La capacité de détecter avec précision les composants neuromusculaires de jonction est cruciale en évaluant les modifications de son architecture en raison des processus pathologiques ou développementaux. Nous présentons ici une description complète d’une méthode simple pour obtenir des images de haute qualité de jonctions neuromusculaires à montage entier qui peuvent être utilisées pour effectuer des mesures quantitatives.
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Article de méthode
Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour les analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de mont entier
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La jonction neuromusculaire (NMJ) est un point de contact spécialisé entre le nerf moteur et le muscle squelettique. Cette synapse périphérique présente une plasticité morphologique et fonctionnelle élevée. Dans de nombreux désordres de système nerveux, NMJ est une cible pathologique tôt ayant pour résultat l’échec de neurotransmission, la faiblesse, l’atrophie, et même dans la mort de fibre musculaire. En raison de sa pertinence, la possibilité d’évaluer quantitativement certains aspects de la relation entre les composants NMJ peut aider à comprendre les processus associés à son assemblage / démontage. Le premier obstacle lorsque vous travaillez avec les muscles est d’acquérir l’expertise technique pour identifier et disséquer rapidement sans endommager leurs fibres. Le deuxième défi consiste à utiliser des méthodes de détection de haute qualité pour obtenir des images NMJ qui peuvent être utilisées pour effectuer des analyses quantitatives. Cet article présente un protocole étape par étape pour disséquer le longus de digitorum d’extenseur et les muscles de soleus des rats. Il explique également l’utilisation de l’immunofluorescence pour visualiser les éléments pré et postsynaptiques des NMJs à montage entier. Les résultats obtenus démontrent que cette technique peut être utilisée pour établir l’anatomie microscopique de la synapse et identifier des changements subtils dans le statut de certains de ses composants dans des conditions physiologiques ou pathologiques.
Introduction
La jonction neuromusculaire du mammifère (NMJ) est une grande synapse cholinergique tripartite composée de la terminaison nerveuse du motoneurone, de la membrane postsynaptique sur la fibre musculaire squelettique et des cellules terminales de Schwann1,2,3. Cette synapse présente une plasticité morphologique etfonctionnelle élevée4,5,6,7,8,même à l’âge adulte lorsque les NMJ peuvent subir des modifications structur....
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Protocole
Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives de la loi nationale n ° 18611 pour le soin des animaux utilisés à des fins expérimentales. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel d’éthique (CEUA IIBCE, protocole n° 004/09/2015).
1. Dissection musculaire (Jour 1)
NOTA : Avant de commencer, faire 40 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 0,5 %, pH 7,4 dans la solution saline phosphate (DPBS) de Dulbecco. En option, faire 20 mL de 4% PFA. Préparer des aliquotes de 5 mL et congeler à -20 °C. Le jour de la dissection, décongeler une partie aliquote de 4 % et ajouter 35 mL de DPBS ....
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Résultats
Ce protocole offre une méthode simple pour isoler et immunostain fibres musculaires de deux types différents de muscles (muscles à contraction rapide et lente, voir figure 1). En utilisant les marqueurs et /ou sondes corrects, les composants NMJ peuvent être détectés et évalués depuis un point de vue quantitatif pour évaluer certains des changements morphologiques qui peuvent survenir à la suite de la progression de la maladie ou d’un traitement médicamenteux spécifique. Dans la présente étu.......
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Discussion
En cet article, nous présentons un protocole détaillé pour la dissection de deux muscles squelettiques de rat (un lent-contraction et l’autre rapide-contraction), l’isolement de muscle de fibre et la détection d’immunofluorescence des marqueurs pre et postsynaptic pour évaluer quantitativement des changements de NMJ aussi bien que des processus d’assemblage/démontage. Ce type de protocole peut être utile dans les modèlesrongeurs 41,42 pour évaluer nmj au cours de.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Un grand merci à la SIC et au PEDECIBA pour le soutien financier apporté à ces travaux; à Natalia Rosano pour ses corrections manuscrites; à Marcelo Casacuberta qui réalise la vidéo et à Nicolás Bolatto pour avoir prêté sa voix pour elle.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Stéréomicroscope avec éclairage à lumière froide | Nikon | SMZ-10A | |
| Plate-forme basculante | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Lunettes de protection (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) | PORLAB | PC-201-16 | |
| Pince à épiler | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Ciseaux 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Lames chirurgicales dispontables #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Seringue stérile disponsable (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP stylo | E.M.S | 71310 | |
| 100 &mu ; l ou 200 &mu ; l pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Microscope confocal | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac :SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycérol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Anti-Neurofilament H (NF-H), Anticorps phosphorylé | BioLegend | 801601 | Précédemment Covance # SMI 31P |
| Anti-Neurofilament H (NF-H), Anticorps non phosphorylé | BioLegend | 801701 | Précédemment Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 chèvre anti-Souris IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| &alpha ;-Bungarotoxin, biotine-XX conjugué | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidine, Alexa Fluor 555 conjugué | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophénylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
Références
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neur....
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Réimpressions et autorisations
