Isolement des cellules lymphoïdes innées utérines pour analyse par cytométrie en flux

Décrit ici est une méthode simple pour obtenir un rendement élevé de lymphocytes innés utérins à partir de l’utérus individuel enceinte. Cette méthode préserve l’expression de surface des protéines et la fonctionnalité des lymphocytes innés utérins et convient à des applications ultérieures telles que le phénotypage FACS, l’ARNiq, la protéomique ou les tests fonctionnels. Ici, l’accent est mis sur le phénotypage des uIC du groupe 1 par cytométrie en flux.

L’utérus est composé de trois couches : l’endomètre, le myomètre et le périmétrie (Figure 1). L’endomètre est la muqueuse, tapissant la lumière de l’utérus. La progestérone, produite par le corps jaune, convertit l’endomètre en décidua. Le myomètre est composé de deux couches de muscle lisse qui composent la paroi utérine. Le périmétrie est la séreuse qui enveloppe l’utérus et le relie au péritoine par le ligament large appelé mésomètre. Dans une section transversale de l’utérus, la partie opposée à la lumière est appelée côté mésométrial, tandis que la partie proche de la lumière est appelée côté anti-mésométrial. Une variété de leucocytes maternels peuplent l’endomètre et le décidua, y compris plusieurs types de cellules, où les cellules immunitaires innées représentent la grande majorité des cellules. Les cellules lymphoïdes innées (ILC), les macrophages, les cellules dendritiques (DC), ainsi que les lymphocytes T CD4⁺ et CD8⁺, les lymphocytes T régulateurs (Tregs) et les cellules B rares peuvent tous jouer un rôle important dans la régulation de l’environnement utérin tout au long de la ^grossesse1,2. Les ILC dans l’utérus se trouvent non seulement dans la muqueuse, mais aussi dans le myomètre chez la souris. En incluant les trois groupes d’ILC, l’utérus est en effet l’organe le plus densément peuplé par les ILC du groupe 1. Avec la transformation structurelle des tissus utérins tout au long de la gestation, le nombre et la proportion de leucocytes utérins changent également (voir la figure 2A pour un exemple de variations du pourcentage de sous-ensembles uILC du groupe 1)^3,4.

Lorsque les souris sont mentionnées dans le présent article, on entend par souche C57BL/6 de souris de laboratoire consanguines. Les souris consanguines (p. ex., les souris IRNM) sont souvent utilisées dans la recherche sur la reproduction en raison de leur taux de reproduction élevé. Cependant, l’utilisation de souches consanguines est nécessaire pour générer des résultats cohérents, et le bagage génétique préféré de l’immunologiste est C57BL / 6, également connu sous le nom de B6.

Environ 30 % des leucocytes utérins dans les mères B6 en milieu de gestation sont des uIC g1, qui sont définis par cytométrie en flux comme des cellules CD45^{+CD3-CD19-NK1.1+}NKp46⁺ viables (Figure 2B) : NK pro-angiogénique résidant dans les tissus (trNK), IFN-g produisant du NK conventionnel (cNK) et uILC14,5. Le pourcentage de cellules uNK est encore plus élevé chez l’homme, atteignant environ 70% au cours du premier ^trimestre6. Il y a plus de similitudes que de différences entre l’homme et la souris uNK et ^uILC7,8. Bien qu’il soit important de garder les différences à l’esprit, il est utile d’intégrer les informations disponibles sur les deux espèces. Lorsque l’on combine les informations obtenues lors de l’étude de l’uILC chez les humains et les rongeurs de laboratoire, il est clair que les cellules NK aident aux changements homéostatiques essentiels à la biologie de l’utérus, y compris le maintien de l’intégrité ^artérielle9 et le remodelage de l’artère en ^spirale10, ainsi que l’invasion des trophoblastes11,12. Ils jouent également des rôles spécifiques dans la défense contre les agents ^{pathogènes13,14}. Chez la souris et le rat, en plus de remplir la décidua autour du site d’implantation, les cellules NK s’accumulent entre les deux couches musculaires du myomètre des mères dans une structure transitoire connue sous le nom d’agrégat lymphoïde mésométrial de la grossesse (MLAp)¹⁵ (Figure 1B), également connue dans le passé sous le nom de glande métriale, dont la fonction n’a pas encore été découverte.

Voici un protocole détaillé de la méthode utilisée en laboratoire pour isoler les lymphocytes de l’utérus de souris gravides en utilisant une combinaison de désagrégation mécanique et de digestion enzymatique. Comme l’utérus entier est utilisé dans la méthode, les lymphocytes isolés de l’utérus pendant la gestation sont un mélange de cellules décidues et myométriques. Une dissection supplémentaire de la décidua de la paroi utérine et de son MLAp est possible, et elle a été décrite ^{précédemment16}. La méthode décrite ici a été développée pour obtenir des lymphocytes utérins tout en préservant l’expression de surface des protéines, la fonctionnalité cellulaire et la viabilité. Le résultat est une suspension unicellulaire avec un minimum de débris cellulaires résiduels et un rendement allant généralement de 1 à 5 millions de cellules à mi-gestation (10,5 jours) pour un utérus enceinte. Les applications de cette méthode englobent le phénotypage par cytométrie en flux, le tri cellulaire pour des études transcriptomiques ou protéomiques ultérieures, des études fonctionnelles telles que la production intracellulaire de cytokines, la dégranulation, ELISPOT ou des essais cytotoxiques. Le protocole présenté ici se concentre sur l’identification des ILC du groupe 1, mais peut être adapté à d’autres types de cellules telles que d’autres ILC, lymphocytes T, cellules B, DC ou macrophages avec des modifications mineures du panel d’anticorps utilisé pour l’analyse FACS. Le protocole peut également être utilisé pour isoler les cellules d’autres tissus et pour les utérus non enceintes regroupés.

Toutes les expériences sur les animaux décrites dans cet article ont été menées conformément à la loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) en vertu de la PP2363781 émise par le ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni. Le protocole ci-dessous se compose de plusieurs sections commençant par l’élevage de souris et se terminant par la coloration pour l’analyse FACS. La figure 3 illustre les principales étapes du protocole. Les matériaux utilisés dans le protocole sont énumérés dans le tableau des matériaux.

1. Élevage, accouplement et dissection généraux des souris

1. Gardez des souris femelles âgées de 7 à 14 semaines dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS) et logées en groupe (généralement 4 à 6 femelles selon la taille de la cage et le poids de l’animal), pendant 10 à 14 jours pour déclencher l’effet Lee-Boot, ce qui entraîne une synchronisation de l’œstrus17.
2. Gardez les mâles dans des conditions de FPS, logés seuls et reposés pendant au moins 48 h entre chaque accouplement (temps de régénération des spermatozoïdes). Il est préférable d’utiliser des mâles expérimentés et éprouvés âgés de 3 à 4 mois, car ils sont généralement plus performants que les jeunes.
3. Pour augmenter la probabilité que les femelles tombent enceintes, introduisez une litière souillée de la cage d’un mâle dans la cage de la femelle 3 jours avant l’accouplement. Cela déclenche l’effet ^Whitten18 par l’exposition aux phéromones urinaires mâles, et entraîne une synchronisation de l’œstrus ainsi qu’une meilleure réceptivité à l’accouplement.
4. Le jour 0 (J0), installez les souris pour l’accouplement en utilisant un mâle étalon pour deux femelles; considérez un taux de bouchon d’environ 20 % à 25 %.
   REMARQUE: L’accouplement aura probablement lieu la nuit puisque les souris sont des animaux nocturnes.
5. Le matin suivant l’accouplement (D0.5), vérifiez la présence d’un bouchon vaginal, qui est un indicateur de copulation (Figure 4). Le bouchon vaginal est un agrégat de l’éjaculat mâle et persiste généralement jusqu’à 8-24 h après l’accouplement. Vérifiez les prises tôt le matin.
6. Consolidez les femelles branchées dans une nouvelle cage et marquez-les. Retournez les mâles dans leurs cages pour qu’ils se reposent.
7. À D9,5 ou 10,5 après l’accouplement, préparez des tubes de 5 mL avec 1 mL de HBSS stérile 1x (avec ^{Mg2+ et Ca2+}) pour la collecte de tissus et placez-les sur de la glace.
8. Procéder à l’euthanasie animale par luxation cervicale, suivie d’une exsanguination pour confirmer le décès.
9. Travaillez dans un environnement stérile si l’application en aval l’exige. Directement après l’euthanasie, essuyez le corps de la souris avec 70% d’éthanol et procédez à la dissection sous une armoire à flux laminaire avec des instruments stériles.
10. Disséquez l’utérus de la femme enceinte exempt de graisse mésométriale (Figure 5) et placez l’utérus entier dans un tube de 5 mL préparé et correctement étiqueté. Gardez les tubes sur la glace.

2. Digestion mécanique et enzymatique de l’utérus

1. Pour préparer la solution de digestion enzymatique, mélanger 3 mL par utérus de HBSS stérile 1x avec 30 μg/mL de DNAse et 0,1 unité de Wünsch (WU)/mL de Liberase DH ou 0,52 WU/mL de Liberase TM. Mettez la solution au bain-marie à 37 °C.
   REMARQUE: Liberase TM et Liberase DH peuvent être utilisés. Le choix de l’un plutôt que de l’autre doit être guidé par leur effet potentiel sur les épitopes reconnus par les anticorps utilisés pour l’analyse ultérieure de cytométrie en flux.
   ATTENTION: Si vous utilisez des enzymes lyophilisées, travaillez sous le capot.
2. Préparer 20 mL de 5 mM d’EDTA dans du PBS (pas de ^Ca2+/^Mg2+). Placer la moitié de la solution à 37 °C au bain-marie et l’autre moitié sur de la glace.
3. Sous une armoire à flux laminaire, retirez doucement la graisse entourant l’utérus enceinte avec des instruments stériles dans une boîte de Petri stérile. Ne laissez pas le tissu sécher.
4. Disséquer chaque site d’implantation avec des instruments stériles pour enlever les fœtus (structure translucide en forme d’hippocampe, environ 1 mm de longueur) (Figure 6A). Jetez les fœtus.
5. Remettre l’utérus dans son tube de 5 mL de collecte d’origine et hacher le tissu à l’aide de ciseaux directement dans le tube de 5 mL et le milieu de collecte. Gardez les tubes sur la glace tout le temps entre les procédures.
6. Placer les tubes de 5 mL contenant le tissu haché dans un bain-marie à 37 °C.
7. Ajouter 3 mL de mélange chaud de digestion enzymatique à chaque échantillon afin que le volume total de liquide dans le tube soit de 4 mL (1 mL de milieu de prélèvement avec l’utérus haché et 3 mL de solution de digestion enzymatique). Incuber les tubes de 5 mL pendant 30 min à 37 °C avec agitation pour améliorer l’activité de digestion enzymatique.
8. Vortex les tubes de 5 mL et placez-les sur de la glace pour inhiber l’action des enzymes. Ensuite, transférez le contenu dans des tubes centrifuges de 15 mL correctement étiquetés.
9. Rincez le tout des tubes de 5 mL dans les tubes centrifuges de 15 mL à l’aide de 10 mL de solution EDTA PBS glacée de 5 mM.
10. Centrifuger les tubes centrifuges de 15 mL contenant les tissus digérés pendant 10 min à 400 x g.
11. Jeter le surnageant, faire glisser doucement la pastille, puis la remettre en suspension dans 10 mL de solution chaude (37 °C) 5 mM d’EDTA PBS.
12. Incuber les échantillons dans les tubes centrifuges de 15 mL à 37 °C avec agitation pendant 15 min pour éliminer le milieu de digestion restant et réduire l’agglutination cellulaire.
13. Vortex les échantillons sur haute pendant 10 s pour faciliter davantage la dissociation des tissus.

3. Transformation de l’utérus en une suspension unicellulaire

1. À l’aide du piston d’une seringue stérile de 1 mL, forcer le tissu digéré à travers une passoire de 70 μm sur un tube centrifuge de 50 mL correctement marqué et stérile pour éliminer les amas cellulaires et le tissu non dissocié.
2. Lavez la passoire plusieurs fois avec un total de 10 mL de PBS froid pour recueillir toutes les cellules.
3. Faire tourner le tube de centrifugeuse de 50 mL pendant 10 min à 400 x g.
   REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes en utilisant l’option A ou l’option B. L’option A permet un meilleur enrichissement des lymphocytes avec moins de débris et de contamination des cellules stromales que l’option B. Cependant, l’option B donne un rendement cellulaire immunitaire plus élevé en raison de moins de perte cellulaire et moins de variabilité du rendement cellulaire entre les échantillons. L’option B est également plus facile à exécuter techniquement. Par conséquent, selon la préférence, passez à l’option A ou à l’option B.
   1. Les étapes de l’option A sont les suivantes.
      1. Étiqueter un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL par échantillon contenant 5 mL de Percoll isotonique à 80 % (v/v) dilué dans du PBS.
      2. Après la rotation, jetez le surnageant du tube de centrifugeuse de 50 mL. Utilisez un pipet boy pour remettre en suspension chaque pastille dans 8 mL de Percoll isotonique à 40 % (v/v) dans pbS.
      3. Utilisez un pipet boy à vitesse lente pour superposer soigneusement les granulés remis en suspension dans la solution Percoll à 40% sur la solution Percoll à 80%. Pipette lentement et continuellement; maintenir le tube de 15 mL à un angle de 45° (Figure 6B).
      4. Sans perturber la superposition, centrifugez les tubes centrifuges de 15 mL pendant 20 min à 850 x g, à température ambiante (accélération moyenne et rupture minimale).
      5. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse sans perturber les couches percoll (Figure 6C).
      6. Sans perturber l’anneau des leucocytes à l’interface des deux solutions Percoll, utilisez une pipette Pasteur stérile pour tout jeter, à l’exception d’environ 0,5 à 1 mL de la couche supérieure de Percoll.
      7. Tout en essayant d’aspirer une quantité minimale de solution de Percoll (jusqu’à 4-5 mL au total), collectez soigneusement l’anneau de leucocytes et transférez les cellules dans un nouveau tube de centrifugeuse marqué de 15 mL.
      8. Complétez chaque échantillon avec 10 mL de milieu RMPI-1640 stérile complété par 10% de FBS inactivé par la chaleur.
      9. Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C.
      10. Jetez le surnageant et procédez à la lyse des globules rouges.
   2. Les étapes de l’option B sont les suivantes.
      1. Étiquetez un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL par échantillon.
      2. Après la rotation, jetez le surnageant du tube de centrifugeuse de 50 mL. Utilisez un pipet boy pour remettre en suspension chaque pastille avec 8 mL de Percoll isotonique à 35 % (v/v) en milieu RPMI-1640.
      3. Transférer les échantillons dans des tubes centrifuges de 15 mL.
      4. Centrifuger les échantillons à 940 x g pendant 10 min à température ambiante avec une accélération moyenne et une pause minimale.
      5. Aspirer soigneusement le surnageant à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette (pas en inversant le tube).
      6. Remettre la pastille dans 14 mL de milieu RPMI-1640 complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur, puis centrifuger l’échantillon à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
      7. Jetez le surnageant par aspiration et procédez à la lyse des globules rouges.

4.Lyse des globules rouges

1. Pour lyser les globules rouges, remettre les échantillons en suspension dans 3 mL de 1x solution de lysage de globules rouges et incuber pendant 3 min à température ambiante.
2. Ajouter 10 mL de PBS dans les échantillons pour arrêter la réaction.
3. Centrifugez les tubes à 400 x g pendant 5 min et jetez le surnageant.
4. Ajoutez 10 mL de PBS et répétez l’étape 4.3.
5. Remettre en suspension chaque pastille dans 1 mL de milieu RPMI-1640 complété par 10 % de FBS inactivé par la chaleur.
6. Faire passer les échantillons à travers des tamis cellulaires stériles de 70 μm.
7. Effectuez le comptage cellulaire à l’aide du bleu trypan et d’une chambre Neubauer conformément aux instructions du fabricant.
8. Ajuster la concentration de la suspension cellulaire à 1-2 millions de cellules dans 100 μL de PBS ou de milieu.

5. Stratégie et contrôles de conception des panneaux

REMARQUE: Le panneau décrit dans ce document est adapté à la discrimination des cellules uILC1, trNK et cNK et a été conçu pour être utilisé sur un 5 lasers BD LSRFortessa. Des modifications mineures peuvent être apportées pour étudier différentes populations cellulaires et utiliser des fluorochromes alternatifs. Il est recommandé de vérifier la configuration de l’instrument, en utilisant des anticorps titrés pour une séparation optimale, en consultant l’indice de luminosité du fabricant et en utilisant les colorants les plus brillants pour les antigènes à faible expression tels que NKp46, et en suivant les directives ^{générales19}. Il est recommandé d’inclure un contrôle de fluorescence moins un (FMO) pour NKp46.

6. Coloration innée des cellules lymphoïdes pour le phénotypage FACS

1. Transférez 1 à 2 millions de cellules par puits dans une plaque à fond rond de 96 puits.
2. Faire tourner la plaque à 400 x g pendant 3 min à 4 °C et jeter le surnageant en le faisant glisser dans un évier.
3. Remettre en suspension les pastilles cellulaires en 100 μL de PBS (sans protéines ni azotures) à l’aide d’une pipette multicanal.
   REMARQUE: Assurez-vous que le PBS ne contient pas d’azoture de sodium, pas de Tris ou de protéines pour l’étape suivante.
4. Répétez l’étape 6.2.
5. Remettre en suspension des cellules dans 50 μL de colorant réparable de viabilité dilué dans du PBS (sans protéines ni azotures) (1:1 000). Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 min dans l’obscurité.
   REMARQUE: Assurez-vous que le PBS ne contient pas d’azoture de sodium, pas de Tris ou de protéines telles que FBS ou BSA, car cela pourrait entraîner une diminution de l’intensité de coloration des cellules mortes et / ou une coloration de fond accrue pour les cellules vivantes.
   ATTENTION : Si le colorant de viabilité est pulvérisé, utiliser sous le capot.
6. Ajouter 150 μL de PBS, remettre en suspension les cellules avec une pipette multicanal, puis répéter l’étape 6.2.
7. Remettre en suspension les cellules dans 25 μL de tampon FACS (PBS complété par 1% de BSA ou 2% de FBS) contenant un réactif bloquant les récepteurs Fc. Incuber les cellules pendant 5 min à 4 °C.
8. Ajouter 25 μL d’un cocktail d’anticorps de surface.
   REMARQUE: Toujours titrer les anticorps et optimiser le panel d’anticorps avant l’expérience.
9. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 20 min dans l’obscurité.
10. Ajouter 150 μL de tampon FACS à chaque puits, bien mélanger, puis répéter l’étape 6.2.
11. Répétez l’étape 6.10.
    REMARQUE : Effectuez d’autres étapes à l’aide de l’option A ou de l’option B. Utilisez l’option A pour colorer les cellules avec des marqueurs de surface. Utilisez l’option B pour étudier les marqueurs intracellulaires par cytométrie en flux.
    1. Les étapes de l’option A sont les suivantes.
       1. Remettre les échantillons en suspension dans 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % par puits et incuber pendant 20 min à température ambiante.
          ATTENTION : Utilisez du PFA sous le capot. Veuillez vous référer à la fiche de sécurité pour jeter les déchets/objets PFA qui sont entrés en contact avec PFA (par exemple, pipettes) en toute sécurité.
       2. Répétez l’étape 6.2, deux fois.
          ATTENTION: Ne jetez pas en glissant dans l’évier ici car il contient du PFA. Aspirer avec une pipette et jeter les déchets conformément à la fiche de sécurité.
       3. Remettre en suspension les échantillons dans 200 μL de PBS.
       4. Transférez les échantillons dans des tubes FACS étiquetés et complétez avec 100 μL de PBS. Conservez les tubes sur de la glace ou dans un réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient traités avec l’analyse FACS. Acquérir les échantillons sur un cytomètre en flux dans les 24 heures.
    2. Les étapes de l’option B sont les suivantes.
       1. Remettre les échantillons en suspension dans 100 μL de solution de fixation/perméabilisation par puits (contenant du paraformaldéhyde) et incuber pendant 20 min à 4 °C.
          ATTENTION : Utilisez du PFA sous le capot. Veuillez vous référer à la fiche de sécurité pour jeter les déchets/objets PFA qui sont entrés en contact avec PFA (par exemple, pipettes) en toute sécurité.
       2. Répétez l’étape 6.2.
          ATTENTION: Ne jetez pas en glissant dans l’évier ici car il contient du PFA. Aspirer avec une pipette et jeter les déchets conformément à la fiche de sécurité.
       3. Ajouter 200 μL de 1x tampon de perméabilisation / lavage, bien mélanger, puis répéter l’étape 6.2.
       4. Répétez l’étape 6.11.2.3.
       5. Remettre en suspension les cellules fixes et perméabilisées dans 50 μL de 1x tampon de perméabilisation/lavage contenant des anticorps pour la coloration intracellulaire.
       6. Incuber les échantillons à 4 °C pendant 30 min dans l’obscurité.
       7. Ajouter 200 μL de 1x solution de perméabilisation / lavage, bien mélanger, puis répéter l’étape 6.2.
       8. Répétez l’étape 6.11.2.7.
       9. Remettre en suspension les échantillons dans 200 μL de PBS.
       10. Transférez les échantillons dans des tubes FACS étiquetés et complétez avec 100 μL de PBS. Conservez les tubes sur de la glace ou dans un réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient traités avec l’analyse FACS. Acquérir les échantillons sur un cytomètre en flux dans les 24 heures.
           REMARQUE: Après avoir effectué ce protocole, la suspension de cellule déciduale est prête pour l’analyse FACS. Il est recommandé d’enregistrer autant d’événements que possible par échantillon; au moins 1 000 à 3 000 événements d’une population parentale doivent être obtenus pour obtenir des résultats fiables.

Les principales étapes de la méthode décrites pour obtenir une suspension unicellulaire de leucocytes utérins sont résumées à la figure 3. La figure 2B illustre la stratégie de base de contrôle du FACS utilisée pour l’identification de trois sous-ensembles d’ILC g1 chez les souris B6 : les cellules uILC1 (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+) et cNK (CD49a-Eomes+). Une analyse plus approfondie de ces populations peut être effectuée pour étudier divers marqueurs de surface et intracellulaires des ILC g1. À titre d’exemple, la coexpression des récepteurs IFN-ɣ et auto-CMH peut être évaluée dans les cellules uILC1, trNK et cNK après stimulation avec un anticorps anti-NK1.1 (Figure 7).

Selon la question de recherche, le protocole (Figure 3) et le panel d’anticorps peuvent être adaptés. Il est important de noter qu’il est recommandé d’utiliser à la fois des anticorps anti-NK1.1 et anti-NKp46 dans un panel FACS pour le contrôle de l’ILC g1 (Figure 2B et Tableau 1). Il convient de noter que les ILC g1 obtenus à partir du sang, de la rate ou du foie ont une expression plus élevée de NKp46 à leur surface que leur homologue utérin (Figure 8). La coloration de surface pour NK1.1 donne une meilleure séparation et permet de fermer facilement les ILC g1 utérins (Figure 8). Bien que NKp46 soit exprimé par toutes les souches de souris, l’antigène NKR-P1C reconnu par l’anticorps anti-NK1.1 PK136 n’est exprimé que par certaines souches de souris, y compris C57BL/6 (c.-à-d. B6), FVB/N et NZB, mais pas dans AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL ou 129. De plus, si l’investigateur a l’intention d’étudier des récepteurs cruciaux des cellules NK tels que les récepteurs Ly49 du CMH, il est important d’être conscient des variations alléliques dans les souches de souris de laboratoire, qui récapitulent la grande variabilité des récepteurs de type immunoglobuline des cellules tueuses humaines (KIR). De plus, si les cellules doivent être stimulées avec NK1.1 pour un test fonctionnel, comme décrit dans Kim, S. et al.20, il pourrait être souhaitable de colorer les cellules avec anti-NKp46 plutôt qu’anti-NK1.1, car l’antigène NKR-P1C peut être occupé par l’anti-NK1.1 réticulant ou une régulation négative du récepteur peut suivre la stimulation. L’occupation des récepteurs ou la régulation négative peuvent empêcher la coloration avec le même anticorps utilisé pour stimuler.

Un problème courant avec la dissociation des tissus enzymatiques est l’altération des épitopes de surface sur les cellules par des enzymes utilisées pour un milieu de digestion. Par exemple, la coloration du récepteur CD94:NKG2A du CMH est mauvaise si Liberase TM est utilisée. Cependant, la digestion avec Liberase DH préserve la reconnaissance NKG2A par clone d’anticorps 16A11 (Figure 9). Il est recommandé de vérifier l’influence des enzymes sur tous les épitopes du panel FACS. À cette fin, utilisez la suspension de splenocytes de souris obtenue par dissociation mécanique (passage de toute la rate à travers une passoire de 70 μm). L’échantillon est ensuite divisé en deux parties ou plus suivies d’une incubation avec un milieu avec ou sans enzyme(s).

Comme mentionné précédemment, les cellules dérivées du sang sont présentes dans les échantillons de tissus dissociés. Si nécessaire, les contaminants sanguins peuvent être exclus en utilisant une méthode de coloration intravasculaire telle que développée dans le laboratoire Masopust21. La figure 10 montre qu’environ 6,5 % des ILC g1 présents dans les échantillons de tissu utérin au jour de gestation 8,5 sont d’origine sanguine. Les anticorps anti-CD45 utilisés pour la coloration intravasculaire peuvent être conjugués avec un fluorochrome utilisé pour un canal de décharge; cela exclura les contaminants sanguins sans utiliser de canal de fluorescence supplémentaire. Les problèmes les plus courants et leurs solutions sont présentés dans le tableau 2.

Figure 1 : Coupe transversale d’un utérus de souris. (A) Coupe transversale de l’utérus de la souris (non enceinte) indiquant une variété de leucocytes maternels qui peuplent l’utérus. (B) Coupe transversale de l’utérus de la souris (jour de gestation 8.5). (C) Coupe transversale de l’utérus de la souris (jour de gestation 13,5). (D) Comparaison de la formation de placenta chez la souris par rapport à la formation de placenta humain à partir du stade de blastocyste. Images créées avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Sous-populations d’ILC1 g1 utérin. (A) Pourcentages de cNK utérin, ILC1 et trNK chez la souris au début de la vie et de la grossesse. W - semaines, gd - jour de gestation. Graphique modifié de Filipovic, I. et al.4. (B) Stratégie de contrôle pour analyser les sous-ensembles d’ILC du groupe utérin 1 par cytométrie en flux. Les lymphocytes ont été isolés des tissus utérins au jour de gestation 10,5. La digestion des tissus a été réalisée à l’aide d’un milieu de digestion contenant Liberase TM. Les cellules étaient fermées en fonction de leur capacité à diffuser la lumière. Les doublets ont été exclus à l’aide d’un diagramme FSC-A par rapport au FSC-H, et seules les cellules viables CD45+CD3-CD19 ont été analysées plus avant. Dans les cellules viables CD45+CD3-CD19-, la porte ILC du groupe 1 a été identifiée comme étant des cellules NK1.1+ NKp46+. Dans les ILC du groupe 1, trois sous-ensembles peuvent être identifiés : les cellules NK conventionnelles CD49a-Eomes+ (cNK), les cellules NK tissulaires CD49a+Eomes+ (trNK) et les cellules CD49a+Eomes-uILC1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Guide visuel des principales étapes du protocole. (1) Disséquer l’utérus enceinte exempt de graisse mésométriale. (2) Enlever les fœtus; renvoyer l’utérus dans le tube de 5 mL et hacher le tissu. Passez à l’étape de digestion enzymatique : ajoutez 3 mL de mélange chaud de digestion enzymatique à chaque échantillon. Incuber les tubes de 5 mL pendant 30 min à 37 °C avec agitation. (3) (i) Après digestion, rincer le tout des tubes de 5 mL dans des tubes de 15 mL à l’aide de 10 mL de solution glacée de 5 mM d’EDTA PBS. ii) Centrifuger des tubes de 15 mL contenant des tissus digérés pendant 10 min à 400 x g. iii) Jeter le surnageant; agiter délicatement la pastille et la remettre en suspension dans 10 mL de solution chaude (37 °C) 5 mM EDTA PBS. (iv) Incuber les échantillons dans les tubes de 15 mL à 37 °C avec agitation, pendant 15 min. (4) À l’aide du piston d’une seringue stérile de 1 mL, forcer le tissu digéré à travers une passoire de 70 μm sur un tube de 50 mL correctement marqué et stérile, et tourner pendant 10 min à 400 x g. (5) Après la rotation, procéder à l’option A (représentée ici dans les diagrammes) ou B. Option A: jeter le surnageant du tube de 50 mL et, à l’aide d’un pipet boy, remettre en suspension chaque pastille dans 8 mL de Percoll isotonique à 40% (v / v) dans PBS. (6) i) L’option A s’est poursuivie : À l’aide d’un pipet boy à vitesse lente, superposer soigneusement les granulés remis en suspension dans une solution à 40 % de Percoll sur la solution à 5 mL de Percoll à 80 %. Pipette lentement et continuellement; maintenir le tube de 15 mL à un angle de 45°. (ii) Sans perturber la superposition, centrifuger les tubes de 15 mL à 850 x g pendant 20 min à température ambiante, avec une accélération moyenne et une rupture lente. (7) Après la rotation, tout en essayant d’aspirer une quantité minimale de solution de Percoll (jusqu’à 4-5 mL au total), prélèvez soigneusement l’anneau de leucocytes. (8) Effectuer des étapes de lyse des globules rouges. (9) Cellule de comptage à l’aide de bleu de trypan et d’une chambre de Neubauer. (10) Transférer 1 à 2 millions de cellules par puits dans une plaque de 96 puits à fond rond. (11) Procéder à la coloration du colorant de viabilité et des anticorps. (12) Enfin, transférer les échantillons dans des tubes FACS étiquetés. Conservez les tubes sur de la glace ou au réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient traités avec l’analyse FACS dans les 24 heures. Images créées avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Bouchon vaginal (A) et absence de bouchon (B) chez les femelles C57BL/6 à 0,5 jour après l’accouplement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Dissection pour extraire l’utérus d’une souris enceinte. (A) La mère est fixée avec des aiguilles sur une planche souple pour essuyer le corps avec de l’éthanol à 70%. Deux incisions verticales sont pratiquées, comme l’indiquent les lignes pointillées bleues. (B) La peau est soulevée pour exposer les organes internes. Les boucles intestinales sont doucement déplacées vers le haut pour visualiser l’utérus. (C) L’utérus est échantillonné en coupant en trois points: à côté des ovaires et au niveau du col de l’utérus, comme l’indiquent respectivement les deux lignes pointillées bleues et la flèche bleue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6: Préparation d’une suspension unicellulaire. (A) Retrait mécanique des embryons de leur site d’implantation. B) Superposition de gradient percoll; la couche supérieure contient la suspension monocellulaire dans 40% de Percoll et la couche inférieure dans 80% de Percoll. (C) Formation de l’anneau lymphocytaire après centrifugation du gradient de percoll. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Analyse représentative du TESTA du test fonctionnel avec les ILC du groupe 1. Détection intracellulaire de l’IFN-ɣ et du CD107a de surface dans les ILC du groupe 1 exprimant des récepteurs NK pour l’auto-CMH (Ly49C, Ly49I et NKG2A) par rapport à ceux qui ne le font pas, après réticulation de NK1.1 avec des anticorps liés aux plaques. Les cellules ont été isolées des tissus utérins au jour de gestation 9,5. La digestion des tissus a été réalisée à l’aide d’un milieu de digestion contenant de la libérase DH. Les valeurs brutes des quatre quadrants (coins) ainsi que le pourcentage relatif de répondeurs parmi les cellules exprimant des récepteurs pour soi et les répondeurs qui n’ont pas d’auto-récepteurs (chiffres gras) sont montrés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Coloration des lymphocytes spléniques et utérins avec des anticorps anti-NKp46 et anti-NK1.1. (A) Les suspensions cellulaires obtenues à partir de la rate de souris et de l’utérus (B) au jour de gestation 10,5 ont été séparées en deux; une partie a été colorée avec NKp46-APC (rouge) et l’autre avec NK1.1-APC (bleu). Notez que la coloration NKp46 des lymphocytes utérins ne sépare pas les cellules NKp46+ et NKp46- aussi proprement que les lymphocytes spléniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Diminution de l’IFM NKG2A (clone d’anticorps : 16A11) par incubation avec milieu de digestion. La suspension cellulaire des splenocytes de souris C56BL/6 a été divisée en trois parties. Une partie a été incubée dans un milieu de digestion Liberase DH (HBSS contenant 0,13 WU/mL Liberase DH et 30 μg/mL de DNAse), et une autre partie a été incubée avec un milieu de digestion Liberase TM (HBSS contenant 0,52 WU/mL Liberase TM et 30 μg/mL de DNAse). La troisième partie a été traitée avec du HBSS pur pendant 30 min à 37 °C. L’expression du marqueur NKG2A sur les ILC g1 a été évaluée par cytométrie en flux. Graphique tiré de Shreeve N. Le rôle de l’inhibition utérine des cellules NK pendant la grossesse (thèse); Superviseur : Colucci F, 2020. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Coloration intravitale avec des anticorps anti-CD45 pour l’exclusion des ILC g1 d’origine sanguine. Une souris mère C57BL/6 au jour de gestation 8,5 a été éliminée 3 min après injection intraveineuse avec 3 μg de CD45-AF647. L’utérus, le sang total et le thymus ont été récoltés et traités pour l’analyse FACS. L’axe X montre le signal de la coloration intraveineuse avec CD45-AF647, et l’axe Y montre le signal de CD45-BUV395 coloré in vitro. Les pourcentages de sous-populations sont indiqués en quadrants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Un exemple de panneau FACS pour cytomètre conventionnel à 5 lasers.

Tableau 2 : Guide de dépannage.

Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêts.