina MiSeq® ; SystèmeIlluminaSY-410-1001Pour le séquençage de la banque
IncubateurLabotectInkubator C16Il peut être remplacé par une autre marque/Pour la culture embryonnaire
Tampon de bibliothèqueYikon GenomicsReagent dans le NICSInst Kit de préparation de la banquePour l’amplification de la bibliothèque
Mélange d’enzymes de la bibliothèqueYikon Réactif de génomiquedans le NICSIkit de préparation de la bibliothèquepour la bibliothèque amplificaton
Support magnétiqueDynaMagTM-212321DPour la purification de la bibliothèque
MicroscopeOLYMPUS1X71Celui-ci peut être remplacé par une autre marque/Pour l’observation de l’embryon
Mini-centrifugeuseESSENSCIENELF6Pour la séparation
MT Enzyme MixYikon GenomicsRéactif dans le NICSInst kit de préparation de la banquePour le prétraitement du milieu de culture
NICSInst kit de préparation de bibliothèqueYikon GenomicsKT1000800324Amplification du génome entier et construction de bibliothèque
NICSInst Sample Prep StationYikon Genomics  ; ME1001003Amplification de l’ADN
Nunc IVF Plat à 4 puitsThermo Scientific144444Peut être remplacé par une autre marque/Pour le lavage d’embryons et la culture de blastocystes
PasteurPipette Oirgio  ; MXL3-IND-135Peut être remplacé par une autre marque/Pour les
pipettes PasteurORIGIOPP-9-1000Pour un laboratoire de FIV
Tampon Pre-LibYikon GenomicsRéactif dans NICSInst Kit de préparation de banquePré-bibliothèque Réactif
génomique de l’enzyme Pre-Lib Yikondans NICSInst Kit de préparation de banquePré-bibliothèque Préparation de la banque
Fluorimètre Qubit® ; 3.0Thermo ScientificQ33216Pour la quantification de la bibliothèque
Quinn’s Advantage Blastocyste MediumSAGEART-1029Pour la culture au stade du blastocyste embryonnaire
Quinn’s Advantage MediumSAGE ART-1026Il peut être remplacé par une autre marque/Pour la culture au stade du clivage de l’embryon
Quinn’s Advantage Fertilisation MediumSAGEART-1020Peut être remplacé par une autre marque/Pour la fécondation des ovocytes et des spermatozoïdes
Quinn’s Advantage m-HTF Medium avec HEPESSAGEART-1023Il peut être remplacé par une autre marque/Pour le clutrure embryonnaire
Quinn’s Advantage SPS Kit de substitution de protéines sériquesSAGEART-3010Peut être remplacé par une autre marque/Pour dénuder l’ovocyte
Quinn’s Advantage Huile minérale de culture tissulaireSAGEART-4008PPeut être remplacée par une autre marque/Pour couvrir le milieu de culture
STRIPPER TIPSORIGIOMXL3-IND-135Peut être remplacée par une autre marque/Pour dénuder les cellules de granulosa
Vitrification Cryotop Open systermKIZTAZATO81111Peut être remplacée par une autre marque/Pour la vitrification d’embryons
Kitde vitrification  ; KITAZATO BioPharmaVT101Peut être remplacé par une autre marque/Pour la vitrification d’embryons
VortexerQilinbeierDNYS8Mélange d’échantillons
VS (kit de vitrification)  ; KITAZATO BioPharmaKit d’invitrification de réactifsCela peut être remplacé par une autre marque/Pour la vitrification d’embryons
ZILOS-tk Système laserHamilton ThorneCLASSE 1 LaserCela peut être remplacé par une autre marque/Pour l’effondrement artificiel du blastocèle

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
  3. Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
  4. Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
  5. Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
  6. Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
  8. Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24(2012).
  9. Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075(2016).
  10. Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  11. Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
  12. Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117(2013).
  13. Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
  14. Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
  15. Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
  16. Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
  17. Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
  18. Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicine. 94 (12), e669(2015).
  19. Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
  20. Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  21. Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
  22. Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid? Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
  23. Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262(2018).
  24. Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275(2018).
  25. Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
  26. Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter's syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
  27. Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
  28. Thermo Fisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015).
  29. Miseq system use guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html (2016).
  30. Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
  31. Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
  32. Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
  33. Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
  34. Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244(2020).

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis.
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options.
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

Mots-clés

D pistage chromosomique non invasifamplification du g nome entierpr paration de biblioth quess quen age de nouvelle g n rationmilieu de culture embryonnaired tection d aneuplo dies

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