Article de méthode

Profilage spatial de l’expression des protéines et de l’ARN dans les tissus : une approche pour affiner la microdissection virtuelle

DOI :

10.3791/62651

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6 juillet 2022

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1Department of Pathology, Genentech, 2Department of Microchemistry, Proteomics, Lipidomics & Next Generation Sequencing (MPL-NGS), Genentech, 3NanoString Technologies

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons un protocole de réglage fin des régions d’intérêt (ROI) pour les technologies Spatial Omics afin de mieux caractériser le microenvironnement tumoral et d’identifier des populations cellulaires spécifiques. Pour les tests protéomiques, des protocoles personnalisés automatisés peuvent guider la sélection du retour sur investissement, tandis que les tests transcriptomiques peuvent être affinés en utilisant des retours sur investissement aussi petits que 50 μm.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le multiplexage permet d’évaluer plusieurs marqueurs sur un même tissu tout en fournissant un contexte spatial. Les technologies Spatial Omics permettent le multiplexage des protéines et de l’ARN en exploitant respectivement les anticorps et les sondes oligo-marqués photo-clivables. Les oligos sont clivés et quantifiés à partir de régions spécifiques du tissu pour élucider la biologie sous-jacente. Ici, l’étude démontre que des protocoles automatisés de visualisation d’anticorps personnalisés peuvent être utilisés pour guider la sélection du retour sur investissement en conjonction avec les tests de protéomique spatiale. Cette méthode spécifique n’a pas montré de performances acceptables avec les tests de transcriptomique spatiale. Le protocole décrit le développement d’un test d’immunofluorescence (IF) 3-plex pour la visualisation de marqueurs sur une plate-forme automatisée, en utilisant l’amplification du signal tyramide (TSA) pour amplifier le signal fluorescent d’une cible protéique donnée et augmenter le pool d’anticorps parmi lesquels choisir. Le protocole de visualisation a été automatisé à l’aide d’un test 3-plex soigneusement validé pour assurer la qualité et la reproductibilité. En outre, l’échange de DAPI contre des colorants SYTO a été évalué pour permettre l’imagerie des tests IF basés sur TSA sur la plate-forme de profilage spatial. De plus, nous avons testé la capacité de sélectionner de petits ROI à l’aide du test de transcriptomique spatiale pour permettre l’investigation de domaines d’intérêt très spécifiques (par exemple, les zones enrichies pour un type de cellule donné). Des ROI de 50 μm et 300 μm de diamètre ont été collectés, ce qui correspond à environ 15 cellules et 100 cellules, respectivement. Les échantillons ont été transformés en bibliothèques et séquencés pour étudier la capacité de détecter les signaux provenant de petits retours sur investissement et de régions spécifiques au profil du tissu. Nous avons déterminé que les technologies de protéomique spatiale bénéficient grandement de protocoles automatisés et normalisés pour guider la sélection du retour sur investissement. Bien que ce protocole de visualisation automatisé n’était pas compatible avec les tests de transcriptomique spatiale, nous avons pu tester et confirmer que des populations cellulaires spécifiques peuvent être détectées avec succès même dans de petits retours sur investissement avec le protocole de visualisation manuelle standard.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les progrès des techniques de multiplexage continuent de fournir de meilleurs outils de caractérisation des cibles présentes dans les tumeurs. Le microenvironnement tumoral (TME) est un système complexe de cellules tumorales, infiltrant les cellules immunitaires, et de stroma, où l’information spatiale est essentielle pour mieux comprendre et interpréter les mécanismes d’interaction entre les biomarqueurs d’intérêt1. Avec des techniques émergentes telles que le GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) et 10x Visium, plusieurs cibles peuvent être détectées et quantifiées simultanément dans leur contexte spatial. L’utilisation de protocoles d’immunofluorescence qui facilitent la visualisation des tissus peut améliorer davantage les capacités de profilage spatial de ces technologies.

La technologie Spatial Omics sur laquelle nous nous sommes concentrés pour le développement de cette méthode consiste en des tests de protéomique spatiale et de transcriptomique où les oligonucléotides sont attachés à des anticorps ou à des sondes à ARN via un liant photoclivable sensible aux UV. Les lames histologiques sont marquées avec ces anticorps ou sondes oligo-conjugués, puis imagées sur la plateforme de profilage spatial. Ensuite, des ROI de différentes tailles et formes sont sélectionnés pour l’éclairage, et les oligonucléotides photoclivés sont aspirés et collectés dans une plaque de 96 puits. Les oligonucléotides photoclivés sont préparés pour être quantifiés soit avec le système Nanostring nCounter, soit avec le séquençage de nouvelle génération (NGS)2,3 (Figure 1)4,5.

Les distributions cellulaires varient au sein des tissus, et la capacité de caractériser des emplacements spécifiques des cellules à l’aide de marqueurs sélectionnés et de différentes tailles de retour sur investissement est d’une grande importance pour bien comprendre l’environnement tissulaire et identifier des caractéristiques spécifiques. Dans la technologie Spatial Omics mentionnée ici, le protocole de visualisation standard utilise des anticorps directement conjugués et est un protocole manuel. Les marqueurs standard pour distinguer la tumeur du stroma sont la pancytokératine (panCK) et CD456,7, mais des marqueurs supplémentaires sont nécessaires pour cibler des populations cellulaires spécifiques d’intérêt. De plus, l’utilisation d’anticorps fluorescents directement conjugués manque d’amplification, ce qui limite la sélection des anticorps à des marqueurs abondants. De plus, les tests manuels sont soumis à plus de variabilité que les flux de travail automatisés8. Par conséquent, il est souhaitable de disposer d’un protocole de visualisation personnalisable, automatisé et amplifié pour la sélection du retour sur investissement.

Ici, l’étude démontre que, pour les tests de protéomique spatiale, la technologie TSA peut être utilisée pour les protocoles de visualisation sur une plate-forme automatisée, ce qui permet un test plus ciblé et standardisé. En outre, les tests basés sur la TSA permettent l’utilisation de marqueurs à faible expression, augmentant ainsi la gamme de cibles pouvant être sélectionnées pour la visualisation. Un test 3-plex pour panCK, FAP et anticorps X a été développé à l’aide d’une plate-forme automatisée où panCK et FAP ont été utilisés pour différencier la tumeur et le stroma, respectivement. L’anticorps X est une protéine stromale fréquemment rencontrée dans les tumeurs, mais sa biologie et son impact sur l’immunité antitumorale ne sont pas entièrement compris. La caractérisation de la contexture immunitaire dans les zones riches en anticorps X peut élucider son rôle dans l’immunité antitumorale et la réponse thérapeutique, ainsi que son potentiel en tant que cible médicamenteuse.

Bien que les panels de visualisation automatisés personnalisés de la TSA se soient avérés efficaces pour les tests de protéomique spatiale, l’application de ces tests pour les tests de transcriptomique spatiale n’a pas pu être confirmée. Cela est probablement dû aux réactifs et au protocole utilisés pour les protocoles de visualisation automatisés, qui semblent compromettre l’intégrité de l’ARN. Reconnaître qu’un protocole d’étiquetage automatisé pour les marqueurs de visualisation peut être utilisé pour les tests de protéomique spatiale, mais pas pour les tests de transcriptomique spatiale, fournit des conseils importants sur les conceptions de tests de la technologie Spatial Omics.

De plus, l’étude démontre que le test de transcriptomique spatiale peut être utilisé pour profiler des cibles dans des régions aussi petites que 50 μm de diamètre, soit environ 15 cellules. Deux ROI de tailles différentes ont été sélectionnés pour tester la capacité du test à détecter également les transcrits dans les petits ROI. Pour chaque région d’intérêt, des oligos correspondant à 1 800 cibles d’ARNm ont été collectés et transformés en bibliothèques selon le protocole de la plateforme de profilage spatial. Les bibliothèques ont été indexées individuellement, puis regroupées et séquencées. Cela a permis d’évaluer à la fois l’efficacité de la mise en commun et la capacité d’identifier des populations cellulaires spécifiques dans de petits retours sur investissement.

Cet article montre que pour les tests de protéomique spatiale, un protocole automatisé pour guider la sélection du retour sur investissement sur des marqueurs d’intérêt spécifiques peut être utilisé pour cibler sélectivement l’interrogation des zones tissulaires pertinentes et caractériser l’environnement spatial du tissu. De plus, nous démontrons que des retours sur investissement plus petits peuvent être utilisés pour les tests transcriptomiques spatiaux afin de détecter et de caractériser des populations cellulaires spécifiques.

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Protocole

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Tous les tissus humains ont été acquis auprès de biobanques commerciales ou de banques de tissus accréditées sous garantie que l’approbation appropriée du comité d’examen institutionnel et le consentement éclairé ont été obtenus.

REMARQUE : Le protocole est exécuté à l’aide de Discovery Ultra et de GeoMx Digital Spatial Profiler. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur les réactifs, l’équipement et les logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Protocole de visualisation automatisé pour les essais de protéomique spatiale

  1. Programmer l’autocoloration pour appliquer des anticorps de visualisation fluorescente
    1. Dans le logiciel autostainer, cliquez sur le bouton d’accueil et choisissez Protocoles. Ensuite, cliquez sur Créer / Modifier des protocoles et sélectionnez RUO DISCOVERY Universal comme procédure.
    2. Cliquez sur Première séquence > Déparaffinisation > Depar v2. Pour Température moyenne, choisissez 72 °C, puis cliquez sur Prétraitement et sélectionnez Conditionnement cellulaire et réservoir CC1. Pour Very High Temperature, choisissez 100 °C, puis cliquez sur CC1 8 min et continuez à cliquer jusqu’à ce que CC1 64 Min soit sélectionné.
    3. Cliquez sur Inhibiteur > Inhibiteur DISCOVERY, et pour Temps d’incubation, choisissez 8 minutes. Ensuite, cliquez sur Antibody > High Temp Ab Incubation; pour les basses températures, choisissez 37 ° C; pour Anticorps, choisissez le numéro d’anticorps sur l’étiquette du distributeur (Anticorps 6 dans cet exemple); pour Plus le temps d’incubation, sélectionnez 32 minutes.
      REMARQUE: Ce protocole a trois numéros d’anticorps différents. Le premier anticorps est la PAF, le second est la pancytokératine et le troisième est l’anticorps X.
    4. Cliquez sur Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, puis pour Antibody Blocking, choisissez Gt Ig Block, et pour Incubation Time, choisissez 4 minutes. Ensuite, sur Multimer HRP Reagent, sélectionnez OMap anti-Rb HRP, et pour Incubation Time (Temps d’incubation), choisissez 16 minutes (Temps d’incubation). Ensuite, cliquez sur Cy5, et pour Long temps d’incubation, choisissez 0 h 8 min.
    5. Cliquez sur Dual Sequence (Séquence double ) et choisissez Antibody Denaturation (Dénaturation des anticorps), puis sélectionnez Antibody Denature CC2-1, et pour Very High Temperature (Très haute température), choisissez 100 °C. Assurez-vous que le temps d’incubation est de 8 min. Ensuite, cliquez sur Inhibiteur de DS et sélectionnez Neutraliser.
    6. Cliquez sur Anticorps DS, et pour très basse température, choisissez 37 ° C. Ensuite, dans Anticorps, choisissez le numéro d’anticorps sur l’étiquette du distributeur (Anticorps 3 dans cet exemple), et pour Plus Incubation Time, sélectionnez 32 minutes.
    7. Cliquez sur DS Multimer HRP et choisissez DS Multimer HRP Blocker. Ensuite, pour Blocage des anticorps, sélectionnez Gt Ig Block, et pour Durée d’incubation, choisissez 4 minutes. Ensuite, sur Multimer HRP Reagent, sélectionnez OMap anti-Ms HRP, et pour Incubation Time, choisissez 16 minutes. Ensuite, cliquez sur DS Rhodamine 6G, et pour un long temps d’incubation, choisissez 0 h 8 min.
    8. Cliquez sur Triple Stain et sélectionnez TS Antibody Denaturation, puis sélectionnez Antibody Denature CC2-2, et pour Very High Temperature, sélectionnez 100 °C. Assurez-vous que le temps d’incubation est de 8 min. Ensuite, cliquez sur TS Inhibitor et sélectionnez TS Neutralize.
    9. Cliquez sur TS Antibody, et pour Very Low Temperature, sélectionnez 37 °C. Ensuite, dans Anticorps, sélectionnez le numéro d’anticorps sur l’étiquette du distributeur (Anticorps 7 dans cet exemple), et pour Plus Incubation Time, sélectionnez 32 minutes.
    10. Cliquez sur TS Multimer HRP et choisissez TS Multimer HRP Blocker. Ensuite, pour Blocage des anticorps, sélectionnez Gt Ig Block, et pour Durée d’incubation, choisissez 4 minutes. Ensuite, sur Multimer HRP Reagent, sélectionnez OMap anti-Rb HRP, et pour Incubation Time (Temps d’incubation), choisissez 16 minutes (Temps d’incubation). Ensuite, cliquez sur TS FAM, et pour Long Incubation Time, choisissez 0 Hr 8 Min.
    11. Ajoutez un titre au protocole. Sélectionnez un numéro de protocole, ajoutez un commentaire et cliquez sur Actif suivi de Enregistrer.
  2. Préparer des diapositives, imprimer des étiquettes et démarrer l’exécution de la coloration automatique
    1. Le vendeur de pâtisserie s’est procuré des coupes de tissus humains FFPE (fixées au formol, incorporées à la paraffine) dans un four réglé à 70 °C pendant 20 à 60 minutes. Pendant la cuisson des diapositives, imprimez les étiquettes en cliquant sur Créer une étiquette dans le logiciel de coloration automatique. Ensuite, cliquez sur Protocoles, sélectionnez le numéro de protocole, puis cliquez sur Fermer/Imprimer. Ajoutez les informations pertinentes sur l’étiquette de la diapositive et cliquez sur Imprimer.
    2. Retirez les lames du four et laissez-les refroidir à température ambiante (RT). Appliquez les étiquettes de protocole précédemment imprimées aux diapositives correspondantes.
    3. Charger les distributeurs d’anticorps rechargeables avec des anticorps conformément au numéro d’étiquette d’anticorps attribué à l’étape 1.1. Dans ce protocole, utilisez l’anticorps 6 pour la PAF à 1 μg/mL, utilisez l’anticorps 3 pour la pancytokératine à 0,1 μg/mL et utilisez l’anticorps 7 pour l’anticorps X à 2,5 μg/mL. Diluer chaque anticorps dans le diluant spécifié et amorcer les distributeurs d’anticorps rechargeables.
    4. Rassemblez les distributeurs de réactifs préremplis de blocage, de détection et d’amplification mentionnés ci-dessus et placez-les sur un plateau de réactifs. Chargez les diapositives dans les bacs de diapositives (jusqu’à 30 diapositives par exécution) et cliquez sur En cours d’exécution suivi de Oui. Notez que DAPI n’est pas utilisé pour la contre-coloration nucléaire.
    5. Confirmez le début de l’exécution en vérifiant la durée de l’exécution sur le logiciel autostainer. Le protocole prend ~11 h pour être complété et peut fonctionner pendant la nuit.
    6. Le lendemain, assurez-vous que la course est terminée en observant les voyants clignotants verts sur les fentes du plateau coulissant. Ensuite, retirez les lames de l’instrument et rincez-les vigoureusement dans 1x tampon de réaction jusqu’à ce que la solution liquide de couvercle soit complètement retirée.
  3. Protocole de plateforme de profilage spatial pour le test protéomique
    1. Suivez le protocole de protéomique spatiale indiqué dans la note ci-dessous. Incluez les modifications suivantes au protocole pour activer la procédure d’étiquetage automatique 3-plex.
    2. Effectuez les étapes 1.2.1-1.2.6 la veille du début du protocole de protéomique spatiale et passez directement à l’étape de récupération de l’antigène du protocole de protéomique spatiale après avoir effectué l’étape 1.2.6. Omettez la procédure de visualisation décrite dans le protocole de protéomique de profilage spatial.
    3. Remplacez SYTO 13 par SYTO 64 à 5000 nM pour permettre l’intégration des fluorophores. Diluer SYTO 64 dans 1x TBS et incuber dans une chambre d’humidité pendant 15 min.
    4. Lors de la configuration des paramètres de numérisation dans la plate-forme de profilage spatial, sélectionnez les filtres et les canaux de mise au point en fonction des fluorophores utilisés dans le panneau de visualisation pour permettre l’intégration 3-plex. Utilisez FITC pour DISCOVERY FAM et réglez l’exposition à 200 ms, utilisez Cy3 pour DISCOVERY Rhodamine 6G et réglez l’exposition à 200 ms, utilisez Texas Red pour SYTO 64 et réglez l’exposition à 50 ms (spécifiez ceci comme canal de mise au point), et enfin, utilisez Cy5 pour DISCOVERY Cy5, réglez l’exposition à 200 ms, et enregistrer les modifications.
      REMARQUE: Les instructions détaillées du protocole de protéomique de profilage spatial se trouvent sur l’onglet Support du site officiel en sélectionnant Documentation > Manuels de l’utilisateur. Ici, recherchez le protocole protéique pour nCounter en utilisant Bond RX.

2. Sélection du retour sur investissement pour les tests de transcriptomique spatiale

  1. Cuire les sections de granulés de cellules FFPE dans un four réglé à 70 °C pendant 20-60 min. Suivez le protocole NGS de la plate-forme de profilage spatial indiqué dans la note ci-dessous et numérisez les diapositives sur la plate-forme de profilage spatial, en sélectionnant des tailles de 50 μm et 300 μm. La recommandation suivante est mise en évidence pour le test de transcriptomique spatiale :
    1. Lors de la préparation de la bibliothèque, si différentes tailles de retour sur investissement ont été sélectionnées, regroupez des retours sur investissement de tailles similaires pour créer une bibliothèque par taille. Cela permet de s’assurer que des profondeurs de séquençage suffisantes sont atteintes pour tous les retours sur investissement sans biais de taille.
      REMARQUE: Les instructions détaillées de la plate-forme de profilage spatial se trouvent sur l’onglet Support du site officiel en sélectionnant Documentation > Manuels de l’utilisateur. Ici, recherchez le protocole ARN pour les applications NGS utilisant Bond RX.

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Résultats

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Protocole de visualisation automatisé pour guider la sélection du retour sur investissement
Dans cet article, nous présentons l’utilisation d’un protocole IF automatisé et personnalisé basé sur TSA pour visualiser le tissu et sélectionner des retours sur investissement spécifiques. L’élaboration d’un panel de visualisation utilisant le mélanome et la peau normale humaine comme tissus témoins consistait en des tests de stabilité des épitopes, un réglage fin de l’intensité des marqueurs et une évaluatio...

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Discussion

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À ce jour, les anticorps fluorescents directement conjugués dans un protocole manuel sont le plus souvent utilisés comme panneaux de visualisation pour la protéomique spatiale ou les tests de transcriptomiquespatiale 9,10. Cependant, l’utilisation d’anticorps fluorescents directement conjugués peut être difficile pour les marqueurs moins abondants, ce qui limite la sélection d’anticorps appropriés. Ce protocole montre que l’étiquetage des marqueurs de visualisati...

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Déclarations de divulgation

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Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan et Sandra Rost sont des employées et actionnaires de Genentech, membre du groupe Roche. D’autres sociétés qui font partie de Roche produisent des réactifs et des instruments utilisés dans ce manuscrit. Ciara Martin est une employée à temps plein de NanoString Technologies Inc, qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans ce manuscrit.

Remerciements

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Les auteurs remercient Thomas Wu pour le traitement des fichiers NGS. Nous remercions James Ziai pour les discussions sur les résultats et la révision des manuscrits, ainsi que Meredith Triplet et Rachel Taylor pour la révision interne du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10x solution saline tamponnée Tris (TBS)Cell Signaling Technologies12498SDiluée à 1x TBS dans de l’eau traitée au DEPC
Anticorps X (non divulgué)anticorps masqué en raison de la confidentialité
Eau traitée au DEPCThermoFisherAM9922Un autre peut être utilisé
DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1)Ventana950-500
DISCOVERY Cy5 KitVentana760-238Appelé Cy5
DISCOVERY FAM KitVentana760-243Appelé FAM
DISCOVERY Goat Ig BlockVentana760-6008Appelé Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRPVentana760-4310Appelé OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRPVentana760-4311Désigné sous le nom de OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY Rhodamine 6G KitVentana760-244Appelé Rhodamine
6G DISCOVERY ULTRA Système automatisé de préparation de lamesVentana05 987 750 001 / N750-DISU-FSDésigné comme autostainer sur le manuscrit
FAP [EPR20021] AnticorpsAbcamAb207178
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanoStringGMX-DSP-1YAppelé plate-forme de profilage spatial sur le manuscrit
Chambre d’humiditéSimportM920-2Un autre peut être utilisé
Pan-cytokératine [AE1/AE3] AnticorpsAbcamAb27988
ProLong Gold Antifade MountantThermoFisherP36934
PythonPythonAnalyse statistique
Tampon de réaction (10x)Ventana950-300
Logiciel d’analyse statistiqueGraphPadPrism 7Analyse statistique
SYTO 64ThermoFisherS11346
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana950-223
Diluant d’anticorps Ventana avec caséineVentana760-219Désigné comme diluant spécifié sur le manuscrit
Ventana Distributeur primaire d’anticorpsVentanadépend du numéro de distributeur
Le numéro de catalogue

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Omique spatialeProt omique spatialeTranscriptomique spatialeR gion d int r tImmunofluorescence multiplexeAmplification du signal par la tyramideProtocole de visualisation automatisProfil d expression prot iqueProfil d expression de l ARNFix au formol et inclus en paraffine

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