Sondage des propriétés structurelles et dynamiques des nanostructures subcellulaires de trafic par spectroscopie de fluctuation spatio-temporelle

Summary

L’analyse du déplacement carré moyen (iMSD) dérivée de l’imagerie est appliquée aux macroponosomes pour mettre en évidence leur nature intrinsèque évolutive dans le temps en termes de propriétés structurelles et dynamiques. Les macropoinosomes sont ensuite comparés aux granules sécrétoires d’insuline (ISG) comme référence pour les structures subcellulaires ayant des propriétés structurelles/dynamiques moyennes invariantes dans le temps.

Abstract

Le déplacement carré moyen dérivé de l’imagerie (iMSD) est utilisé pour traiter les propriétés structurelles et dynamiques des nanostructures subcellulaires, telles que les vésicules impliquées dans le trafic endo/exocytotique des solutés et des biomolécules. iMSD s’appuie sur l’imagerie time-lapse standard, est compatible avec n’importe quelle configuration optique et n’a pas besoin de s’attarder sur des objets uniques pour extraire des trajectoires. À partir de chaque trace iMSD, un triplet unique de paramètres structurels et dynamiques moyens (c.-à-d. taille, diffusivité locale, coefficient anormal) est calculé et combiné pour construire la « signature iMSD » de la nanostructure étudiée.

La puissance de cette approche est prouvée ici avec le cas exemplaire des macropinosomes. Ces vésicules évoluent dans le temps, modifiant leur taille moyenne, leur nombre et leurs propriétés dynamiques en passant des stades précoces aux stades avancés du trafic intracellulaire. Comme contrôle, les granules sécrétoires d’insuline (ISG) sont utilisés comme référence pour les structures subcellulaires qui vivent dans un état stationnaire dans lequel les propriétés structurelles et dynamiques moyennes de l’ensemble de la population d’objets sont invariantes dans le temps. L’analyse iMSD met en évidence ces caractéristiques particulières quantitativement et ouvre la voie à des applications similaires au niveau subcellulaire, à la fois dans les états physiologiques et pathologiques.

Introduction

Les nanostructures subcellulaires (p. ex. vésicules endocytaires/sécrétoires, organites) jouent un rôle central dans la régulation de la signalisation cellulaire¹. Un bon réglage de leurs caractéristiques structurelles (p. ex., taille) et/ou dynamiques (p. ex., diffusivité) détermine la façon dont la cellule réagit aux stimuli internes ou externes ^2,3,4. Sur la base de ces preuves, il n’est pas surprenant que des altérations de ces caractéristiques se retrouvent dans de nombreuses conditions pathologiques. Les exemples englobent le rôle de l’endocytose mal régulée dans le cancer ^2,3, les altérations structurelles et dynamiques trouvées au niveau des ISG dans les cellules β exposées aux conditions de diabète de type 2⁵, la mauvaise régulation des propriétés structurelles et de transport lysosomales dans la leucodystrophie globoïde ou la lipidose galactosylcéramide⁶, et les dysfonctionnements de la voie endo-lysosomale dans les troubles neurodégénératifs (par exemple, la maladie d’Alzheimer)⁷.

Dans ce contexte, les chercheurs ont récemment prouvé que les performances des méthodes de microscopie optique standard peuvent être améliorées en réglant correctement la résolution d’échantillonnage spatiale et temporelle⁸. Ceci, à son tour, peut fournir un aperçu plus approfondi des processus biologiques pertinents. En pratique, cela est rendu possible par un algorithme d’analyse des fluctuations spatio-temporelles, qui extrait simultanément les propriétés structurelles et dynamiques moyennes des objets diffusants directement à partir de la pile standard d’images de microscopie optique sans aucune connaissance préalable de l’objet biologique d’intérêt et de l’extraction de trajectoires d’objet unique. Toutes ces informations sont regroupées dans une seule sortie de la méthode : une trace iMSD⁹ (les détails sur la dérivation et l’analyse de la trace iMSD sont donnés dans le fichier supplémentaire 1).

Le protocole expérimental qui en résulte se compose de quelques étapes. Tout d’abord, l’imagerie de la région d’intérêt est réalisée à haute résolution temporelle. Ensuite, les fonctions de corrélation spatio-temporelle moyennes sont calculées à partir de la pile d’images. Enfin, par ajustement gaussien de la série de fonctions de corrélation, la « loi de diffusion » moyenne est obtenue directement à partir de l’imagerie et analysée pour reconnaître le mode de diffusion de l’objet. Le potentiel de la méthode a déjà été prouvé pour une variété d’objets biologiques, allant des molécules aux nanoparticules et même à des organites / structures subcellulaires entiers 9,10,11,12,13,14,15.

Cet article fait état de l’application de la DSIm aux macroponosomes pour mettre en évidence leur nature intrinsèque et irréversible qui évolue dans le temps en termes de propriétés structurelles et dynamiques moyennes (c.-à-d. à l’échelle de la population). En outre, ces vésicules endocytaires sont comparées aux ISG en tant que référence pour les structures subcellulaires dans un « état stationnaire », c’est-à-dire un état dans lequel les propriétés structurelles / dynamiques moyennes de l’ensemble de la population de granules restent constantes à tout moment. La macropinocytose définit une série d’événements initiés par la réorganisation étendue (ou ébouriffement) de la membrane plasmique pour former une structure macropinocytaire externe qui est ensuite internalisée¹⁶. Les macropinosomes formés à un stade précoce sont très similaires aux phagosomes. Dans le même temps, elles peuvent être distinguées des autres formes de vésicules endocytaires en raison de leur grande taille caractéristique, de leur hétérogénéité morphologique et de l’absence de structures protéiques.

Des tests biochimiques ont révélé que, lors de l’internalisation, les macropoinosomes s’enrichissent progressivement de marqueurs protéiques d’autres voies endocytaires, ce qui suggère que leur identité change continuellement pendant le trafic¹⁷. En utilisant des anticorps contre des marqueurs connus de la voie endosomale, il a été démontré que les macropoinosomes adoptent progressivement des caractéristiques endosomales classiques : ils diminuent en taille, se développent en structures endocytaires tardives (p. ex., lysosomes) ou finissent par perdre leur identité par la récupération membranaire de marqueurs moléculaires spécifiques (p. ex., tri des néxines)^18,19 . Le scénario global est que chaque macropinosome à l’intérieur de la cellule change irréversiblement son identité structurelle et dynamique (ainsi que moléculaire) lors du trafic de la membrane plasmique à son destin intracellulaire final. En conséquence, les propriétés structurelles/ dynamiques / moléculaires de l’ensemble de la population de macropinosomes changent également le long du même chemin temporel. Étant intrinsèquement sensible aux propriétés moyennes de l’ensemble de la population d’objets observés, la méthode iMSD décrit quantitativement la « nature évolutive » par la quantification de paramètres moyens clés, c’est-à-dire la diffusivité locale et le coefficient anormal (propriétés dynamiques) et la taille moyenne des macropinosomes (propriété structurelle) à n’importe quel stade de leur trafic intracellulaire.

À titre de comparaison, des mesures similaires ont été effectuées sur une structure intracellulaire bien connue, l’ISG, dans un modèle de cellules β. Comme les macropinosomes, la régulation des propriétés structurelles et dynamiques des ISG, depuis leur genèse au réseau Trans Golgi (TGN) jusqu’à leur exocytose au niveau de la membrane plasmique, est essentielle à la bonne exécution de la fonction ISG²⁰. Cependant, contrairement aux macropinosomes, les ISG vivent dans un « état stationnaire » dans lequel, à tout moment, tous les stades fonctionnels / structurels / moléculaires de la durée de vie des ISG sont simultanément présents dans la cellule, et chacun est représenté par une sous-population spécifique d’ISG. Cela signifie que bien que chaque granule évolue de manière irréversible de la biogenèse à la sécrétion, les propriétés structurelles / dynamiques moyennes de l’ensemble de la population de granules devraient rester constantes à tout moment (à moins que les conditions de l’état stationnaire ne soient modifiées, par exemple, par des stimuli externes tels que le glucose, le cholestérol et les cytokines¹³). Ceci est confirmé par l’analyse iMSD.

Protocol

1. Préparation de l’échantillon

1. Avant l’expérience de microscopie, les cellules de sous-culture dans des boîtes adaptées aux applications de microscopie.
   1. Laver deux fois un plat de 10 cm traité par culture tissulaire de cellules confluentes HeLa ou INS 1E (analogues à l’insulineome β cellules) avec 0,01 M 1x PBS, ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % (1x) et le placer dans un incubateur à 37 °C, humidifié, à 5 % de CO₂ pendant 5 min.
   2. Remettre en suspension les cellules détachées en ajoutant 9 mL de milieu DMEM complet (pour les cellules HeLa) ou RPMI 1640 (pour les cellules INS-1E) et prélever les 10 mL restants dans des tubes centrifuges.
   3. Ensemencez environ 2 × 10⁵ cellules dans chaque plat de 35 mm x 10 mm dans un volume final de 1 mL du milieu. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Pour étiqueter les lysosomes par fluorescence, utilisez LysoTracker Red DND-99.
   1. Diluer la solution mère dans 1 mL de milieu préavertissé jusqu’à une concentration finale de colorant de 70 nM.
   2. Remplacez le milieu du plat par un milieu frais contenant du LysoTracker. Incuber les cellules dans un milieu contenant du LysoTracker pendant 20 min à 37 °C dans une atmosphère de CO_{2 à} 5 % et les laver deux fois avec du milieu frais avant l’expérience.
   3. Pour marquer les macropinosomes par fluorescence, utilisez de l’isothiocyanate-dextran de fluorescéine de 70 kDa. Laver les cellules sous-cultivées trois fois avec 0,01 M 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), remplacer par un milieu contenant du dextran (1 mg/mL) et incuber à 37 °C pendant 30 min. Avant de procéder à l’expérience de microscopie, lavez les cellules trois fois avec un milieu frais.
   4. Pour marquer par fluorescence les ISG dans les cellules INS-1E, transfecter les cellules à l’aide d’un réactif de transfection (voir le tableau des matériaux) et du plasmide¹³ de la protéine fluorescente verte améliorée par le peptide C (EGFP) selon le protocole du fabricant, et incuber à 37 ° C pendant 24 h dans une atmosphère de CO_{2 à} 5% avant l’expérience.

2. Acquisition de données

1. Pour que le microscope s’équilibre à la température et à l’atmosphère souhaitées, allumez le système de contrôle de l’incubateur du microscope au moins 2 heures avant l’expérience.
   REMARQUE : Chaque acquisition est une série time-lapse.
2. Acquérez les images à l’aide d’un microscope confocal inversé équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau à ouverture numérique (NA) de 60x, 1,2.
3. Utilisez un laser à argon de 488 nm pour l’excitation des EGFP (cellules transfectées) et des macropinosomes marqués à la fluorescéine. Collectez l’émission de fluorescence entre 500 et 600 nm à l’aide d’un détecteur à tube photomultiplicateur standard.
4. Utilisez un laser HeNe de 543 nm pour exciter Lysotracker et collecter son émission de fluorescence entre 555 et 655 nm.
5. Réglez le diamètre du sténopé de détection sur la taille de 1 Airy. Pour chaque acquisition, collectez une série de 1000 images séquentielles. Réglez le temps de séjour en pixels sur 2 μs/pixel pour une durée d’image de 129 ms.
   REMARQUE: Chaque image se composait de 256 x 256 pixels (16 bits / pixel) avec une dimension physique de 69 nm / pixel, correspondant approximativement à une zone de 17 μm x 17 μm.

3. i Calculdes TMS

REMARQUE: Pour exécuter correctement le calcul, utilisez un logiciel capable de calculer numériquement et de programmer des scripts. Le script spécifique (c’est-à-dire pour le fichier de script 'iMSD.m', voir Fichier de support 1) doit être présent dans le même répertoire contenant la série d’images à traiter. Chaque image de la série doit être enregistrée dans un fichier « .tif » distinct.

1. Pour initialiser correctement les paramètres instrumentaux utilisés pour les acquisitions, ouvrez iMSD.m avec l’éditeur de texte du logiciel et modifiez sa première section comme suit.
   1. Définissez N comme nombre d’images dans la série chronologique (par exemple, 1000 dans ce protocole).
   2. Définissez px_size : taille des pixels, exprimée en μm (par exemple, 0,069 dans ce protocole).
   3. Ensemble f : résolution temporelle de chaque image, exprimée en secondes (par exemple, 0,129 dans ce protocole).
   4. Définir le filtre : entrée binaire pour la correction de l’arrière-plan, définissez la valeur sur '0' pour traiter les images brutes ou définissez la valeur sur '1' pour effectuer une soustraction d’arrière-plan basée sur un seuil.
   5. Définir av_toll: seuil de correction d’arrière-plan; tout pixel dont l’intensité est inférieure à cette valeur sera défini sur 0 si Filter=1.
   6. Définissez bit comme nombre entier déterminant l’intensité de l’échantillonnage (par exemple, 8 bits, 16 bits).
2. Enregistrez et exécutez le fichier de script iMSD.m modifié.
3. Vérifiez l’exécution du script.
   REMARQUE: L’état de traitement du calcul peut être vérifié dans la fenêtre de commande; Si un problème fatal se produit, le processus sera interrompu et un message d’avertissement s’affichera pour afficher le type d’erreur et le code de ligne associé. Sinon, suivez les étapes 3.3.1 à 3.3.3.
   1. Importez la pile d’images et soustrayez l’arrière-plan (si nécessaire).
   2. Calculer la fonction de corrélation spatio-temporelle G(ξ,η,τ) à l’aide de la méthode de Fourier.
   3. Ajuster la fonction de corrélation spatio-temporelle à une fonction gaussienne 2D.
      REMARQUE: À la fin du processus, les valeurs de sortie des procédures de raccord σ² (τ) seront affichées dans la fenêtre de commande: les moyennes, les erreurs et les qualités correspondantes (R²) du raccord sont signalées.
4. Vérifiez la sortie graphique.
   REMARQUE: La courbe iMSD et les courbes d’ajustement correspondantes sont présentées dans trois panneaux distincts, chacun pour un type différent d’équation d’ajustement utilisé: diffusion brownienne, diffusion anormale ou diffusion confinée. Pour chaque courbe, la valeur R² est indiquée dans la légende du graphique.
5. Vérifiez la sortie du texte.
   REMARQUE: À la fin du processus, un fichier « .xls » est créé avec le même nom que le fichier « .tif » time-lapse d’origine. La première feuille contient les valeurs de ξ, η, τ et σ² calculées pour chaque délai. Les paramètres d’entrée et les principales valeurs de sortie calculées sont indiqués dans la deuxième feuille, c’est-à-dire le coefficient de diffusion, le coefficient anormal et l’σ de l’axe des y²₀ interception.

Results

Le flux de travail général de la méthode est présenté à la figure 1. Il récapitule les principales étapes présentées dans la section protocole, de la préparation de l’échantillon (Figure 1A) à l’imagerie time-lapse des nanostructures intracellulaires (Figure 1B), en passant par l’analyse des fluctuations pour le calcul de la série de fonctions de corrélation spatio-temporelle (Figure 1C), et l’ajustement pour la dérivation des propriétés structurelles/dynamiques moyennes de l’objet étudié (Figure 1D).

Un paramètre critique est la résolution temporelle adoptée pour l’imagerie de l’objet subcellulaire d’intérêt. Cette valeur expérimentale fixera le seuil temporel auquel le déplacement moyen minimum des objets d’intérêt sera mesuré. Cependant, la condition préférée est de définir une résolution temporelle de l’imagerie à laquelle l’objet d’intérêt apparaît « immobile » dans le cadre capturé, c’est-à-dire qu’il affiche une taille caractéristique qui, en moyenne, n’est pas déformée en raison de la vitesse d’imagerie. Ceci est techniquement possible si l’objet d’intérêt est une structure subcellulaire ou un organite enfermé dans une membrane (comme dans ce cas). En règle générale, les structures subcellulaires présentent des coefficients de diffusion locaux (D, μm²/s, voir tableau 1) inférieurs de plusieurs ordres de grandeur à ceux des molécules isolées dans le cytoplasme (p. ex., GFP²¹). La validation peut être effectuée en immobilisant artificiellement l’organite d’intérêt (par exemple, par fixation chimique). En effet, cette condition peut servir de référence pour déterminer la taille réelle de l’organite dans les conditions expérimentales utilisées (par exemple, longueur d’onde d’excitation, taille des pixels, objectif).

Ici, bien que les lysosomes aient été utilisés comme organites de test pour cette procédure, les résultats sont valides indépendamment de la structure cible. La figure 2A montre une image d’un lysosome fixe (c.-à-d. immobile) ainsi qu’une acquisition effectuée sur des cellules vivantes à la résolution temporelle appropriée (c.-à-d. généralement inférieure à 100 ms/image; p. ex., 65 ms/image dans l’exemple de la figure 2B) et une acquisition effectuée intentionnellement à une très faible résolution temporelle (p. ex., 10 s/image dans l’exemple de la figure 2C). ). Pour chaque condition, la taille de l’objet diffusant est extraite comme suit : i) un profil d’intensité du spot est dérivé par l’outil linéaire du logiciel ImageJ ; ii) le profil d’intensité est tracé et interpolé par une fonction gaussienne pour calculer la valeur de la largeur totale à la moitié maximale (FWHM) qui, à son tour, est utilisée comme estimation du diamètre du spot (Figure 2D). Comme prévu et le montre le graphique de la figure 2E, l’acquisition à très haute résolution temporelle (c.-à-d. 65 ms/cadre) donne une taille moyenne de la structure proche de celle obtenue dans l’échantillon fixe, soit en utilisant l’outil standard décrit ci-dessus, soit en extrayant l’interception de l’axe y iMSD. Au lieu de cela, l’acquisition à vitesse lente entraîne une augmentation de la taille apparente de la structure, en raison de la dynamique naturelle de la structure pendant l’imagerie. Dans des conditions expérimentales sous-optimales, les informations structurelles/dynamiques extraites ne reflètent pas fidèlement les propriétés intrinsèques de l’objet étudié.

Une fois les principaux paramètres expérimentaux sélectionnés, des ensembles de données peuvent être produits pour les structures intracellulaires cibles. Pour les macropinosomes, après 20 min d’incubation des cellules avec 70 kDa dextrans, des séries chronologiques des structures intracellulaires marquées ont été acquises à différents moments après le traitement, de 30 min à environ 180 min. Il est intéressant de noter qu’un changement progressif des propriétés structurelles et dynamiques des macropinosomes est détecté pendant le trafic (Figure 3; les distributions de σ₀², D_m, α et N pour les macropinosomes sont rapportées dans les graphiques de gauche). Bien qu’aucun changement évident dans la diffusivité locale (D_m) des macropinosomes ne soit détecté pendant le trafic, la taille caractéristique (σ₀²) et le mode de mouvement global (α) évoluent dans le temps.

Il convient de noter en particulier une diminution de la taille moyenne des macropoinosomes pendant le trafic (figure 3A, à gauche), ainsi qu’une augmentation concomitante de la nature sous-diffusive de leur mouvement (c’est-à-dire une diminution des valeurs de α, figure 3C, panneau de gauche). De plus, le nombre de macropinosomes a été extrait de chaque acquisition : les résultats, rapportés dans la figure 3D, panneau de gauche, révèlent clairement une augmentation du nombre de macropinosomes dans le temps. Tous ces résultats sont en bon accord avec les attentes car les macropinosomes marqués au dextran sont censés provenir de grandes vésicules isolées et entourées de membranes au niveau de la membrane plasmique (qui sont également capables de se déplacer le long des composants du cytosquelette) mais sont censés communiquer progressivement avec la voie endo-lysosomale composée d’une grande population de structures plus petites et diffusant aléatoirement.

Comme prévu ci-dessus, les résultats pour les macropinosomes contrastent avec des mesures similaires effectuées sur les EIG (Figure 3, colonne de droite). Les granules d’insuline ne montrent pas de tendance temporelle des paramètres structurels/dynamiques dérivés de l’iMSD (et de leur nombre moyen dans la cellule) dans la même fenêtre de temps observée pour les macropinosomes. De plus, les valeurs caractéristiques de σ₀², D_m et α sont très différentes de celles des lysosomes, utilisées à nouveau comme référence. Ce résultat confirme l’idée, comme prévu ci-dessus, que les granulés sont sondés dans un « état stationnaire » dans lequel, à tout moment, les propriétés structurelles / dynamiques moyennes de l’ensemble de la population d’ISG sont inchangées (c’est-à-dire qu’elles restent constantes, à moins que les conditions de l’état stationnaire ne changent, par exemple, en raison de stimuli externes).

Figure 1 : Flux de travail expérimental. (A) Les cellules ont été plaquées 24 h (48 h pour les expériences de transfection) avant les expériences confocales sur des boîtes cellulaires adaptées aux applications microscopiques. Les cellules ont ensuite été traitées de manière appropriée selon la méthode de marquage (voir protocole) pour colorer l’organite cytoplasmique d’intérêt. (B) Une acquisition confocale typique consiste en une pile d’images (time-lapse) d’une partie cytoplasmique d’une cellule vivante, décrivant l’évolution temporelle de la dynamique des organites marqués. (C) Le film time-lapse est analysé avec un script Matlab sur mesure, calculant d’abord la fonction de corrélation d’image spatio-temporelle et l’ajustement gaussien pour tracer les courbes iMSD (D) et les paramètres d’ajustement extraits connexes décrivant les paramètres de dynamique structurelle des organites imagés. Abréviations : iMSD = déplacement carré moyen dérivé de l’imagerie; STICS = spectroscopie de corrélation d’images spatio-temporelles; α = coefficient de diffusion anormal; D_m = diffusivité locale; σ²(τ) = variance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Paramètres expérimentaux appropriés. (A) Image exemplaire de lysosomes colorés dans un échantillon fixe. Barre d’échelle = 2 μm. (B) Première image d’une pile d’images de lysosomes colorés dans une cellule vivante, acquise avec les paramètres appropriés. Résolution temporelle : 65 ms/image. Barre d’échelle = 2 μm. (C) La première image d’une pile d’images de lysosomes colorés dans une cellule vivante, acquise à basse vitesse: déformation artifactuelle de la taille apparente du lysosome due au mouvement des organites pendant l’imagerie est visible. Résolution temporelle : 10 s/frame. Barre d’échelle = 2 μm. (D) Exemple de calcul de taille pour les lysosomes imagés dans un ROI bleu de (A), (B) et (C). Le profil d’intensité le long de la ligne bleue a été équipé d’une fonction gaussienne pour récupérer le FWHM, c’est-à-dire une estimation de la taille des taches. Les valeurs FWHM sont indiquées pour chaque raccord. (E) Représentation graphique des valeurs de taille obtenues par analyse d’image décrite dans le panneau (D) pour tous les lysosomes imagés (carré noir, valeur moyenne et écart-type), pour les lysosomes enfermés dans le ROI bleu (triangle bleu) et récupérés par analyse iMSD (cercle rouge). Ce chiffre est de ²². Abréviations : ROI = région d’intérêt ; FWHM = pleine largeur à la moitié maximale; iMSD = déplacement carré moyen dérivé de l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Évolution temporelle des organites étiquetés. (A) Graphiques des valeurs de taille extraites par iMSD par rapport à la progression temporelle des acquisitions ultérieures représentées comme une moyenne des valeurs mesurées dans les acquisitions effectuées sur une fenêtre de temps de 10 minutes. À gauche, réduction progressive de la taille moyenne des macropoinosomes (cercles noirs) et à droite, la taille invariante dans le temps des granules sécrétoires d’insuline (carrés noirs) par rapport aux lysosomes, représentée par la valeur de taille moyenne (ligne rouge plus épaisse) ±'écart-type (lignes rouges pointillées). (B) et (C) Progression temporelle de D_m et α coefficients pour les macropinosomes (à gauche) et les granules d’insuline (à droite) extraits par analyse iMSD. (D) Évolution temporelle du nombre de macropinosomes et de granules d’insuline marqués mesurés dans la première image de chaque film time-lapse acquis. Abréviations : iMSD = déplacement carré moyen dérivé de l’imagerie; α = coefficient de diffusion anormal; D_m = diffusivité locale, N = nombre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Organite		Étiquetage		Lignée cellulaire	Taille (nm)	Dm ( × 10-3 μm2/s)	α	N	Ref.
Endosome précoce (EE)		CellLight Early Endosome GFP		Hela	395±74	3.0±2.4	1.02±0.20	40	10
Endosome tardif (LE)		CellLight Endosome tardif GFP		Hela	693±102	15.4±10.6	0,57±0,16	58	10
Lysosome (LY)		LysoTracker DND-99		Hela	471±76	15.3±9.0	0,49±0,13	143	10, 14
Caveola (CAV)		Caveolin-EGFP		Hela	405±49	3.1±1.8	1.00±0.22	15	10
Vésicule enduit de clathrine (CCV)		Transferrin-Alexa 488		Hela	513±62	16.2±9.9	0,48±0,17	33	10
Granule d’insuline (IG)		C-peptide-EGFP		INS-1E	335±56	3,0±1,7	0,70±0,14	107	11
Macropinosome précoce (EMCR)		Fluorescéine-Dextran 70 kDa		Hela	979±423	8.3±9	0,79±0,27	36	10
Macropinosome intermédiaire (IMCR)		Fluorescéine-Dextran 70 kDa		Hela	702±180	13,7±19,9	0,60±0,38	29	10
Macropinosome tardif (LMCR)		Fluorescéine-Dextran 70 kDa		Hela	592±127	5,8±4,7	0,39±0,21	21	10

Tableau 1 : Paramètres structurels et dynamiquesextraits de DSM. Le tableau montre les valeurs de taille, D_m et coefficient de α mesuré pour différents organites, en spécifiant les stratégies d’étiquetage, la lignée cellulaire utilisée et le nombre d’acquisitions analysées. Les valeurs sont indiquées comme moyennes ± écart-type. Abréviations : iMSD = déplacement carré moyen dérivé de l’imagerie; α = coefficient de diffusion anormal; D_m = diffusivité locale, N = nombre; GFP = protéine fluorescente verte; EGFP = protéine fluorescente verte améliorée.

Fichier supplémentaire 1 : Détails sur la dérivation et l’analyse de la trace iMSD. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de support 1 : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les propriétés et les avantages de l’iMSD sont évidents par rapport aux techniques disponibles pour récupérer des informations analogues. Pour les informations structurelles, le choix préféré est l’analyse par microscopie électronique à transmission (TEM). Par cette méthode, les détails ultrastructuraux à résolution moléculaire et même au-delà peuvent être récupérés, même pour les nanostructures subcellulaires. Néanmoins, la résolution spatiale particulière de la GDT est obtenue au détriment de l’information dans la dimension temporelle, ce qui est intéressant ici. Pour compenser cela, les progrès récents dans les technologies d’imagerie des cellules vivantes sont particulièrement intéressants. Il s’agit notamment de nouveaux marqueurs fluorescents avec des performances accrues (par exemple, luminosité et photostabilité), de procédures d’étiquetage optimisées et de détecteurs plus sensibles. En outre, des outils analytiques sont disponibles pour traiter à la fois structurelle (par exemple, « taille » par analyse basée sur le phaseur de la spectroscopie de corrélation d’image locale, PLICS²³, agrégation / oligomérisation par analyse nombre et luminosité²⁴) et dynamique (par exemple, loi de diffusion par suivi d’une seule particule, c’est-à-dire (SPT) 25,26,27,28 ) à l’échelle subcellulaire. La méthode SPT permet un accès direct à la trajectoire de l’objet et à son MSD. Cependant, l’inconvénient est la nécessité d’une faible densité de la sonde et d’étiquettes très lumineuses et de nombreuses trajectoires à objet unique à mesurer pour satisfaire aux critères statistiques. En ce qui concerne la résolution temporelle de la mesure, les sondes inorganiques photostables (p. ex., points quantiques ou nanoparticules métalliques) peuvent augmenter les performances spteuses, mais au détriment de procédures complexes de production et d’étiquetage.

Par rapport à ces normes, la méthode iMSD décrite ici présente certains avantages clés. Tout d’abord, cette approche peut être utilisée conjointement avec des étiquettes fluorescentes relativement faibles, telles que des protéines fluorescentes codées génétiquement (par exemple, l’application aux ISG). Ainsi, par rapport au SPT, une résolution temporelle plus élevée est obtenue (en utilisant la même étiquette) en raison de la plus faible quantité de photons requis⁸. Deuxièmement, la méthode iMSD n’est limitée que par la résolution temporelle mais pas par la diffraction. En fait, malgré la configuration optique limitée à la diffraction utilisée, les déplacements moléculaires moyens même en dessous de la limite de diffraction peuvent être mesurés, comme cela a déjà été démontré pour les écoulements moléculaires en utilisant STICS²⁹. La résolution réelle dans la mesure des déplacements dépend de la précision (en termes de signal au bruit) de la fonction de corrélation, ce qui explique pourquoi elle n’est pas limitée par la diffraction. Ainsi, il apparaît clairement que le déplacement minimal qui peut être mesuré dépend de la diffusivité de l’objet d’intérêt et de la résolution temporelle de la configuration d’imagerie.

À cet égard, il est important de considérer que l’application aux nanostructures subcellulaires, telles que les macropinosomes ou les granules d’insuline, avec un microscope à balayage laser est optimale: la vitesse de balayage disponible est nettement supérieure à la dynamique de l’objet d’intérêt. Dans un tel cas, le mouvement des objets lors de l’acquisition est négligeable, et la fonction de corrélation peut être approchée par une fonction gaussienne. Enfin, l’approche iMSD peut être facilement appliquée à un large éventail de configurations de microscopie optique commerciale basées sur le balayage raster ou l’imagerie par caméra à grand champ, sans qu’il soit nécessaire d’étalonner le système (requis uniquement si une estimation précise de la taille des particules doit être obtenue). Un paramètre important pour que la méthode fonctionne est un échantillonnage spatial approprié. En règle générale, pour atteindre une convergence satisfaisante de l’algorithme d’ajustement, la taille minimale de la région d’intérêt pour l’imagerie doit être au moins 3 fois supérieure au déplacement maximal de l’intérêt.

En conclusion, la méthode iMSD ne nécessite qu’un microscope équipé pour une acquisition rapide. La structure d’intérêt peut être marquée à n’importe quel fluorophore génétiquement codé ou organique, permettant ainsi une imagerie multicanal. Il est envisagé que l’analyse iMSD croisée sera utilisée dans un proche avenir pour sélectionner des sous-populations de nanostructures subcellulaires et révéler leurs interactions et leur co-diffusion au sein de la cellule, cette dernière étant un sujet brûlant en biophysique cellulaire. Si un détail est perdu par l’analyse iMSD, cela est certainement lié à la grande quantité d’informations moléculaires dans les nanostructures subcellulaires dynamiques. Ces informations sont inévitablement moyennées pendant la mesure en raison d’une mauvaise résolution temporelle. Théoriquement, cependant, il n’y a pas de limite technique en raison de la possibilité de récupérer des informations moléculaires, à condition que des vitesses d’acquisition suffisantes puissent être atteintes⁸. En raison de l’amélioration continue de la vitesse/sensibilité des détecteurs et des technologies d’imagerie, il est envisagé que les informations sur l’ensemble du compartiment subcellulaire et ses constituants moléculaires soient extraites d’un seul ensemble de données.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x Pénicilline-Streptomycine-Glutamine	Gibco	10378-016	Supplément de milieu cellulaire
C-peptide-EGFP			Plasmide
DMEM High Glucose	Gibco	31053028	Milieu cellulaire (HeLa)
FBS	Gibco	10082147	Supplément de milieu cellulaire
Fluorescéine isothiocyanate-dextran 70 kDa	Sigma Aldrich	46945-100MG-F	Réactif
HeLa	ATCC	CCL-61	Cell Line
Lipofectamine 2000	TermoFisher	11668019	Réactif de transflexion
Lysotracker Red DND-99	Gibco	L7528	Réactif
Matlab	MathWork
Software Boîtes de Pétri adaptées au microscope	Willco	GWSt-3522	Boîtes de Pétri
Olympus FV1000	Olympus Japon		Microscope confocal
RPMI 1640	Gibco	11835063	Milieu cellulaire (INS-1E)