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Article de méthode

Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour les analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de mont entier

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DOI :

10.3791/62620

⸱

14 août 2021

 ,  , 
1Developmental Biology Laboratory, Histology and Embryology Department, Faculty of Medicine, Universidad de la República, 2Cell and Molecular Neurobiology Laboratory, Clemente Estable Biology Research Institute (IIBCE), Ministerio de Educación y Cultura

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La capacité de détecter avec précision les composants neuromusculaires de jonction est cruciale en évaluant les modifications de son architecture en raison des processus pathologiques ou développementaux. Nous présentons ici une description complète d’une méthode simple pour obtenir des images de haute qualité de jonctions neuromusculaires à montage entier qui peuvent être utilisées pour effectuer des mesures quantitatives.

Résumé

La jonction neuromusculaire (NMJ) est un point de contact spécialisé entre le nerf moteur et le muscle squelettique. Cette synapse périphérique présente une plasticité morphologique et fonctionnelle élevée. Dans de nombreux désordres de système nerveux, NMJ est une cible pathologique tôt ayant pour résultat l’échec de neurotransmission, la faiblesse, l’atrophie, et même dans la mort de fibre musculaire. En raison de sa pertinence, la possibilité d’évaluer quantitativement certains aspects de la relation entre les composants NMJ peut aider à comprendre les processus associés à son assemblage / démontage. Le premier obstacle lorsque vous travaillez avec les muscles est d’acquérir l’expertise technique pour identifier et disséquer rapidement sans endommager leurs fibres. Le deuxième défi consiste à utiliser des méthodes de détection de haute qualité pour obtenir des images NMJ qui peuvent être utilisées pour effectuer des analyses quantitatives. Cet article présente un protocole étape par étape pour disséquer le longus de digitorum d’extenseur et les muscles de soleus des rats. Il explique également l’utilisation de l’immunofluorescence pour visualiser les éléments pré et postsynaptiques des NMJs à montage entier. Les résultats obtenus démontrent que cette technique peut être utilisée pour établir l’anatomie microscopique de la synapse et identifier des changements subtils dans le statut de certains de ses composants dans des conditions physiologiques ou pathologiques.

Introduction

La jonction neuromusculaire du mammifère (NMJ) est une grande synapse cholinergique tripartite composée de la terminaison nerveuse du motoneurone, de la membrane postsynaptique sur la fibre musculaire squelettique et des cellules terminales de Schwann1,2,3. Cette synapse présente une plasticité morphologique etfonctionnelle élevée4,5,6,7,8,même à l’âge adulte lorsque les NMJ peuvent subir des modifications structurelles dynamiques. Par exemple, certains chercheurs ont montré que les terminaisons nerveuses motrices changent continuellement de forme à l’échelle micrométrique9. Il a également été rapporté que la morphologie du NMJ répond aux exigences fonctionnelles, à l’utilisation altérée, au vieillissement, à l’exercice ou aux variations de l’activité locomoteur4,10,11,12,13,14,15. Ainsi, l’entraînement et le manque d’utilisation représentent un stimulus essentiel pour modifier certaines caractéristiques du NMJ, telles que sa taille, sa longueur, la dispersion des vésicules synaptiques et des récepteurs, ainsi que la branche terminale nerveuse14,16,17,18,19,20.

En outre, il a été démontré que tout changement structurel ou dégénérescence de cette jonction vitale pourrait entraîner la mort cellulaire des motoneurones et l’atrophie musculaire21. On le pense également que la communication changée entre les nerfs et les muscles pourrait être responsable des changements physiologiques relatifs à l’âge nmj et probablement de sa destruction dans des états pathologiques. Le démantèlement de la jonction neuromusculaire joue un rôle crucial dans l’apparition de la sclérose latérale amyotrophique (SLA), une maladie neurodégénérative qui constitue l’un des meilleurs exemples d’interaction muscle-nerf altérée3. Malgré les nombreuses études menées sur le dysfonctionnement des motoneurones, on débat encore si la détérioration observée dans la SLA se produit en raison des dommages directs dans le motoneurone puis s’étend aux projections cortico-spinales22; ou si elle doit être considérée comme une axonopathie distale où la dégénérescence commence dans les terminaisons nerveuses et progresse vers les somas des motoneurones23,24. Compte tenu de la complexité de la pathologie de la SLA, il est logique de considérer qu’un mélange de processus indépendants se produit. Comme NMJ est l’acteur central de l’interaction physiopathologique entre le muscle et le nerf, sa déstabilisation représente un point pivot dans l’origine de la maladie qui est pertinent à analyser.

Le système neuromusculaire du mammifère est fonctionnellement organisé en unités motrices discrètes, composées d’un motoneurone et des fibres musculaires qui sont exclusivement innervées par sa borne nerveuse. Chaque unité motrice possède des fibres ayant des propriétés structurelles et fonctionnelles similaires ou identiques25. Le recrutement sélectif des motoneurones permet d’optimiser la réponse musculaire aux exigences fonctionnelles. Maintenant, il est clair que les muscles squelettiques des mammifères sont composés de quatre types de fibres différents. Certains muscles sont nommés en fonction des caractéristiques de leur type de fibre le plus abondant. Par exemple, le soleus (un muscle postérieur du membre postérieur impliqué dans le maintien de la posture du corps) porte une majorité d’unités à contraction lente (type 1) et est reconnu comme un muscle lent. Au lieu de cela, extenseur digitorum longus (EDL) est essentiellement composé d’unités avec des propriétés de contraction rapide similaires (fibres de type 2) et est connu comme un muscle rapide spécialisé pour les mouvements phasiques nécessaires à la locomotion. En d’autres termes, bien que les muscles adultes soient plastiques dans la nature en raison des influences hormonales et neurales, sa composition en fibres détermine la capacité d’effectuer différentes activités, comme on le voit dans le soleus qui connaît une activité continue de faible intensité et l’EDL qui présente une contraction unique plus rapide. D’autres caractéristiques qui sont variables parmi les différents types de fibres musculaires sont liées à leur structure (contenu mitochondrial, extension du réticulum sarcoplasmique, épaisseur de la ligne Z), teneur en atpase de myosine, et la composition de la chaîne lourde de myosine26,27,28,29.

Pour les NMJ de rongeurs, il existe des différences significatives entre les muscles28,29. Les analyses morphométriques réalisées dans le soleus et l’EDL chez le rat ont indiqué une corrélation positive entre le secteur synaptique et le diamètre de fibre (c.-à-d., le secteur synaptique dans les fibres lentes de soleus est plus grand que dans les fibres rapides EDL) mais le rapport entre le secteur NMJ et la taille de fibre est semblable dans les deux muscles30,31. En outre, en ce qui concerne les bornes nerveuses, les zones absolues de la plaque d’extrémité dans les fibres de type 1 étaient plus faibles que dans les fibres de type 2, tandis que la normalisation par diamètre de la fibre a fait des zones de bornes nerveuses dans les fibres de type 1 les plus grandes32.

Cependant, très peu d’études se concentrent sur l’analyse morphométrique pour montrer la preuve de changements dans certaines des composantes NMJ33,34. Ainsi, en raison de la pertinence du NMJ dans la fonction de l’organisme, dont la morphologie et la physiologie sont altérées dans diverses pathologies, il est important d’optimiser les protocoles de dissection de différents types de muscles avec une qualité suffisante pour permettre la visualisation de l’ensemble de la structure NMJ. Il est également nécessaire d’évaluer l’apparition de changements pré ou postsynaptiques dans différentes situations ou conditions expérimentales telles que le vieillissement ou l’exercice35,36,37,38. En outre, il peut être utile de mettre en évidence des altérations plus subtiles des composants nmj tels que la phosphorylation altérée de neurofilament dans les terminaisons nerveuses terminales comme indiqué dans la SLA39.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives de la loi nationale n ° 18611 pour le soin des animaux utilisés à des fins expérimentales. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel d’éthique (CEUA IIBCE, protocole n° 004/09/2015).

1. Dissection musculaire (Jour 1)

NOTA : Avant de commencer, faire 40 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 0,5 %, pH 7,4 dans la solution saline phosphate (DPBS) de Dulbecco. En option, faire 20 mL de 4% PFA. Préparer des aliquotes de 5 mL et congeler à -20 °C. Le jour de la dissection, décongeler une partie aliquote de 4 % et ajouter 35 mL de DPBS pour obtenir 40 mL de PFA à 0,5 %.

  1. Isolement de l’EDL (muscle à contraction rapide)
    1. Euthanasier un rat. Placez l’animal avec l’abdomen tourné vers le haut. Faites une incision initiale à l’aide d’une lame chirurgicale entre les orteils vers le membre postérieur.
      REMARQUE: Dans ce cas, une injection intrapéritonéale de 90:10 mg/ Kg de kétamine: xylazine a été administrée pour euthanasier le rat, mais d’autres options d’anesthésie sont également autorisées.
    2. Décollez la peau, en la tirant vers le haut jusqu’à ce que le genou du rat soit exposé.
    3. Pour trouver l’EDL, suivez les tendons du pied jusqu’au ligament annulaire. Ce ligament entoure deux tendons. Couper le ligament entre les deux tendons avec des ciseaux unibandes (ou similaire). Identifiez le tendon EDL en soulevant les deux et choisissez celui qui fait bouger les toteils vers le haut.
    4. Couper le tendon avec des ciseaux unibandes. Puis, tout en tenant le tendon avec une pince à épiler biologique fine, commencez à séparer lentement le muscle EDL du tibialis antérieur, du peroneus brevis et du peroneus longus40 (voir la figure 1A).
      REMARQUE: Assurez-vous que le muscle est séparé sans aucun dommage. Pour ce faire, coupez le reste des muscles latéraux pour ouvrir un chemin entre eux (le CAR n’a pas d’emplacement superficiel) tout en maintenant et en soulevant le muscle LED.
    5. Pour isoler complètement le muscle, coupez le tendon attaché au genou du rat avec des ciseaux unibandes.
    6. Immerger le muscle disséqué dans 5 mL de PFA à 0,5 % et laisser pendant 24 h à 4 °C. En option, agrafez le muscle dans un morceau de carton et tournez-le avec le muscle tourné vers le bas. Puis immerger complètement dans 8 mL de la solution fixatrice. Cette étape aide à maintenir le muscle allongé pendant le processus de fixation.
  2. Isolement du soleus (muscle à contraction lente)
    1. Retournez l’animal (l’abdomen est maintenant tourné vers le bas). À travers la peau, coupez le tendon calcanéal à l’aide d’une lame chirurgicale.
    2. À l’aide de la pince à épiler biologique et des ciseaux unibandes, séparez le muscle gastrocnémien des os, créant ainsi un « couvercle musculaire ». Le soleus sera sur le côté interne du couvercle musculaire. Il peut être identifié car il est de couleur rouge et a une morphologie plate.
    3. À l’avec une pince à épiler biologique, atteignez et soulevez le tendon du soleus qui se trouve au-dessus du gastrocnémien (voir la figure 1B).
    4. Couper le tendon avec des ciseaux unibandes. Soulevez tout le muscle tout en coupant certains des points d’attache faibles (c.-à-d. les éléments neurovasculaires). Enfin, pour libérer complètement le muscle soleus, coupez le fascicule du soleus qui forme le tendon calcanéal avec des ciseaux unibandes.
    5. Répétez l’étape 1.1.6 pour fixer le muscle du soleus disséqué.

2. Préparation de fibres taquinées (Jour 2)

  1. Après 24 h de fixation, rincer les muscles avec 6 mL de solution de DPBS 3x pendant 10 min chacun avant d’isoler les fibres musculaires.
  2. Pour isoler les fibres, mettez un muscle sur une lame de microscope. À l’aide d’un stéréomicroscope, maintenez doucement l’un des tendons avec une paire de pinces biologiques. Ensuite, avec les autres pinces biologiques, commencez à pincer le tendon lentement pour séparer les fibres musculaires. Après cela, tirez lentement le tissu pincé vers le haut vers le tendon musculaire opposé. Il sera nécessaire de répéter cette action plusieurs fois jusqu’à obtenir plusieurs petits faisceaux isolés.
  3. Placez-les soigneusement sur une lame prétrâturée (silanisée). Il est nécessaire de garder toutes les fibres en ordre afin qu’elles ne se chevauchent pas. À ce stade, sécher à l’air les fibres pendant 24 h.

3. Immunofluorescence

  1. Incubation d’anticorps primaires (jour 3)
    NOTA : Toutes les étapes ont été effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Le moyen le plus efficace d’éliminer les différentes solutions sans détacher les fibres de la lame est d’utiliser une seringue à insuline.
    1. Pour commencer le processus d’immunomarquage, entourez les fibres musculaires isolées séchées d’un stylo pap pour créer une barrière imperméable.
    2. Pour hydrater les fibres musculaires, ajoutez 200 μL d’eau distillée pendant 5 min, puis changez l’eau en 200 μL de DPBS pour les 5 prochaines minutes d’incubation. À ce stade, commencez le étiquetage par immunofluorescence.
    3. Incuber des fibres avec 300 μL d’un tampon de blocage (BB) contenant 50 mM de glycine, 1% BSA et 1% Triton X-100 pendant 30 min.
    4. Remplacer BB par l’anticorps primaire à une concentration suggérée par les fabricants. Utilisez le BB pour diluer l’anticorps. Cette expérience a utilisé 400 μL de SMI 32 ou SMI 31 qui a reconnu le neurofilament H non phosphorylé (Nf) ou phosphorylé (Phos-Nf) à dilution 1/800 pour détecter le composant présynaptique NMJ.
      REMARQUE: Lorsque vous décidez de reconnaître l’élément présynaptique entier au lieu d’évaluer la phosphorylation du neurofilament, choisissez des anticorps contre la synapsine, la synaptophysine ou le SV2a qui ont été précédemment utilisés avec succès.
    5. Incuber les fibres avec la dilution de l’anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit (éventuellement, l’incubation peut être effectuée à 37 °C pendant 1 h). Dans les deux cas, il sera important d’effectuer l’incubation à l’aide d’une chambre humide.
  2. Immunofluorescence : Incubation d’anticorps secondaires (jour 4)
    1. Retirer l’anticorps primaire et rincer les fibres 3x pendant 10 min chacune avec 500 μL de DPBS et la dernière fois avec BB.
    2. Retirez ce dernier lavage et ajoutez l’anticorps secondaire marqué par fluorescence dilué dans BB. Pour cette expérience, 500 μL d’Alexa Fluor 488 anti-souris chèvre à dilution 1/1000 dans BB ont été utilisés. Pour visualiser l’élément postsynaptic des NMJs, 1:300 conjugué biotine-XX de α-Bungarotoxin (Btx) a été ajouté à la dilution secondaire d’anticorps.
      REMARQUE: L’ajout de Btx-biotine XX permet de meilleures images signal-bruit une fois détecté avec streptavidine qui amplifie le signal. En outre, la conjugaison de streptavidine à différents fluorophores a augmenté des combinaisons de couleurs dans des essais de co-étiquetage. Alternativement, Btx marqué par fluorescence permet d’obtenir des images de qualité similaire.
    3. Incuber l’anticorps secondaire et le Btx pendant 2 h à température ambiante ou 1 h à 37 °C à l’abri de la lumière.
    4. Retirer l’anticorps secondaire et le Btx. Laver 3x pendant 10 min chacun avec 500 μL de DPBS et le dernier rinçage avec BB.
    5. Incuber avec 500 μL de Streptavidin Alexa Fluor 555 à dilution 1/1000 avec BB pendant 1 h à température ambiante. À ce stade, si vous le souhaitez, ajoutez une sonde pour contre-enfâliner les noyaux, comme le diaminophényllindole à une concentration finale de 1 μg/mL.
    6. Retirer la solution d’incubation et laver les fibres 3x pendant 10 min chacune avec 500 μL de DPBS. Ensuite, montez les fibres.
  3. Montage
    1. Placez 4 points de vernis à ongles transparent sur la lame du microscope comme s’il s’agissait des sommets d’un carré. Laissez-les sécher 1-2 min. Ce seront les points où les lamelle se reposeront, aidant à éviter l’écrasement des tissus.
    2. Retirez le dernier lavage DPBS et ajoutez suffisamment de supports de montage (~ 200 μL) pour couvrir les fibres; éviter le séchage.
      REMARQUE: Pour préparer 10 mL du mélange de support de montage, utilisez Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glycérol dans un 4:1 (v: v).
    3. Utilisez une pointe de pipette de 200 μL pour répartir soigneusement le support de montage sur les fibres afin d’assurer une immersion complète de toutes. Avant de placer le verre de couverture, retirez les bulles d’air.
    4. Placez la lamelle sur les échantillons en essayant d’empêcher la génération de bulles d’air. Ce mouvement peut être fait à l’aide de forceps.

4. Microscopie et analyse morphométrique

  1. Imagez les préparations de fibres taquinées à l’aide de la microscopie confocale au laser.
  2. Prenez une série de sections optiques (piles de 30 μm Z) sur l’ensemble de la synapse en utilisant un intervalle d’un micromètre. Pour définir la pile, utilisez le signal Btx. Imagez au moins 15-20 NMJs pour chaque condition musculaire avec une résolution de 2048 px x 2048 px. Cette méthode a été choisie pour obtenir des images avec une qualité optique et une résolution suffisantes pour l’analyse morphométrique.
  3. Pour effectuer les mesures, utilisez les images de projection des piles avec n’importe quel logiciel d’analyse.
    REMARQUE: Bien que l’analyse morphométrique expliquée ait été effectuée manuellement, il existe deux outils basés sur Image J récemment développés pour étudier de nombreux aspects différents de la morphologie NMJ pré et postsynaptique33,34.
  4. Pour obtenir les valeurs de surface NMJ totales, sélectionnez la bordure externe (contour externe de la zone colorée, voir figure 2) de la plaque d’extrémité à l’aide de l’outil lasso magnétique Photoshop et déterminez le nombre de pixels sélectionnés dans la fenêtre Histogramme. Ensuite, les zones de pixels peuvent être converties en micromètres carrés à l’aide de l’échelle spécifiée par le logiciel confocal.
  5. Avec le même outil lasso, sélectionnez la bordure intérieure (contours de la zone colorée à l’intérieur de la plaque d’extrémité, voir figure 2)et déterminez la zone non colorée dans toute la structure (ou zone vide) comme détaillé ci-dessus (étape 4.4.). Les valeurs de surface postsynaptique seront obtenues après soustraction de la surface totale de la zone vide de chaque NMJ.
  6. Obtenir la zone présynaptique, qui est définie comme la zone avec l’immunofluorescence anti-neurofilament, d’une manière similaire à la zone NMJ totale.
    REMARQUE: Tous ces paramètres ont été utilisés pour déterminer l’indice de densité post-synaptique (surface postsynaptique / surface totale) et la couverture NMJ (zone présynaptique / zone postsynaptique). Un indice de densité postsynaptique plus élevé implique une plaque d’extrémité plus dense - ou plus compacte -, tandis qu’une couverture NMJ plus petite reflète une interaction beaucoup plus faible entre la borne nerveuse et la plaque d’extrémité (toutes deux compatibles avec un processus de dénervation). Dans le cas montré ici, puisque des formes phosphorylées et non phosphorylées de neurofilaments ont été détectées au niveau terminal de nerf, le rapport de signal présynaptique phosphorylé/non phosphorylé et le rapport de couverture phosphorylé/non phosphorylé ont été calculés.

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Résultats

Ce protocole offre une méthode simple pour isoler et immunostain fibres musculaires de deux types différents de muscles (muscles à contraction rapide et lente, voir figure 1). En utilisant les marqueurs et /ou sondes corrects, les composants NMJ peuvent être détectés et évalués depuis un point de vue quantitatif pour évaluer certains des changements morphologiques qui peuvent survenir à la suite de la progression de la maladie ou d’un traitement médicamenteux spécifique. Dans la présente étu...

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Discussion

En cet article, nous présentons un protocole détaillé pour la dissection de deux muscles squelettiques de rat (un lent-contraction et l’autre rapide-contraction), l’isolement de muscle de fibre et la détection d’immunofluorescence des marqueurs pre et postsynaptic pour évaluer quantitativement des changements de NMJ aussi bien que des processus d’assemblage/démontage. Ce type de protocole peut être utile dans les modèlesrongeurs 41,42 pour évaluer nmj au cours de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Un grand merci à la SIC et au PEDECIBA pour le soutien financier apporté à ces travaux; à Natalia Rosano pour ses corrections manuscrites; à Marcelo Casacuberta qui réalise la vidéo et à Nicolás Bolatto pour avoir prêté sa voix pour elle.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Stéréomicroscope avec éclairage à lumière froideNikonSMZ-10A
Plate-forme basculanteBiometra (WT 16)042-500
Lunettes de protection (24 x 32 mm)DeltalabD102432
Premium (Plus)PORLABPC-201-16
Pince à épilerF.S.T11253-20
Uniband LA-4C Ciseaux 125mmE.M.S77910-26
Lames chirurgicales dispontables #10Sakira Medical1567
Seringue stérile disponsable (1 ml)Sakira Medical1569
Super PAP styloE.M.S71310
100 &mu ; l ou 200 &mu ; l pipetteFinnpipette9400130
Microscope confocalZeissLSM 800 - AiryScan
NTac :SD-TgN(SOD1G93A)L26H ratsTaconic2148-M
1X PBS (Dulbecco)Gibco21600-010
ParaformaldéhydeSigma158127
Triton X-100SigmaT8787
GlycineAmresco167
BSABio Basic INC.9048-46-8
GlycérolMallinckrodt5092
TrisAmresco497
Anti-Neurofilament H (NF-H), Anticorps phosphoryléBioLegend801601Précédemment Covance # SMI 31P
Anti-Neurofilament H (NF-H), Anticorps non phosphoryléBioLegend801701Précédemment Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 chèvre anti-Souris IgG (H+L)Thermo ScientificA11029
&alpha ;-Bungarotoxin, biotine-XX conjuguéInvitrogenB1196
Streptavidine, Alexa Fluor 555 conjuguéInvitrogenS32355
Diaminophénylindole (DAPI)SigmaD8417
Lames de microscope

Références

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