Développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde ^1,2. Cependant, le processus de traitement de la reperfusion peut lui-même provoquer la mort des cardiomyocytes, connue sous le nom de lésion d’ischémie / reperfusion myocardique (IR), pour laquelle il n’existe toujours pas de remède efficace³. Les cellules endothéliales (CE) ont été suggérées pour protéger les cardiomyocytes (CM) par la sécrétion de signaux paracrines, ainsi que par des interactions de cellule à cellule⁴.

Les modèles de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier le rôle des interactions cellule-cellule autocrine et/ou paracrine sur la fonction et la différenciation cellulaires. Parmi les modèles de co-culture, la co-culture mixte est la plus simple, où deux types différents de cellules sont en contact direct dans un seul compartiment de culture à un rapport cellulaire souhaité⁵. Cependant, des traitements distincts entre les types de cellules et l’analyse en aval d’un seul type de cellule ne sont pas facilement réalisables compte tenu de la population mixte.

Des études antérieures ont indiqué que les insultes hypoxiques et ischémiques causent des dommages importants à l’intégrité de la membrane cellulaire mesurée par la libération de lactate déshydrogénase (LDH). Cette blessure est aggravée lors de la réoxygénation, imitant la lésion de reperfusion ^6,7,8. L’objectif du protocole actuel était de tester les hypothèses selon lesquelles la présence d’EC peut atténuer en fonction de la dose les fuites de membrane cellulaire des CM causées par l’hypoxie et la réoxygénation (HR) et que l’effet protecteur des CE peut être optimisé en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires. Ainsi, nous avons utilisé trois types d’inserts de culture cellulaire et des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes. Les inserts, marqués par Corning, Merck Millipore et Greiner Bio-One, nous ont permis de créer trois conditions de diaphonie de culture cellulaire différentes avec des distances intercellulaires de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. 100 000 CE ont été plaqués par insert dans chaque cas.

De plus, afin de déterminer si la densité des CE en co-culture contribue à l’atténuation des lésions HR dans ce modèle, nous avons étudié la relation dose-réponse entre la concentration d’EC et la libération de LDH par les CM. Les EC ont été plaqués à 25 000, 50 000 et 100 000 par insert, respectivement, dans l’insert de 2,0 mm.

Le présent rapport offre aux enquêteurs une approche étape par étape pour qu’ils utilisent cet important modèle à leur avantage.

1. Préparation/placage expérimental

1. Entretenez les CM et les CE conformément aux instructions du fabricant.
   1. Décongelez les deux lignées cellulaires lorsqu’elles arrivent des fournisseurs. Plaque dans des flacons T25 après avoir été lavée avec du milieu frais. Il est recommandé d’acheter chaque milieu de culture cellulaire auprès des mêmes fournisseurs que ceux auprès desquels les cellules ont été achetées. Le lendemain, rafraîchissez les cellules avec un support et utilisez-les lorsqu’elles sont confluentes.
   2. Maintenez l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 21 % O₂, 5 % CO₂, 74 % N₂ et maintenez-le humidifié.
      REMARQUE: Les cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris utilisées dans ce protocole sont isolées des artères coronaires de souris C57BL / 6, et les cardiomyocytes de souris adultes sont isolés à partir de cœurs de souris C57BL / 6J adultes et obtenus commercialement (voir tableau des matériaux).
2. Plaques CM dans des conditions stériles sur le fond de plaques de 24 puits (couche inférieure). 24 h plus tard, plaquez les CE dans l’insert (ou la partie supérieure) du puits de co-culture. 24 h après le placage EC, placez les inserts EC sur des bases de plaques CM, commençant la période de co-culture. Laisser les cellules co-cultiver pendant au moins 12-24 h avant utilisation. Ces étapes sont décrites en détail ci-dessous.
   1. Estimer la confluence des lignées cellulaires CM au microscope optique. Lorsque les cellules semblent être confluentes à 90% à 100% dans des flacons de culture, procédez au placage expérimental.
   2. Retirer le milieu des flacons contenant des cultures cellulaires confluentes et trypsiniser avec 3 à 5 mL de trypsine/acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour les flacons de T25. Agiter doucement la fiole, incuber à 37 °C pendant 2 à 5 min, puis évaluer la progression enzymatique au microscope optique. Une fois que les cellules commencent à s’arrondir, utilisez un grattoir à cellules pour détacher les cellules de la surface.
   3. Après le détachement, inactiver la solution de trypsine en ajoutant la solution de trypsine/cellule dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de milieu pour les flacons de T25. Centrifuger la suspension de la cellule à 120 x g pendant 2 min pour obtenir une pastille de cellule molle. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 5 mL de support.
   4. Pour effectuer le comptage cellulaire et confirmer la viabilité cellulaire, mélanger une aliquote de 10 μL de cellules remises en suspension et 10 μL de colorant bleu de trypan. Comptez les cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules. Diluer les cellules avec des milieux frais réguliers pour obtenir les densités d’ensemencement souhaitées. Les volumes sont calculés en fonction de la densité de graines souhaitée et de la concentration cellulaire des solutions mères. Tout placage doit être effectué dans des conditions stériles.
   5. Plaques CM à des densités d’ensemencement de 300 000 par puits sur le fond d’une plaque de 24 puits pré-enduite de matrice extracellulaire. Maintenez les cellules à 37 °C avec 21 % d’O2_et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
   6. Après 24 h, les EC de plaque dans des inserts à une densité de placage optimale de 100 000 par insert (la surface de culture est de 33,6 mm²) (Figure 1). Après 24 h de placage EC, placez des inserts EC à l’intérieur des puits CM, initiant ainsi la co-culture. Permettre aux cellules de co-cultiver pendant 12-24 h avant d’effectuer les expériences.
   7. Assurez-vous qu’au moment où les expériences sont effectuées, les CM et les CE ont atteint une confluence de 80 % à 90 %.

2. Hypoxie/réoxygénation pour simuler une lésion d’ischémie/reperfusion in vitro

REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées comme décrit, ne faites pas de pause entre les deux.

1. Préparez le milieu hypoxique en versant environ 25 mL de milieu dans un tube conique de 50 mL. Scellez le dessus à l’air avec une membrane en silicone et utilisez une pipette stérilisée pour percer un trou. Créez un autre trou, cette fois en laissant la pipette immergée environ 2/3 dans le média.
2. Rincer le milieu avec du gaz hypoxique (0,0125 % O₂, 5 % CO₂, 94,99 % N₂) pendant 5 min à un débit de 30 L/min. Cela minimise_l’O2 dissous dans le milieu lorsque l’hypoxie commence (étape 2.5).
3. Jeter les milieux des plaques de 24 puits ou des inserts de culture contenant des cellules attachées et laver avec 100 μL / puits de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 10% très doucement. Ensuite, ajoutez 500 μL de milieux hypoxiques fraîchement préparés à chaque puits des plaques ou des inserts.
   REMARQUE: L’hypoxie dans les médias est interrompue aussi brièvement que possible au cours de cette étape avant que la véritable hypoxie pour les cellules et les médias ne commence à l’étape 2.5.
   1. Dans le groupe témoin normoxique, remplacez le milieu d’origine par un milieu normal frais contenant du glucose et du sérum.
4. Humidifiez la chambre d’hypoxie en plaçant une boîte de Petri remplie d’eau stérile dans la chambre. Ensuite, placez les plaques comprenant les groupes hypoxiques dans la chambre.
5. Rincer la chambre d’hypoxie avec du gaz hypoxique (0,0125% O₂, 5% CO₂, 94,99% N₂) pendant 5 min à un débit de 30 L/min. Placez la chambre dans l’incubateur à 37 °C pendant 24 h.
6. Après l’hypoxie, cultivez les CM et les CE dans des conditions normales. Pour ce faire, jetez l’ancien milieu des plaques/inserts, remplacez-le par un milieu normal (contenant du glucose et du sérum; 500 μL de chaque puits/insert) et conservez-le dans l’incubateur dans des conditions de culture normales (21 % O₂, 5 % CO₂, 74 % N₂, 37 °C) pendant 2 h pour imiter la reperfusion.
7. Pour contrôler les effets du remplacement du milieu, modifiez le milieu des cellules normoxiques en même temps que le milieu hypoxique est modifié.
   REMARQUE : La figure 2 fournit une vue d’ensemble schématique de ce protocole.

3. Évaluation des points de terminaison

1. Transférer le milieu de culture cellulaire de la plaque de 24 puits dans une plaque de 96 puits. Utilisez 200 μL de média de chaque puits de la plaque de 24 puits et répartissez également dans quatre puits de la plaque de 96 puits, en conséquence. Utilisez une plaque chacune pour la normoxie par rapport à l’hypoxie par rapport à la HR.
2. Déterminer le degré de lésion cellulaire, par exemple, en mesurant l’absorbance de la LDH à l’aide d’une trousse de dosage de cytotoxicité en suivant les instructions du fabricant. Effectuez le test dans une plaque de 96 puits comme indiqué dans le protocole d’essai.

4. Statistiques

1. Affichez les données paramétriques sous forme d’écart-type moyen et les données non paramétriques sous forme de diagrammes en boîte avec plage médiane/interquartile. Des tests de comparaisons multiples paramétriques et non paramétriques adéquats avec des tests post-hoc acceptables pour réduire le risque d’erreur de type 1 doivent être effectués. La signification est généralement fixée à un alpha de 0,05 (à deux queues).
2. Pour toutes les expériences réalisées dans la présente étude, effectuer au moins trois répliques de puits dans une expérience. Il y avait trois à six répétitions de chaque expérience utilisée pour l’analyse statistique.

Les trois types d’inserts (A, B, C) utilisés dans cette expérience ont la même taille de pores de 0,4 μm. La seule différence entre eux est la hauteur de l’insert à la base, qui permet aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement, (Figure 3) et qu’elles proviennent de fournisseurs différents (pour plus de détails, voir tableau des matériaux).

Pour établir un modèle de co-culture in vitro avec des couches séparées de deux lignées cellulaires subissant une HR pour simuler une lésion IR, nous avons examiné l’intégrité de la membrane cellulaire des CM co-cultivés avec ou sans EC. L’utilisation d’un insert séparé pour les CE qui peut être placé à des distances variées au-dessus de la couche CM nous a également permis d’évaluer les effets différentiels de la distance de la couche cellulaire sur la gravité des dommages membranaires dans les CM. Dans un ensemble distinct d’expériences, nous avons fait varier la densité des CE et donc le rapport des CE par rapport aux CM. En outre, pour différencier l’ischémie simulée de la lésion IR simulée, des expériences ont été menées dans des conditions de 1) normoxie, 2) hypoxie uniquement et 3) HR. Pour ce modèle, nous avons utilisé une hypoxie de 24 heures, suivie d’une réoxygénation de 2 heures.

Distances variables
Distance de 0,5 mm entre les couches cellulaires (Insert A)
Lorsque les CM ont été cultivés seuls, l’hypoxie a entraîné une augmentation significative de la libération de LDH par rapport à la normoxie, ce qui est cohérent avec nos études précédentes (Figure 4A)6. Cependant, la LDH n’a été que légèrement augmentée après une réoxygénation de 2h par rapport au groupe d’hypoxie uniquement. Lorsque les EC et les MC ont été co-cultivés ensemble à une distance de 0,5 mm, l’augmentation de la libération de LDH par hypoxie seulement n’a pas été atténuée, ce qui indique que les EC n’ont montré aucun effet protecteur (par rapport au groupe des CM seuls dans les conditions d’hypoxie seulement). Cependant, les CE ont exercé une protection légère mais significative sur les CM pendant les RH.

Distance de 1,0 mm entre les couches cellulaires (insert B)
La même expérience a été réalisée que ci-dessus, sauf que la distance entre les deux couches cellulaires a été augmentée à 1,0 mm (figure 4B). Nous avons constaté que la libération de LDH était également significativement augmentée dans les CM uniquement par hypoxie uniquement. Cependant, contrairement à l’insert de 0,5 mm, l’augmentation de la LDH dans les CM uniquement a été potentialisée par HR sur l’hypoxie uniquement. De plus, cette potentialisation a été plus inhibée et presque abolie par la présence des CE lors de la réoxygénation par rapport au groupe des CM uniquement.

Distance de 2,0 mm entre les couches cellulaires (insérer C)
Lorsque des inserts de co-culture créant une distance de 2,0 mm entre les deux lignées cellulaires (Figure 4C) ont été utilisés, nous avons également constaté une augmentation significative de la libération de LDH par les CM uniquement pendant l’hypoxie, au même degré que dans les expériences de 0,5 mm et de 1,0 mm. Fait intéressant, cependant, l’augmentation supplémentaire de la libération de LDH par réoxygénation était encore plus prononcée que dans les expériences de 1,0 mm. Ces deux augmentations ont été atténuées, mais pas abolies, par la présence de CE, ce qui indique que, contrairement à l’utilisation d’inserts de 0,5 ou 1,0 mm, les EC protégeaient considérablement les CM contre les blessures dans des conditions d’hypoxie seulement et de HR.

Intensités CE variables
Dans un autre ensemble d’expériences, la concentration de CE plaqués dans des inserts de 2,0 mm a été titrée à 25 000, 50 000 et 100 000 cellules par insert, respectivement. La libération de LDH a été mesurée après 24 h d’hypoxie suivie d’une réoxygénation de 2 h. Nos résultats ont montré que l’augmentation de l’intensité de l’EC dans la co-culture entraînait une atténuation dose-dépendante de la libération de LDH causée par la HR (Figure 5); aucun effet de ce type n’a été observé dans des conditions normoxiques.

Figure 1 : Schéma de l’insert à l’intérieur du puits. Les inserts avec les CE (jusqu’à 100 000 cellules par insert) sont transférés sur les plaques de 24 puits avec les CM (300 000 par puits) sur leur fond. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Plan expérimental. Les cellules sont cultivées dans des conditions normales d’oxygène (21% O2), puis divisées en deux groupes: un groupe témoin normoxique continuera à être cultivé dans des conditions normales pendant encore 24 heures, tandis que le groupe hypoxie sera cultivé dans une chambre d’hypoxie pendant 24 h avec seulement 0,01% O2 et pas de glucose. Après ces interventions de 24 heures, les deux groupes de cellules sont rafraîchis avec des milieux et cultivés continuellement dans un environnement à21 % d’O2 pendant 2 heures supplémentaires, la phase de réoxygénation, avant de finalement effectuer le ou les essais de critère d’évaluation, par exemple l’analyse de la LDH. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images et schémas des trois différents encarts. La distance entre les cellules endothéliales dans l’insert et les cardiomyocytes au fond du puits peut être modifiée en utilisant différents inserts. Les trois types d’inserts utilisés ici ont la même taille de pores de 0,4 μm. La seule différence entre eux est la hauteur d’insertion à la base, qui permet aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5 (A), 1,0 (B) et 2,0 mm (C), respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Comparaison de trois types d’inserts de culture pour évaluer la libération de lactate déshydrogénase (LDH; en unités d’absorbance [au]) dans des conditions normoxiques (à gauche), d’hypoxie uniquement (au centre) et d’hypoxie/réoxygénation (à droite) pour les cardiomyocytes seuls (CM; blanc), les cellules endothéliales seules (EC; noir) et les co-cultures de CM avec EC (modèle de contrôle). (A) distance de 0,5 mm, (B) distance de 1,0 mm, C) Distance de 2,0 mm entre les deux couches cellulaires différentes. Les CE ont été plaqués à une densité de 100 000 cellules par insert, les CM à une densité de 300 000 cellules par puits. Les données sont moyennes ± écart-type, n = 4 par groupe. Statistiques : ANOVA suivie du test post-hoc Student-Newman-Keuls. P < 0,05 (à deux queues) indiqué par des barres horizontales entre chaque paire comparée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Concentration de cellules endothéliales co-cultivées (EC ; 25 : 25 000 cellules par insert ; 50 : 50 000 cellules par insert ; 100 : 100 000 cellules par insert) affectée par la dose de la protection des cardiomyocytes (CM) contre les lésions d’hypoxie/réoxygénation (à droite) par rapport aux conditions normoxiques (à gauche) comme en témoigne la libération de lactate déshydrogénase (LDH ; en unités d’absorbance [au]). Les CE n’ont eu aucun effet sur la libération de LDH dans des conditions normoxiques. Les données sont moyennes ± écart-type, n = 4 par groupe. Statistiques : ANOVA suivie du test post-hoc Student-Newman-Keuls. P < 0,05 (à deux queues) indiqué par des barres horizontales entre chaque paire comparée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.