Détermination analytique de la fonction mitochondriale des homogénats tumoraux solides excisés

Toutes les cellules sont intimement liées par leur besoin de produire et de consommer de l’adénosine triphosphate (ATP), la monnaie d’énergie moléculaire. Comme les mutations cellulaires donnent lieu à la formation de tumeurs, les mitochondries assurent la survie grâce à la diversification de la production d’énergie qui se distingue souvent phénotypiquement des tissus non cancéreux^1,2,3. En tant que tel, il existe un besoin critique de profilage rapide et profond de la fonction respiratoire mitochondriale afin de faciliter la classification du type de tumeur, de l’initiation du cancer, de la progression et de la réponse au traitement.

Les fonctions respiratoires des échantillons de tissus excisés ne peuvent pas être évaluées intactes car les substrats primaires d’OXPHOS ne sont pas perméables aux cellules. Pour surmonter cette limitation, les mitochondries peuvent être préparées soit par isolement, perméabilisation chimique, soit par homogénéisation mécanique. L’isolement mitochondrial est longtemps considéré comme une référence pour l’évaluation de la fonction respiratoire. Cependant, il nécessite de grandes quantités de tissu, prend du temps et est à faible rendement avec un biais de sélection possible pour certaines fractions de mitochondries⁴. La perméabilisation consiste en une séparation mécanique et l’exposition de coupes de tissus ou de faisceaux de fibres à un détergent doux qui dégrade sélectivement la membrane^{plasmique 5}. La perméabilisation est fréquemment utilisée dans les tissus striés tels que le muscle squelettique et cardiaque, car les faisceaux de fibres individuels peuvent être séparés. Par rapport à l’isolement, la perméabilisation donne plus de mitochondries dans leur environnement cellulaire natif et leur forme physique⁵. La perméabilisation a été appliquée avec succès dans d’autres tissus tels que la tumeur^6,7 et le placenta⁸; cependant, la reproductibilité des préparations de fibres perméabilisées peut être difficile en raison de la consistance de la dissection et des besoins en oxygène pour surmonter les limitations de diffusion⁹. De plus, les fibres perméabilisées peuvent ne pas convenir à certains types de tumeurs densément cellulaires et hautement fibrotiques. Les homogénats tissulaires sont générés par perturbation mécanique de la membrane plasmique et sont similaires aux fibres perméabilisées en termes de rendement mitochondrial et d’intégrité¹⁰. Les homogénats tissulaires minimisent également les limites de la diffusion de l’oxygène et peuvent être facilement utilisés dans tous les types de tissus grâce à l’optimisation de la force mécanique^11,12.

Ici, nous décrivons une méthode simple et rapide pour quantifier les taux de phosphorylation oxydative (OXPHOS) et la capacité de transfert d’électrons (ET) dans les homogénats de tumeurs solides fraîchement excisés. Le protocole est conçu de manière optimale pour évaluer les tissus frais à l’aide du respiromètre haute résolution Oxygraph-2k (O2k), qui nécessite une connaissance préalable de la configuration instrumentale et de l’étalonnage, mais peut être adapté de la même manière à l’aide de n’importe quelle électrode de type Clark, analyseur Seahorse ou lecteur de plaques. Le protocole peut être appliqué de manière reproductible à travers les espèces et les types de tumeurs, ainsi que adapté pour évaluer une diversité de voies ET mitochondriales.

Toutes les expériences et procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Préparation du réactif.

1. Préparer les milieux de croissance cellulaire EO771 avec 10 mM d’HEPES, 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine (100 U/mL) et 0,2 % d’amphotéricine B.
2. Préparer 1 L de solution de préservation de biopsie (BIOPS) dans un bécher en verre de 1000 ml.
   1. Ajouter 3,180 g de Na₂ATP (concentration finale de 5,77 mM).
   2. Ajouter 1,334 g de MgCL₂·6H2 O (concentration finale de 6,56 mM).
   3. Ajouter 2,502 g de taurine (concentration finale de 20 mM).
   4. Ajouter 3,827 g de Na₂phosphocréatine (concentration finale de 15 mM).
   5. Ajouter 1,362 g d’imidazole (concentration finale de 20 mM).
   6. Ajouter 0,077 g de dithiothréitol (concentration finale de 0,5 mM).
   7. Ajouter 9,76 g d’hydrate MES (concentration finale de 50 mM).
   8. Ajouter 800 mL de_H2O et mélanger les constituants à l’aide d’un agitateur magnétique à 30 °C.
   9. Ajouter 72,3 mL de 100 mM K₂EGTA (concentration finale de 7,23 mM).
      1. Dissoudre 7,608 g d’EGTA et 2,3 g de KOH dans 100 mL de_H2O.
      2. Réglez le pH à 7,0 avec 5 M KOH et portez le volume à 200 mL avec H₂O.
   10. Ajouter 27,7 mL de 100 mM_caK2EGTA (concentration finale de 2,77 mM).
       1. Dissoudre 7,608 g d’EGTA dans 200 mL de_H2O et chauffer à 80 °C (concentration finale de 100 mM).
       2. Dissoudre 2,002 g de CaCO₃ dans 200 mL de solution chaude d’EGTA de 100 mM.
       3. En remuant continuellement, ajouter 2,3 g de KOH et ajuster le pH à 7,0.
   11. Ajuster le pH à 6,75 à 23 °C (pH 7,1 à 0 °C) avec 5 M KOH. Porter le volume à 980 mL avec H₂O et mélanger la solution. Vérifiez à nouveau le pH, ajustez-le si nécessaire et portez le volume final à 1000 mL avec de l’eau.
   12. Aliquote BIOPS dans des tubes coniques (15 mL ou 50 mL) et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation. Ne décongeler qu’une seule fois, juste avant utilisation.
3. Préparer 1 L de milieu respiratoire mitochondrial (MiR05) dans un bécher en verre de 1000 ml.
   1. Ajouter 0,190 g d’EGTA (concentration finale de 0,5 mM).
   2. Ajouter 0,610 g de MgCL₂·6H₂O (concentration finale de 3 mM).
   3. Ajouter 2,502 g de taurine (concentration finale de 20 mM).
   4. Ajouter 1,361 g de KH₂PO₄ (concentration finale de 10 mM).
   5. Ajouter 4,77 g de HEPES (concentration finale de 20 mM).
   6. Ajouter 37,65 g de D-saccharose (concentration finale de 110 mM).
   7. Ajouter 800 mL de_H2O et mélanger les constituants à l’aide d’un agitateur magnétique à 30 °C.
   8. Ajouter 120 mL d’acide lactobionique 0,5 M (concentration finale de 60 mM).
      1. Dissoudre 35,83 g d’acide lactobionique dans 100 mL de_H2O.
      2. Réglez le pH à 7,0 avec 5 M KOH et portez le volume jusqu’à 200 mL avec H₂O.
   9. Mélanger la solution et ajuster le pH à 7,1 avec 5 M KOH.
   10. Peser 1 g de BSA, essentiellement sans acides gras (concentration finale de 1 g/L), dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 40 mL de la solution pH 7.1 de l’étape 9 au tube, inverser doucement pour mélanger et éviter la formation de mousse. Transférer le BSA dissous dans la solution de pH 7.1 restante à partir de l’étape 9 et remuer doucement et continuellement. Vérifiez à nouveau le pH, ajustez-le si nécessaire et portez le volume final à 1000 mL avec H₂O.
   11. Aliquoter le milieu MiR05 dans des tubes coniques de 50 mL et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation. Ne décongeler qu’une seule fois, juste avant utilisation.
4. Préparez des substrats, des découpleurs et des inhibiteurs.
   1. Préparer 0,8 M de malate : Dissoudre 536,4 mg d’acide L-malique dans 4 mL de_H2O. Neutraliser avec 5 M KOH à pH 7 et porter le volume à 5 mL avec H₂O. Diviser en aliquotes puis conserver à -20 °C.
   2. Préparer 1 M de pyruvate : Dissoudre 550 mg de sel de sodium de l’acide pyruvique dans 4 mL de_H2O. Neutraliser avec 5 M KOH à pH 7 et porter le volume à 5 mL avec H₂O. Diviser en aliquotes puis conserver à -20 °C.
   3. Préparer 0,5 M ADP (adénosine 5′-diphosphate) : Dissoudre 1,068 g de sel de sodium ADP dans 4 mL de_H2O. Neutraliser avec 5 M KOH à pH 7 et porter le volume à 5 mL avec H₂O. Diviser en aliquotes puis conserver à -20 °C.
   4. Préparer 2 M de glutamate : Dissoudre 3,7426 g d’acide L-glutamique monohydraté dans 8 mL de_H2O. Neutraliser avec 5 M KOH à pH 7 et porter le volume à 10 mL avec H₂O. Diviser en aliquotes puis conserver à -20 °C.
   5. Préparer 4 mM Cytochrome c: Dissoudre 50 mg de Cytochrome c dans 1 mL de_H2O. Diviser en aliquotes puis conserver à -20 °C.
   6. Préparer 1 M de succinate : Dissoudre 2,701 g de sel disodique de succinate hexahydraté dans 8 mL de_H2O.Neutraliser avec 1 N HCl à pH 7 et porter le volume à 10 mL avec H₂O. Répartir en aliquotes puis conserver à -20 °C.
   7. Préparer 1 mM fccP (cyanure de carbonyle-4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone) : Dissoudre 2,54 mg de FCCP dans 10 mL d’éthanol pur. Diviser en aliquotes puis conserver à -20 °C.
   8. Préparer 150 μM de roténone : Dissoudre 3,94 mg de roténone dans 10 mL d’éthanol pur pour préparer 1 mM de bouillon, vortex jusqu’à dissolution complète. Diluer 225 μL de concentration de 1 mM de roténone avec 1,275 mL d’éthanol pur pour obtenir 1,5 mL de 150 μM de roténone. Protéger de la lumière, diviser en aliquotes, puis conserver à -20 °C.
   9. Préparer 125 μM d’antimycine A : Dissoudre 11 mg d’antimycine A dans 4 mL d’éthanol pur pour préparer 5 mM de concentration en stock d’antimycine A. Diluer 25 μL de 5 mM d’antimycine A avec 975 μL d’éthanol pur pour obtenir 1 mL de 0,125 mM d’antimycine A. Diviser en aliquotes puis conserver à -20 °C.
   10. Préparer 0,8 M d’ascorbate : Dissoudre 1,584 g de sel de sodium d’ascorbate dans 8 mL de_H2O. Ajuster le pH avec de l’acide ascorbique à pH 6 et porter le volume à 10 mL avec H₂O. Protéger de la lumière, diviser en aliquotes, puis conserver à -20 °C.
   11. Préparer 0,2 M TMPD (tétraméthyl-p-phénylènediamine) : Dissoudre 32,85 mg de TMPD dans 987,5 μL de DMSO. Ajouter 12,5 μL d’ascorbate de 0,8 M (concentration finale d’ascorbate de 10 mM). Protéger de la lumière, diviser en aliquotes, puis conserver à -20 °C.
   12. Préparer 4 M d’azoture de sodium : Dissoudre 2,6 g d’azoture de sodium dans 10 mL de_H2O. Diviser en aliquotes et conserver à -20 °C.

2. Croissance tumorale

1. Cultivez des cellules EO771 dans un milieu de croissance RPMI 1640 et maintenez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO_2.
2. Souris femelles C57BL/6J âgées de quatre semaines et d’une seule maison, maintenez-les à 21-22 °C sur un cycle clair:sombre de 12 h. Fournir aux souris un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau.
3. Une fois que les souris atteignent l’âge de 10 semaines, préparez les cellules et les souris à l’implantation de cellules cancéreuses.
   1. Trypsiniser les cellules, désactiver la trypsine avec un milieu de croissance et centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et le remettre en suspension et combiner les pastilles cellulaires (au besoin) dans un milieu. Compter les cellules viables à l’aide du bleu de trypan et préparer une dilution cellulaire de 1 x^{10 6} cellules dans un volume total de 60 μL avec une solution 1:1:1 Media/Basement Membrane Matrix/PBS. Une fois la matrice de la membrane basale ajoutée, mélangez bien et maintenez la suspension cellulaire sur la glace. Remplissez les seringues avec 60 μL de suspension cellulaire et placez-les sur de la glace. Travaillez efficacement et injectez des cellules dans des souris dans les 1,5 h suivant la préparation.
   2. Anesthésier les souris par inhalation d’isoflurane (3%-5% pour l’induction et 1%-3% pour l’entretien). Raser entre les glandes mammaires inguinales droites^{4 ème} et^5ème. Injecter orthotopiquement les souris anesthésiées avec la suspension cellulaire EO771.
4. Utilisez des étriers électroniques pour surveiller et mesurer la croissance tumorale deux fois par semaine pendant 4 semaines. Lors de la nécropsie, excisez, pesez, puis placez la tumeur (ou un minimum de 60 mg de section tumorale) immédiatement dans 10 mL de BIOPS glacé. Gardez le tube sur de la glace humide.

3. Configuration et étalonnage de l’instrument

1. Réchauffez le miR05 au bain-marie à 37 °C.
2. Allumez le système Oroboros O2k, ouvrez le logiciel DATLAB, entrez ou sélectionnez Utilisateur. Cliquez sur Se connecter à O2k. Vérifiez la configuration O2k et assurez-vous que le bon instrument est étiqueté pour Power-O2k et que chaque chambre correspond au bon capteur d’oxygène; cliquez sur OK. Une fois que la fenêtre de contrôle O2k s’ouvre, sous l’onglet Systèmes, réglez la température du bloc à 37 °C, la vitesse de l’agitateur à 750 tr/min pour les deux chambres, et l’intervalle d’enregistrement des données à 2,0 s. Vérifiez à la fois l’alimentation de l’agitateur et l’éclairage dans les cases de la chambre. Dans l’onglet Oxygène, O2, réglez le gain pour le capteur sur 1 V / μA (le gain peut devoir être ajusté pour les modèles d’instruments plus anciens), la tension de polarisation à 800 mV, puis cliquez sur Connecter à O2k. Une fois qu’un nouveau fichier d’expérience s’ouvre, nommez le fichier et cliquez sur Enregistrer. Une fois l’expérience active, une fenêtre de sélection de protocole s’ouvre ; cliquez sur Annuler pour exécuter un SUIT personnalisé (Titrage inhibiteur du découpleur de substrat).
3. Après la sélection du protocole, une fenêtre d’exemple s’ouvrira pour remplir le code expérimental, le type d’échantillon, la cohorte, le code d’échantillon, le numéro d’échantillon et le numéro de sous-échantillon, le cas échéant. Assignez l’unité à mg et entrez la concentration d’homogénat tumoral par mL (la quantité par chambre se remplira automatiquement). Assurez-vous que le milieu indiqué est MiR05 et que le volume de la chambre est de 2,00 mL. Ajoutez des commentaires au besoin dans la zone inférieure et cliquez sur OK.
4. Retirez les bouchons et aspirez l’éthanol à 70% des chambres. Ne jamais aspirer près de la membrane exposée à l’intérieur de la chambre. Rincez quatre fois à l’eau pure et remplissez la chambre de 2,25 mL de MiR05.
5. Test du capteur: Cliquez sur F9 pour éteindre les agitateurs pendant 30 s. Une fois la barre d’agitateur rallumée, assurez-vous que la pente O₂ augmente rapidement de manière monoexponentielle dans chaque chambre. Si la chambre échoue au test du capteur, vérifiez les connexions électriques et nettoyez si des sels se sont accumulés; répétez le test. Si le capteur continue d’échouer au test, retirez le connecteur du capteur d’oxygène polarographique (POS) pour inspecter la membrane. Si des dommages visibles à la membrane, une forte oxydation ou une accumulation importante de bulles sont observés, arrêtez les procédures expérimentales et passez à l’entretien de l’instrument.
6. Étalonnage de l’oxygène: Effectuez l’étalonnage de l’oxygène pour obtenir des mesures précises de la respiration.
   1. Avec un mouvement de torsion, Insérez lentement les bouchons dans leur position calibrée en volume. Siphonnez l’excès de milieu éjecté à travers le capillaire d’injection qui s’accumule dans le puits du bouchon. Avec un mouvement de torsion, soulevez les bouchons juste assez pour s’adapter étroitement à l’outil d’espacement de bouchon en laissant un volume de gaz au-dessus de la phase liquide pour l’équilibrage final de l’air (30-45 min.).
   2. Utilisez l’état d’équilibre obtenu au cours de cette période pour calibrer le capteur d’oxygène afin d’obtenir des mesures précises de la respiration. La pente_O2 neg. (pente négative de l’oxygène) est de 0 ± 2 pmol/s·mL. Si la valeur est supérieure à 2 pmol/s·mL, nettoyez la chambre et reconstituez-la avec du MiR05 fraîchement décongelé. Si la pente est instable, passez à l’entretien des instruments.
   3. Après avoir atteint un état stable, sélectionnez la courbe de concentration O 2 et_mettez en surbrillance la région stable de la courbe en maintenant la touche Maj enfoncée et en cliquant avec le bouton gauche de la souris. Une fois la région sélectionnée, cliquez sur F5, sélectionnez la marque pour l’étalonnage de l’air avec la flèche déroulante et cliquez sur Calibrer et copiez dans le presse-papiers.
7. Étalonnage instrumental en arrière-plan (facultatif)
   1. Après l’étalonnage de l’air, assurez-vous qu’il n’y a pas de volume de gaz au-dessus de la phase liquide pour l’équilibrage du fond de flux (~ 15 min) et fermez complètement les chambres.
      REMARQUE : Le taux d’équilibre atteint au cours de cette période représente un arrière-plan instrumental et peut être soustrait des données résultantes pour une précision analytique accrue. La pente O₂ neg. augmentera d’abord légèrement et plafonnera entre ± 2 à 4 pmol/s·mL.
   2. Si la valeur est élevée (>6 pmol/s·mL), il y a contamination biologique potentielle. Dans ce cas, nettoyez la chambre et reconstituez-la avec du MiR05 fraîchement décongelé. Une fois l’état d’équilibre atteint, sélectionnez la courbe de pente O 2 et_mettez en surbrillance la région stable de la courbe en maintenant la touche Maj enfoncée et en cliquant avec le bouton gauche de la souris.
   3. Après avoir sélectionné la région, cliquez sur F5, sélectionnez la zone de correction de ligne de base et la marque de ligne de base avec la flèche déroulante, puis cliquez sur OK.

4. Préparation de l’homogénat tumoral

1. Placez un homogénéisateur en verre contenant 1 mL de MiR05 et un pilon en verre bien ajusté sur de la glace humide.
2. Au moment de l’étude, placez le tissu dans 1 mL de BIOPS dans une boîte de Petri glacée.
3. Nettoyez et disséquez le tissu pour maximiser le matériau soluble, éviter les régions nécrotiques et enlever le tissu tumoral marginal. À l’aide d’un microscope à dissection, d’un scalpel et d’une pince à épiler chirurgicale, enlevez les poils, le tissu nécrotique, le tissu conjonctif et vasculaire périphérique et la graisse adjacente, le cas échéant. Prenez soin de garder la tumeur dans un BIOPS glacé pendant la dissection.
4. Coupez la tumeur en petits morceaux (~ 5-10 mg chacun) et replacez les morceaux tumoraux restants dans 10 mL de BIOPS conservés sur la glace. Utilisez ce tissu plus tard pour des préparations supplémentaires si nécessaire.
   Remarque : Effectuez rapidement les étapes suivantes pour réduire la durée pendant laquelle l’échantillon n’est pas complètement immergé dans BIOPS. Une fois l’échantillon placé dans MiR05, le temps presse. Déplacez soigneusement l’homogénat préparé dans la chambre étalonnée dès que possible.
5. Épongez soigneusement les sections de tissu sur un papier filtre, placez-les sur un petit bateau de pesage goudronné en plastique et enregistrez le poids humide initial. Replacez les pièces inutilisées dans le tube conique de 10 mL de BIOPS pour une conservation continue.
6. Immergez les sections de tissus dans un homogénéisateur glacé contenant du MiR05 et enregistrez le poids restant sur le bateau de pesée, le cas échéant.
7. À l’aide d’un pilon en verre (plage de clairance 0,09-0,16 mm), perturbez doucement le tissu tumoral en effectuant 5 à 7 coups ascendants. Pour chaque coup, faites pivoter le pilon dans le sens inverse des aiguilles d’une montre 3 fois tout en poussant le pilon vers le bas et 3 fois supplémentaires tout en tirant le pilon vers le haut. Assurez-vous de laisser le tissu se déposer au fond de l’homogénéisateur entre les coups, mais évitez d’amener le pilon complètement au-dessus du volume de liquide pour éviter la formation de mousse.
   REMARQUE: L’homogénat résultant doit apparaître trouble avec un minimum de restes de tissus solides.
8. Versez l’homogénat dans un tube conique de 15 mL et placez-le sur de la glace.
9. Pipette 1-3 mL de MiR05 frais sur le pilon et dans l’homogénéisateur pour laver tout homogénat de tissu restant. Versez le lavage MiR05 dans le tube conique contenant l’homogénat. Répétez le lavage du pilon et de l’homogénéisateur 2 à 3 fois pour assurer le transfert complet de l’homogénat. Gardez à l’esprit la concentration cible et le volume requis pour ne pas trop diluer l’échantillon pendant les étapes de lavage.
10. Pour calculer avec précision la concentration d’homogénat tissulaire, inspectez soigneusement l’homogénéisateur et l’homogénat pour détecter s’il reste du matériel non homogénéisé (c.-à-d. le tissu conjonctif).
    1. Pour retirer le matériau non homogénéisé de l’homogénéisateur qui ne peut pas être atteint avec une pince à épiler, ajoutez MiR05 à l’homogénéisateur, aspirez le volume (y compris le tissu) avec une pipette et déplacez le contenu dans une boîte de Pétri.
    2. Pour retirer le matériau non homogénéisé de l’homogénat (déposé en gros morceaux au fond du tube conique), aspirez les gros morceaux avec une pipette et placez-les sur le capuchon tissulaire du tube conique.
    3. Retirez le tissu de la boîte de Pétri ou du bouchon du tube conique avec une pince à épiler et épongez-le sur du papier filtre. Ajouter l’homogénat restant du capuchon du tube conique dans le tube conique, le coiffer, puis inverser pour mélanger.
    4. Réinspectez les homogénéisateurs et l’homogénéat pour détecter tout matériau non homogénéisé supplémentaire et répétez les étapes 4.10.1 à 4.10.3 pour retirer le matériau au besoin.
11. Peser et enregistrer la masse du matériau non homogénéisé récupéré de l’homogénéisateur. Inspecter la préparation de l’homogénat pour tout tissu grossièrement intact transféré. Retirez les pièces non homogénéisées et pesez si nécessaire.
12. Soustrayez le poids tissulaire récupéré du bateau de pesée, de l’homogénéisateur et de l’homogénat (si nécessaire) du poids humide initial pour calculer le poids final de l’échantillon.
13. En utilisant le poids final de l’échantillon, ajoutez du MiR05 supplémentaire pour amener l’homogénat à la concentration souhaitée (voir l’étape 5 pour plus de détails concernant les expériences d’optimisation).
14. Une fois l’homogénat pesé et préparé, procédez au dosage dès que possible. Conservez l’échantillon sur de la glace humide jusqu’à ce qu’il soit transféré à l’instrument.

5. Substrat, découpleur, protocole de titrage inhibiteur (SUIT)

1. Une fois l’instrument étalonné et l’échantillon préparé, retirez les bouchons avec un mouvement de torsion et aspirez le MiR05 des chambres (en évitant la membrane exposée à l’intérieur de la chambre). Bien mélanger l’homogénat et ajouter 2,25 mL de l’homogénat à la chambre. Si vous ajoutez un homogénat à plusieurs chambres, pipettez 1 mL à la fois dans chaque chambre tout en mélangeant l’homogénat pour assurer une distribution égale des tissus. Cliquez sur F4 pour nommer et horodater l’événement, puis cliquez sur OK.
2. Remplissez une seringue de 50 mL avec de l’oxygène provenant d’un réservoir d’oxygène avec un régulateur et un tube de gaz à l’aide d’une aiguille émoussée de 18 G. Hyperoxygéner les chambres à ~500 μM d’oxygène. Pour cela, injectez de l’oxygène directement dans les chambres. Insérez lâchement les bouchons et attendez de fermer jusqu’à ce que l’oxygène atteigne ~ 480 μM. Avec un mouvement de torsion, fermez lentement la chambre et laissez la respiration s’équilibrer (~15-20 min). Remplissez le capillaire central du bouchon avec MiR05 si nécessaire.
3. Détermination analytique de la capacité OXPHOS et ET (état de transfert d’électrons) de l’activité N-liée et NS et CIV (complexe IV) : Utilisez des microsyringes dédiées pour injecter des substrats, des découpleurs et des inhibiteurs dans des chambres entièrement fermées. Cliquez sur F4 à chaque injection pour nommer et horodater les événements de chaque chambre en temps réel. Tout au long de l’étude, sélectionnez F6 pour ajuster les échelles_de concentration d’O2 et de pente_O2 au besoin. Après chaque injection, laver les seringues 3 fois dans de l’eau (pour les composés solubles dans l’eau) ou à 70% d’éthanol (pour les composés dissous dans l’éthanol ou le DMSO).
   REMARQUE: lié à l’azote: flux O₂ soutenu par des combinaisons de substrats génératrices de NADH définies, lié au NS: flux O₂ soutenu par la convergence de combinaisons de substrats générées par le NADH et de succinate définis.
   1. Ajouter 5 μL de malate de 0,8 M (concentration finale de 2 mM) et passer immédiatement à l’injection suivante. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’eau.
   2. Ajouter immédiatement 5 μL de 1 M de pyruvate (concentration finale de 2,5 mM) et attendre que la respiration se stabilise. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’eau.
   3. Ajouter 10 μL de 0,5 M ADP (concentration finale de 2,5 mM) et attendre que la réponse ADP se stabilise. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’eau.
      REMARQUE : Un ADP supplémentaire (2,5-10 mM) peut être nécessaire pour s’assurer que les concentrations d’adénylate ne se limitent pas aux flux respiratoires.
   4. Ajouter 5 μL de glutamate 2 M (concentration finale de 5 mM) et attendre que la respiration se stabilise. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’eau.
   5. Ajouter 5 μL de cytochrome c de 4 mM (concentration finale de 10 μM) et attendre que la respiration se stabilise. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’eau.
   6. Ajouter 20 μL de 1 M de succinate (concentration finale de 10 mM) et attendre que la respiration se stabilise. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’eau.
   7. Titrer des incréments de 0,5-1 μL de 1 mM FCCP (concentration finale de 2-20 μM) et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection, continuer jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la respiration. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’éthanol à 70%.
   8. Ajouter 2 μL de roténone de 150 μM (concentration finale de 150 nM-2 μM) et attendre que la respiration se stabilise. Ajouter 1 μL de roténone pour s’assurer qu’il n’y a plus d’inhibition. S’il y a une diminution de la respiration, continuez avec des injections supplémentaires jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de diminution de la respiration. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’éthanol à 70%.
   9. Ajouter 2 μL de 125 μM d’antimycine A (concentration finale de 125 nM-5 μM) et attendre que la respiration se stabilise. Ajouter 1 μL d’antimycine A pour s’assurer qu’il n’y a plus d’inhibition. S’il y a une diminution de la respiration, continuez avec des injections supplémentaires jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de diminution de la respiration. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’éthanol à 70%.
   10. Vérifiez la concentration en oxygène de la chambre; si la concentration est inférieure à 125 μM, réoxygéner dans l’air ambiant ou hyperoxygéner légèrement pour s’assurer que l’oxygène ne limite pas le flux respiratoire. Ajouter 5 μL d’ascorbate de 0,8 M (concentration finale de 2 mM). Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’éthanol à 70%.
   11. Ajouter immédiatement 10 μL de 0,2 M TMPD (concentration finale de 1 mM) attendre une augmentation de la respiration lente. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’éthanol à 70%.
   12. Ajouter 25 μL d’azoture de sodium 4 M (concentration finale de 50 mM) immédiatement lorsque le flux respiratoire d’Ascorbate/TMPD plafonne. Lavez la seringue d’injection 3 fois dans de l’éthanol à 70%.
   13. Terminez l’étude - cliquez sur Fichier, Enregistrer et Déconnecter. Continuez à laver la chambre et la seringue en suivant les étapes 9.2 à 9.3.

6. Protocole de sensibilité ADP

1. Une fois l’instrument étalonné et l’échantillon préparé, retirez les bouchons avec un mouvement de torsion et aspirez le MiR05 des chambres (en évitant la membrane exposée à l’intérieur de la chambre). Bien mélanger l’homogénat et ajouter 2,25 mL de l’homogénat à la chambre. Supposons l’ajout d’un homogénat à plusieurs chambres, pipeter 1 mL à la fois dans chaque chambre tout en mélangeant l’homogénat pour assurer une distribution tissulaire égale. Cliquez sur F4 pour nommer et horodater l’événement et cliquez sur OK.
2. Insérez les bouchons et, avec un mouvement de torsion, fermez lentement la chambre et laissez la respiration s’équilibrer (~15-20 min). Remplissez le capillaire central du bouchon avec MiR05 si nécessaire.
3. Détermination analytique de la sensibilité mitochondriale À l’ADP liée au succinate : Cliquez sur F4 à chaque injection pour nommer et horodater les événements de chaque chambre en temps réel. Tout au long de l’étude, sélectionnez F6 pour ajuster les échelles_de concentration d’O2 et de pente_O2 au besoin.
   1. Ajouter 2 μL de 150 μM de roténone (concentration finale de 150 nM).
   2. Ajouter immédiatement 20 μL de 1 M de succinate (concentration finale de 10 mM) et attendre que la respiration se stabilise.
   3. Titrer l’ADP par addition progressive de concentrations sous-saturées jusqu’à atteindre le taux de réponse maximal (V_MAX; concentration finale de 2,5 à 10 mM).
      REMARQUE: Le taux peut plafonner après l’injection en raison d’un petit changement dans la concentration d’ADP, augmentant ainsi la concentration d’injection après chaque plateau et continuant avec le titrage jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’augmentation de la respiration, même avec une augmentation de la concentration d’injection d’ADP.

7. Expériences d’optimisation recommandées

1. Déterminer l’homogénat optimal et la concentration en oxygène pour le protocole.
   1. Exécuter le protocole SUIT (étapes 5.1 à 5.3) à plusieurs concentrations tissulaires (p. ex., 30 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 5 mg/mL, 2,5 mg/mL, 1 mg/mL et/ou 0,5 mg/mL).
   2. Sélectionnez une concentration qui maximise le flux respiratoire tout en limitant la fréquence des réoxygénations (pas plus de 1-2). Si des réoxygénations plus fréquentes sont nécessaires, diminuez la concentration de l’homogénat.
2. Déterminez le nombre optimal de coups avec l’homogénéisateur.
   1. Effectuer le protocole SUIT (étapes 5.1 à 5.3) à plusieurs niveaux d’homogénéisation (p. ex., 5 coups, 10 coups, 15 coups, 20 coups).
   2. Comme il n’y a pas suffisamment de données dans la littérature pour déterminer un seuil de pourcentage d’augmentation du cytochrome c avec la préparation d’homogénat tumoral, choisissez la préparation avec une réponse limitée au cytochrome c mais une respiration adéquate énergisée par le(s) substrat(s) d’intérêt.
3. Déterminer les concentrations optimales de substrat, d’ADP, de découpleur et d’inhibiteurs nécessaires pour les flux respiratoires quantitatifs et reproductibles.
   1. Exécuter le protocole SUIT (étapes 5.1 à 5.3.9) à la concentration tissulaire choisie (étape 7.1). Titrer chaque substrat, découpleur, inhibiteur et ADP jusqu’à ce qu’aucune autre réponse ne soit observée. Titrer l’inhibition avec de l’azoture de sodium dans des expériences séparées.
      1. Ajouter 5 μL de malate de 0,8 M (concentration finale de 2 mM) et passer immédiatement à l’injection suivante.
      2. Titrer des incréments de 1 μL de 1 M de pyruvate et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection, continuer jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la respiration.
      3. Titrer des incréments de 2 μL de 0,5 M ADP et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection, continuer jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la respiration.
      4. Titrer des incréments de 1 μL de 2 M de glutamate et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection, continuer jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la respiration.
      5. Ajouter 5 μL de cytochrome c de 4 mM (concentration finale de 10 μM) et attendre que la respiration se stabilise.
      6. Titrer des incréments de 5 μL de 1 M de succinate et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection, continuer jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la respiration.
      7. Titrer des incréments de 5 μL de 0,5 M ADP et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection, continuer jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la respiration.
      8. Titrer des incréments de 0,5 μL de 1 mM FCCP et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection, continuer jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la respiration.
      9. Titrer des incréments de 1 μL de 150 μM de roténone et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection, continuer jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de diminution de l’augmentation de la respiration.
      10. Titrer des incréments de 1 μL de 125 μM d’antimycine A et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection, continuer jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de diminution supplémentaire de la respiration.
      11. Ajouter 5 μL d’ascorbate de 0,8 M (concentration finale de 2 mM).
      12. Ajouter immédiatement 5 μL de 0,2 M TMPD (concentration finale de 0,5 mM) attendre l’augmentation de la respiration lente. Dans une expérience distincte, ajouter 10 μL de TMPD de 0,2 M (concentration finale de 1 mM).
      13. Dans des expériences séparées, ajouter 10 μL, 25 μL, 50 μL et 100 μL d’azoture de sodium 4 M (concentration finale de 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, respectivement) immédiatement lorsque le flux respiratoire d’Ascorbate / TMPD plafonne.
   2. Choisissez le substrat et les concentrations d’inhibiteurs qui saturent lors de la première injection pour améliorer le calendrier de l’expérience. Utilisez l’ADP à des concentrations saturantes ou sous-saturées pour combiner les évaluations de sensibilité à l’ADP avec les protocoles SUIT traditionnels.
   3. Utilisez des concentrations de découpleur inférieures au maximum pour démontrer la réactivité à la dose sans inhibition du flux respiratoire.

8. Analyse des données

1. Analyse SUIT
   1. Sélectionnez les taux d’équilibre ou de pointe de chaque titrage et exportez pour la réduction analytique.
   2. Exprimez les données en pmol O₂ par seconde et par mg de tissu (pmol/s/mg).
   3. Obtenir la réduction analytique des PM-L, PM-P, PMG-P, PMGS-P et PMGS-E en soustrayant le taux d’insensibilité à l’antimycine A du taux respectif (c.-à-d. le taux à l’état d’équilibre obtenu après addition d’ADP).
      NOTE: PM: Pyruvate + Malate; PMG: Pyruvate + Malate + Glutamate; PMGS: Pyruvate + Malate + Glutamate + Succinate; -L: État de fuite; -P : État de phosphorylation oxydative, -E : État de transfert d’électrons.
   4. Obtenir la réduction analytique du CIV-E en soustrayant le taux insensible à l’azoture de sodium du taux maximal d’ascorbate/TMPD.
   5. Obtenir la réduction analytique du PMG-E en soustrayant le taux insensible à la roténone du taux PMGS-E.
   6. Obtenir la réduction analytique de S-E en soustrayant le taux insensible à l’antimycine A du taux insensible à la roténone.
   7. Atteindre la réduction analytique de l’efficacité de contrôle du cytochrome c, un marqueur de l’intégrité de la membrane externe, par l’équation suivante:
      j_c = ((J_CHNOc - J_CHNO)/J_CHNO) x 100
      Dans l’équation, j_c est l’augmentation en % lors de l’addition du cytochrome c,J_CHNOc est le flux d’oxygène après l’ajout du cytochrome c,et J_CHNO est le flux d’oxygène avant l’ajout du cytochrome c.
2. Analyse de sensibilité ADP
   1. Déterminer analytiquement la cinétique de la sensibilité ADP par rapport au taux de fuite de succinate + roténone (et non le taux d’homogénat tissulaire).
   2. Tracer le flux O₂ (axe Y) par rapport à la concentration relative d’ADP (axe X). Déterminer la vitesse respiratoire maximale (V_max)comme le taux de pointe atteint sur le titrage ADP.
   3. Déterminer la cinétique de Michaelis-Menten à l’aide d’un logiciel d’ajustement de courbe (PRISM, version 10.1) pour révéler la concentration d’ADP à laquelle 1/2 V_MAX est atteint (Apparent K_M).

9. Contrôle instrumental de la qualité

1. Effectuer un fond D’O2 instrumental sur la plage de concentration d’oxygène souhaitée (0-600 μM) et un étalonnage nul.
   1. Effectuer les étapes 3.1 et 3.2
   2. Retirez les bouchons et aspirez l’éthanol à 70% des chambres (en évitant la membrane exposée à l’intérieur de la chambre). Rincer 4 fois avec du H_2Odouble distillé et remplir la chambre avec 2,25 mL de MiR05
   3. Hyperoxygéner les chambres à ~600 μM d’oxygène.
   4. Insérez lentement les bouchons dans leur position complètement fermée. Siphonner l’excès de milieu éjecté à travers le capillaire d’injection et recueilli dans le puits du bouchon et permettre au signal d’oxygène de se stabiliser (30-45 min).
   5. Pour effectuer l’étalonnage de l’oxygène, sélectionnez la région où la concentration et la pente d’oxygène sont stables, ouvrez la fenêtre d’étalonnage de la chambre respective et sélectionnez la marque R1.
   6. Préparer la solution de dithionite en dissolvant 20 mg d’hydrosulfite de sodium dans 0,5 mL d’eau. Limitez l’exposition à l’air car la dithionite est oxydée au fil du temps avec l’exposition à l’oxygène.
   7. Une fois le signal d’oxygène stabilisé, injectez 1 μL et observez la baisse de la concentration en oxygène. Ajuster la puissance de la solution de dithionite au besoin.
   8. Injecter une solution suffisante de dithionite pour abaisser la concentration d’oxygène à 450 μM, 300 μM, 225 μM, 150 μM, 75 μM et 0 μM, respectivement. À chaque injection, laissez l’oxygène se stabiliser et sélectionnez une marque pour la pente à l’état d’équilibre. Une fois que la concentration en oxygène est d’environ 0 μM, marquez la concentration en oxygène.
   9. Pour effectuer une correction instrumentale de l’arrière-plan O_2, sélectionnez la fenêtre de flux/pente de la chambre respective, sélectionnez Étalonnage de l’arrière-plan O₂ et cliquez sur Calibrer pour les marques d’intérêt.
   10. Pour effectuer un étalonnage nul, ouvrez la fenêtre d’étalonnage de la chambre respective et sélectionnez la marque R0 obtenue après titrage de la dithionite.
2. Nettoyage des instruments
   1. Rincez rapidement chaque chambre à l’eau pure trois fois. Pour le premier lavage, aspirez l’homogénat, remplissez complètement la chambre d’eau, puis aspirez l’eau. Pour le deuxième lavage, remplissez la chambre 3/4 pleine d’eau, insérez les bouchons pour forcer l’eau à travers le capillaire d’injection, aspirez une partie de l’eau à travers le capillaire d’injection, puis retirez les bouchons pour aspirer complètement le lavage.
   2. Lavez les chambres avec de l’éthanol à 70% pendant 5 min.
   3. Au-dessus d’un évier ou d’un bécher, nettoyez les bouchons avec de l’eau pure, 70% d’éthanol et 100% d’éthanol, en forçant le liquide à travers les capillaires d’injection à l’aide d’une bouteille de lavage.
   4. Rincez rapidement chaque chambre à l’eau pure deux fois.
   5. Incuber les chambres avec 2 mL de PBS contenant environ 2 mg de mitochondries congelées, de lysat cellulaire ou de fibroblastes vivants pendant 15 minutes.
   6. Lavez les chambres à l’eau pure pendant 5 min deux fois.
   7. Lavez les chambres avec de l’éthanol à 70% pendant 5 min deux fois.
   8. Lavez les chambres avec 100% d’éthanol pendant 10 min.
   9. Remplissez les chambres avec de l’éthanol à 70%.
      1. Si vous effectuez une expérience consécutive, laissez les chambres dans de l’éthanol à 70% pendant 5 min, puis passez à l’étape 3.3.
      2. Si les expériences sont terminées, mettez des couvercles sur les bouchons et éteignez l’instrument.
3. Après chaque utilisation, nettoyez correctement les seringues d’injection et gardez les seringues dédiées à une utilisation de composé spécifique pour éviter tout transfert.
   1. Insérez la seringue dans le liquide de lavage et immergez complètement l’aiguille d’injection.
   2. Aspirez le liquide de lavage dans la seringue au volume maximal.
   3. Retirez la seringue du récipient de lavage, éjectez le liquide de lavage dans un bécher, puis épongez la seringue sur une serviette en papier.
   4. Répétez les étapes 9.3.1 à 9.3.3 trois fois dès que possible après chaque utilisation.

Les études initiales ont révélé que les tumeurs à EO771 étaient faiblement oxydatives et nécessitaient donc des concentrations élevées d’homogénat pour une évaluation adéquate du flux d’O2. Des expériences d’optimisation ont été menées pour déterminer la plage de concentration optimale d’homogénat tissulaire pour l’étude. Les homogénats tumoraux ont d’abord été préparés à 40 mg/mL, puis dilués linéairement. Le flux d’O2 normalisé à la masse tissulaire était cohérent entre les concentrations(figures 1A-D). Il a été observé que 40 mg/mL entraînaient un épuisement rapide de l’oxygène et ne convenaient pas à l’expérimentation(figure 1A). La consommation d’oxygène a considérablement ralenti avec 30 mg/mL et 20 mg/mL mais a tout de même diminué rapidement en peu de temps en l’absence de substrats ou d’ADP(Figure 1B,C). La concentration de 10 mg/mL a donné lieu au taux optimal de consommation d’oxygène(figure 1D)qui permettrait de prendre en charge un protocole SUIT plus long de 90 minutes.

Un protocole SUIT a été utilisé pour évaluer l’OXPHOS et l’ET liés au NADH et au succinate, ainsi que l’activité CIV (Figure 2A). Le pyruvate et le malate ont été ajoutés à l’homogénat tissulaire en l’absence d’ADP pour entraîner une fuite (L) à travers le NADH. L’ADP saturé a ensuite été ajouté pour entraîner un maximum d’OXPHOS (P) lié au NADH, suivi de l’ajout de glutamate. Le cytochrome c a ensuite été ajouté pour assurer l’intégrité de la membrane externe; l’augmentation de la fréquence respiratoire était inférieure à 20 % dans tous les échantillons(figure 2B). Compte tenu de la très faible réponse aux substrats liés au NADH, la libération de cytochrome c a également été évaluée en présence de succinate et de roténone et a observé une stimulation minimale du cytochrome c (Figure 2B). Fait intéressant, OXPHOS lié au NADH était négligeable dans les tumeurs à EO771(Figure 2C). Le succinate a ensuite été ajouté en présence de pyruvate, de malate et de glutamate pour stimuler le flux d’électrons à travers la succinate déshydrogénase. Le FCCP a ensuite été titré pour entraîner le flux maximal d’électrons (E), ce qui a révélé que dans les tumeurs EO771, la phosphorylation plutôt que l’oxydation limitait la respiration(Figure 2C). La roténone et l’antimycine A ont ensuite été titrées pour inhiber les complexes I et III, respectivement. L’ascorbate et le TMPD ont ensuite été ajoutés pour entraîner un flux maximal d’électrons à travers le CIV, qui est ensuite inhibé par l’azoture de sodium. Le tableau 1 illustre les équations analytiques de réduction des données brutes (tableau 2) pour quantifier les paramètres respiratoires tracés à la figure 2C. Dans l’ensemble, les profils respiratoires homogénéisés de la tumeur(Figure 2C)sont similaires à ceux des cellules EO771 perméabilisées par la digitonine non implantées (Figure 2D), à l’exception du transfert maximal d’électrons diminué soutenu par des substrats liés à la N et au S dans la tumeur.

Étant donné que la respiration liée au NADH était négligeable, la cinétique respiratoire du succinate a été évaluée par des titrages progressifs de l’ADP sous-saturé jusqu’à ce que le taux maximal (VMAX)soit atteint(Figure 3A,3B). La concentration demi-maximale (KM)d’ADP en présence de succinate + roténone était de 37,5 μM, tandis que le VMAX était d’environ 10,5 pmol/s/mg(Figure 3C). Ainsi, malgré des taux d’oxydation relativement faibles, les tumeurs EO771 étaient très sensibles à l’ADP et maintenaient la synthèse de l’ATP à des concentrations d’ADP relativement faibles.

La sélection des régions appropriées des données brutes pour l’extraction est essentielle à la reproductibilité des expériences et à la quantification précise. Pour le cytochrome c, une marque doit être sélectionnée à l’état d’équilibre immédiatement avant l’injection(Figure 4A, marque 1). Il y a souvent un artefact d’injection initiale qui peut être suivi d’une période de temps (environ 5-10 min) où le flux O2 n’est pas stable. L’évaluation de l’efficacité du cytochrome c se fait en faisant une sélection supplémentaire une fois que le fluxO2 s’est stabilisé(Figure 4A,marque 2). Les sélections après l’ajout de substrats, d’ADP ou de la plupart des inhibiteurs sont également effectuées après l’artefact d’injection et une fois que le flux d’O2 s’est stabilisé(Figure 4B). La sélection utilisée pour déterminer la respiration maximale non couplée se fait au pic d’augmentation obtenu lors du titrage du FCCP, qui n’est souvent pas la dernière injection faite (Figure 4C). La sélection pour le TMPD est faite après l’ajout de l’ascorbate et du TMPD et au pic de l’augmentation de la respiration (Figure 4D, marque 1). Juste après ce pic, l’inhibiteur, l’azoture de sodium, est ajouté, ce qui diminue rapidement la respiration mais a aussi souvent un artefact d’injection inférieur à la fréquence respiratoire inhibée(Figure 4D). La marque de l’inhibiteur est faite immédiatement après l’artefact d’injection (Figure 4D, marque 2). Le flux o2 ne se stabilisera généralement pas et continuera à diminuer.

Tableau 1 : Notation respiratoire et dérivation analytique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Caractéristiques de l’échantillon et des voies respiratoires des homogénats de tumeurs mammaires luminales B. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1: Optimisation de la concentration en homogénat tumoral. FluxO2 (rouge) etO2 Concentration (bleu) dans les homogénats tumoraux mammaires préparés à (A) 40 mg/mL, (B) 30 mg/mL, (C) 20 mg/mL, et (D) 10 mg/mL. Thom : Respiration de l’homogénat tissulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Évaluation de la capacité OXPHOS et ET par respirométrie à haute résolution dans des homogénats tumoraux fraîchement excisés. (A) Graphique représentatif de la consommation d’oxygène (rouge) et des concentrations (bleu) au cours d’un substrat, inhibiteur, protocole de découpleur. PM: Pyruvate + Malate, D: ADP, G: Glutamate, c: Cytochrome c, S: Succinate, F: FCCP, Rot: Roténone, Ama: Antimycine A, Asc / TMPD: Ascorbate / Tétraméthyl-p-phénylènediamine. (B) Pourcentage d’augmentation du fluxo2 lors de l’ajout du cytochrome c. (C-D) Respiration soutenue par le malate, le pyruvate, le glutamate et le succinate en présence d’ADP, de FCCP et d’ascorbate/TMPD dans les homogénats tumoraux dérivés de l’EO771(C)et(D)les cellules perméabilisées à la digitonine EO771 non implantées. Thom: Respiration homogénéisée tissulaire; PM: Pyruvate + Malate; PMG: Pyruvate + Malate + Glutamate; PMGS: Pyruvate + Malate + Glutamate + Succinate; CIV: Complexe IV; -L : État de fuite ; -P : État de phosphorylation oxydative, -E : État de transfert d’électrons ; Lié à l’azote : fluxo2 soutenu par des combinaisons de substrats génératrices de NADH définies; Lié au NS : flux d’O2 soutenu par la convergence de combinaisons de substrats générés par le NADH et le succinate définis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Tumeurs mammaires EO771 présentant une sensibilité élevée à l’ADP (adénosine 5′-diphosphate). (A) Graphique représentatif de la consommation d’oxygène (rouge) et des concentrations (bleu) tout au long d’un protocole de titrage ADP lié à S. Thom: Respiration homogénéisée tissulaire; S/Pourriture : Succinate/Roténone ; D : ADP. (B) Respiration soutenue par le succinate en présence de roténone et des concentrations croissantes d’ADP (0 μM ADP = S/Rot-L). (C) Taux maximal (VMAX)et demi-concentration maximale (KM)d’ADP en présence de succinate + roténone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Traçage représentatif illustrant la sélection de marques des flux d’O2 bruts pour l’extraction des données. (A) Cytochrome c sélection : sélection numéro 1 avant l’injection de Cytochrome c et sélection numéro 2 après l’injection lorsque le flux d’O2 s’est stabilisé. c Cytochrome c. (B) Sélection du substrat, de l’ADP et de l’inhibiteur : sélection numéro 1 après l’injection (succinate dans ce diagramme représentatif) où le fluxO2 s’est stabilisé. S : Succinate. (C) Sélection du découpleur: sélection numéro 1 au pic d’augmentation de la respiration pendant le titrage du découpleur. Dans ce diagramme de titrage FCCP représentatif, la troisième injection diminue légèrement la respiration et n’est donc pas utilisée pour la sélection. F : ACCP. (D) Sélection TMPD: sélection numéro 1 au pic d’augmentation de la respiration après les injections d’ascorbate et de TMPD. Sélection de l’azoture de sodium: sélection numéro 2 après l’artefact d’injection aiguë lorsque la respiration diminue initialement. As/Tm : Ascorbate/TMPD; Azd : Azide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts lié à ce travail.