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Article de méthode

Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre

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DOI :

10.3791/62932

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25 février 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Biology, Tokyo Medical University, 2Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, 3Department of Genetics, Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI)

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine 43 de liaison à l’ADN TAR (TDP-43) par la lumière dans les motoneurones de la colonne vertébrale en utilisant le poisson-zèbre comme modèle.

Résumé

L’agrégation anormale des protéines et la vulnérabilité neuronale sélective sont deux caractéristiques majeures des maladies neurodégénératives. Les relations causales entre ces caractéristiques peuvent être interrogées en contrôlant la transition de phase d’une protéine associée à la maladie dans un type de cellule vulnérable, bien que cette approche expérimentale ait été limitée jusqu’à présent. Ici, nous décrivons un protocole pour induire la transition de phase de la protéine de liaison ARN/ADN TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre pour modéliser l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 se produisant dans les motoneurones en dégénérescence dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Nous décrivons une méthode génétique basée sur le chromosome artificiel bactérien (BAC) pour administrer une variante optogénétique du TDP-43 de manière sélective aux motoneurones spinaux du poisson-zèbre. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet la transition de phase du TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux par un simple éclairage externe à l’aide d’une diode électroluminescente (LED) contre les poissons non retenus. Nous présentons également un flux de travail de base d’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et d’analyse d’images avec le logiciel Fiji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à l’éclairage lumineux. Ce protocole permet de caractériser la transition de phase du TDP-43 et la formation d’agrégats dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA, ce qui devrait faciliter l’étude de ses conséquences cellulaires et comportementales.

Introduction

Les granules de ribonucléoprotéines (RNP) contrôlent une myriade d’activités cellulaires dans le noyau et le cytoplasme en assemblant des partitions sans membrane via la séparation de phase liquide-liquide (LLPS), un phénomène dans lequel un fluide homogène se décompose en deux phases liquides distinctes1,2. Le LLPS dérégulé des protéines de liaison à l’ARN qui fonctionnent normalement comme des composants de granules RNP favorise une transition de phase anormale, conduisant à l’agrégation des protéines. Ce processus a été impliqué dans les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives3,4,5. L’évaluation précise d’une relation causale entre le LLPS aberrant des protéines de liaison à l’ARN et la pathogenèse de la maladie est cruciale pour déterminer si et comment le LLPS peut être exploité comme cible thérapeutique efficace. Le LLPS des protéines de liaison à l’ARN est relativement facile à étudier in vitro et dans des modèles unicellulaires, mais est difficile dans les organismes multicellulaires, en particulier chez les vertébrés. Une exigence critique pour l’analyse d’un tel LLPS dans des cellules individuelles dans un environnement tissulaire est d’exprimer de manière stable une sonde pour l’imagerie et la manipulation du LLPS dans un type de cellule vulnérable à la maladie.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est un trouble neurologique finalement mortel dans lequel les motoneurones du cerveau et de la moelle épinière sont perdus sélectivement et progressivement en raison de la dégénérescence. À ce jour, des mutations dans plus de 25 gènes ont été associées à la forme héréditaire (ou familiale) de la SLA, qui représente 5 % à 10 % du total des cas de SLA, et certains de ces gènes causant la SLA codent pour des protéines de liaison à l’ARN constituées de RNI, telles que hnRNPA1, TDP-43 et FUS6,7. De plus, la forme sporadique de la SLA, qui représente 90% à 95% du total des cas de SLA, est caractérisée par l’agrégation cytoplasmique de TDP-43 déposée dans les motoneurones en dégénérescence. Une caractéristique majeure de ces protéines de liaison à l’ARN associées à la SLA est leurs régions intrinsèquement désordonnées (IDR) ou domaines de faible complexité qui manquent de structures tridimensionnelles ordonnées et interviennent dans de faibles interactions protéine-protéine avec de nombreuses protéines différentes qui conduisent LLPS7,8. Le fait que des mutations causant la SLA se produisent souvent dans les IDR a conduit à l’idée que le LLP aberrant et la transition de phase de ces protéines liées à la SLA peuvent sous-tendre la pathogenèse de la SLA9,10.

Récemment, la méthode optoDroplet, une technique optogénétique basée sur Cryptochrome 2 qui permet la modulation des interactions protéine-protéine par la lumière, a été développée pour induire la transition de phase des protéines avec IDRs11. Comme cette technique a été étendue avec succès au TDP-43, elle a commencé à découvrir les mécanismes sous-jacents à la transition de phase pathologique du TDP-43 et sa cytotoxicité associée12,13,14,15. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode génétique pour délivrer un TDP-43 optogénétique aux types de cellules vulnérables à la SLA, à savoir les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre en utilisant le BAC pour le gène mnr2b / mnx2b codant pour une protéine homéodomaine pour la spécification des motoneurones16,17. La translucidité élevée des larves de poisson zèbre permet une stimulation lumineuse simple et non invasive du TDP-43 optogénétique qui déclenche sa transition de phase dans les motoneurones spinaux. Nous présentons également un flux de travail de base pour l’imagerie en direct des motoneurones rachidiens du poisson-zèbre et l’analyse d’images à l’aide du logiciel Fidji/ImageJ disponible gratuitement pour caractériser les réponses du TDP-43 optogénétique à la stimulation lumineuse. Ces méthodes permettent d’étudier la transition de phase du TDP-43 dans un environnement cellulaire vulnérable à la SLA et devraient aider à explorer ses conséquences pathologiques aux niveaux cellulaire et comportemental.

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Protocole

Tous les travaux sur les poissons ont été effectués conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (numéro d’identification d’approbation 24-2) de l’Institut national de génétique (Japon), qui a une assurance du bien-être animal dans ses dossiers (numéro d’assurance A5561-01) au Bureau du bien-être des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH, États-Unis).

1. Construction de CBC pour l’expression du gène optogénétique TDP-43 à partir du promoteur mnr2b

  1. Préparation bac
    1. Achetez un clone BAC de poisson zèbre contenant le locus mnr2b du poisson-zèbre (CH211-172N16, BACPAC Genomics). Purifier l’ADN BAC d’une culture LB de 5 mL pendant la nuit d’Escherichia coli DH10B (E. coli) hébergeant CH211-172N16 comme décrit dans Warming et al.18.
    2. Transformer CH211-172N16 en cellules SW102 E. coli par électroporation, comme décrit dans Warming et al.18.
      REMARQUE: La purification de l’ADN BAC de L’E. coli le même jour d’électroporation donne généralement un taux de réussite plus élevé de la transformation BAC18. Sinon, l’ADN BAC purifié est maintenu à -20 °C jusqu’à utilisation.
    3. Introduisez la cassette iTol2-amp pour la transgénèse BAC médiée par transposon Tol219 dans l’épine dorsale du CH211-172N16 par électroporation, comme décrit dans Asakawa et al.20.
      1. Fabriquer un stock de glycérol des clones de cellules d’E. coli porteurs de CH211-172N16 avec l’intégration de cassette iTol2-amp (CH211-172N16-iTol2A) après avoir confirmé l’intégration médiée par recombinaison homologue par réaction en chaîne par polymérase (PCR) (Ex Taq) en utilisant la paire d’amorces Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') et pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') et les conditions suivantes: une étape de dénaturation à 98 °C pendant 1 min, suivie de 25 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, d’un recuit d’apprêt à 55 °C pendant 15 s et d’une extension d’amorce à 72 °C pendant 1 min, amplifiant un produit PCR de 354 paires de bases (pb).
  2. mnr2b-hs:opTDP-43h construction
    1. Construire un plasmide portant la cassette d’expression pour le TDP-43/TARDBP de type sauvage humain (TDP-43h) qui est marqué avec mRFP1 et CRY2olig aux termini N et C, respectivement (ci-après, opTDP-43h)14.
      REMARQUE: Le fragment opTDP-43h doit être flanqué de la séquence promotrice du gène hsp70l du poisson-zèbre (650 pb) et de la séquence de signal de polyadénylation (polyA), suivie d’un gène de résistance à la kanamycine (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.
    2. Amplifier la cassette hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan avec des amorces qui recuit hsp70l et Kan et contiennent des séquences de 45 bp de l’amont et de l’aval des codons initiateurs du gène mnr2b par PCR (GXL DNA Polymerase) en utilisant la paire d’amorces mnr2b-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') et Km-r (5'-ggt tct tca gct aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') avec les conditions suivantes : une étape de dénaturation à 98 °C pendant 1 min, suivie de 30 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s, un recuit d’apprêt à 55 °C pendant 15 s et une extension d’apprêt à 68 °C pendant 30 s, amplification d’un produit PCR d’environ 5,7 pb.
    3. Séparez les produits pcR par électrophorèse sur gel d’agarose (100 V) et purifiez la bande d’ADN hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan avec une colonne d’ADN. Ajuster la concentration de la cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan purifiée à 50 ng/μL dans un tampon Tris-EDTA (TE) contenant 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) et 1 mM d’EDTA.
    4. Introduire la cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan dans CH211-172N16-iTol2A par électroporation comme décrit dans Warming et al.18 et sélectionner des transformants résistants à l’ampicilline et à la kanamycine sur des plaques de gélose LB. Ch211-172N16-iTol2A transportant la cassette hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan est désigné comme mnr2b-hs:opTDP-43h.
    5. Purifier mnr2b-hs:opTDP-43h à l’aide d’un kit de purification BAC et le dissoudre à 250 ng/μL dans TE après extraction phénol/chloroforme.
  3. mnr2b-hs:Construction EGFP-TDP-43z
    1. Construire un autre plasmide portant le tardbp de type sauvage du poisson-zèbre qui est marqué avec une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) à son terminus N (EGFP-TDP-43z) au lieu de opTDP-43h mais qui est par ailleurs identique à la construction hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14. Utilisez EGFP-TDP-43z comme contrôle interne pour la stimulation lumineuse de l’opTDP-43h.
    2. Construire CH211-172N16-iTol2A hébergeant la cassette hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan dans le locus mnr2b comme décrit dans 1.2.1-1.2.5. CH211-172N16-iTol2A transportant la cassette hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan est désigné comme mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z.

2. Transgénèse BAC médiée par transposon Tol2 chez le poisson-zèbre

  1. Préparer la solution injectable contenant 40 mM de KCl, du rouge phénol (10 % v/v), 25 ng/μL d’ADN mnr2b-hs:opTDP-43h et 25 ng/μL d’ARNm transposase Tol219.
  2. Injecter 1 nL de la solution injectable (une gouttelette d’un diamètre d’environ 123 μm calibrée dans de l’huile minérale) dans le cytosol d’embryons de poisson zèbre de type sauvage au stade unicellulaire. Dépister les poissons injectés pour la formation d’agrégats positifs de protéines fluorescentes rouges (RFP) dans divers tissus embryonnaires, y compris les motoneurones spinaux, sous un stéréomicroscope à fluorescence 2-3 jours après la fécondation (dpf). Élever le poisson rfP positif à l’âge adulte.
  3. Injecter l’ADN mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z comme décrit aux points 2.1 et 2.2. Élever les poissons POSITIFS À l’EGFP jusqu’à l’âge adulte.
  4. Après quelques mois, mettez les poissons injectés sexuellement matures et les poissons de type sauvage par paires dans des cages d’accouplement standard de 2 L pour obtenir une progéniture F1. Cribler les poissons F1 à 3 dpf pour la fluorescence RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) dans la colonne vertébrale motrice à l’aide d’un microscope à épifluorescence équipé d’une lentille d’objectif Plan-Neofluar 5x/0.15. En règle générale, un poisson fondateur est identifié à partir de 10 à 20 poissons injectés (le taux de transmission germinale est de 5% à 10%).
  5. Isolez et comparez plusieurs inserts Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] et Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] de différents poissons fondateurs, car l’intensité, mais pas le motif, de l’expression opTDP-43h ou EGFP-TDP-43z peut varier d’un poisson fondateur à l’autre en raison des effets de position chromosomique.
  6. Croisez les lignées de poissons Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] et Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] pour obtenir une progéniture contenant des poissons double transgéniques Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] dans un rapport mendélien.
  7. Élever le poisson dans un plat en plastique contenant 30 mL de tampon E3 (5 mM naCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10-5 % de bleu de méthylène) et ajouter 0,003 % (p/v) de N-phénylthiourée à 8-10 h après la fécondation (HPF) pour inhiber la mélanogenèse.
  8. Couvrir le plat en plastique avec du papier d’aluminium après 30 hpf.

3. Préparation de la LED pour l’éclairage de la lumière bleue

  1. Allumez un panneau LED à l’aide de l’application associée installée sur une tablette/un téléphone. Placez la sonde d’un spectromètre dans un puits vide d’une antenne parabolique de 6 puits et ajustez la lumière LED à la longueur d’onde culminant à ~ 456 nm à travers l’application. Placez le capteur optique d’un capteur de puissance optique dans le puits vide et réglez la puissance de la lumière LED (~ 0,61 mW / cm2). Le réglage de la lumière LED peut être enregistré et peut être récupéré dans l’application.
  2. Introduisez le réglage du panneau plat/LED dans l’incubateur à 28 °C. Terminez cette étape avant que l’imagerie des poissons ne commence à 48 hpf.

4. Imagerie de larves de poisson zèbre exprimant le TDP-43 optogénétique

  1. Sélectionnez Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] poisson double transgénique au moins avant 47 hpf, basé sur la fluorescence RFP (opTDP-43h) ou EGFP (EGFP-TDP-43z) dans la colonne motrice spinale à l’aide de la configuration du microscope à épifluorescence décrite ci-dessus.
  2. Déchorionate le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z].
  3. Préchauffer 1 % d’agarose à basse température de fusion contenant 250 μg/mL de sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate à 42 °C.
  4. Anesthésier brièvement le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] à 48 hpf dans le tampon E3 contenant la même concentration de Tricane.
  5. Mettez une goutte de l’agarose préchauffée à basse température de fusion de 1% sur le plat de base en verre à la température ambiante. Le diamètre de la goutte d’agarose en forme de dôme sur le plat en verre est de 8 à 10 mm.
  6. À l’aide d’une pipette Pasteur, ajouter le poisson anesthésié à l’agarose à basse température de fusion sur le plat de base en verre, puis mélanger en pipetant plusieurs fois. Minimisez la quantité de tampon E3 ajoutée à l’agarose avec le poisson.
  7. Maintenez le poisson sur le côté en utilisant une aiguille de seringue pendant la solidification de l’agarose (généralement ~ 1 min) pour s’assurer que la moelle épinière est dans une position horizontale appropriée. Après la solidification, placez quelques gouttes de tampon E3 sur le poisson monté sur l’agarose en forme de dôme.
  8. Acquérir des sections z confocales en série de la moelle épinière en scannant avec un microscope confocal équipé d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20x avec l’ouverture numérique 1,00, en utilisant une vitesse de balayage de 4,0 μs par pixel (12 bits par pixel), une taille de pas de 1,0 μm par tranche pour l’objectif et une combinaison de longueurs d’onde d’excitation / émission: Canal 1) 473/510 nm pour EGFP et canal 2) 559/583 nm pour mRFP1.
    REMARQUE: Le cloaque sur la face ventrale du poisson est inclus dans les régions d’intérêt (ROI) comme référence, ce qui aide à identifier et à comparer les segments de la colonne vertébrale (niveaux 16-17) à travers les points temporels.
  9. Retirez le poisson de l’agarose en craquant soigneusement l’agarose avec une aiguille de seringue dès que l’imagerie est terminée. Gardez la durée pendant laquelle le poisson est incrusté dans l’agarose aussi courte que possible, bien que l’encastrement de l’agarose pendant <30 min n’affecte pas la viabilité du poisson.

5. Stimulation lumineuse des poissons exprimant l’opTDP-43h par l’éclairage sur le terrain d’une diode électroluminescente bleue (LED)

  1. Ajouter 7,5 mL de tampon E3 au puits et placer le poisson double transgénique Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] imagé dans le puits. Placez la parabole à six puits sur le panneau LED en gardant la parabole et le panneau LED espacés de 5 mm avec une entretoise (par exemple, avec cinq verres coulissants empilés).
  2. Allumez le voyant LED bleu. Conservez une partie du poisson Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] à double transg dans un plat séparé de six puits recouvert de papier d’aluminium lorsque des poissons témoins non éclairés sont nécessaires (c.-à-d. dans des conditions sombres)14.
  3. Après l’éclairage (par exemple, pendant 24 h à 72 hpf sur la figure 3), imagez la moelle épinière du poisson illuminé en répétant les étapes 4.3 - 4.9.

6. Visualisation de la relocalisation cytoplasmique du TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux

  1. Ouvrez le fichier image dans ImageJ/Fiji21 (Version: 2.1.0/1.53c), un programme de traitement d’image Java open-source développé par NIH Image, qui peut être téléchargé à partir de https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Utilisez la barre de défilement Z pour vous déplacer dans les plans focaux. Créez une projection d’intensité maximale de plusieurs tranches en cliquant sur Image | Piles | | de projet Z Intensité maximale et réglage Tranche de démarrage et tranche d’arrêt qui couvrent les hémisegments de la colonne motrice spinale.
  3. Divisez l’image multicanal en deux images monocanal en cliquant sur Image | | de couleur Fractionner les canaux.
  4. Améliorez le signal EGFP-TDP-43z pour vous assurer que l’EGFP-TDP-43z cytoplasmique est clairement visible en cliquant sur Image | Ajuster | Luminosité/Contraste et réglage minimum
  5. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Trouvez les cellules identifiables dans les deux images à 48 hpf et 72 hpf, en fonction des positions relatives des corps cellulaires. Définissez les ROI en décrivant les contours des corps cellulaires des motoneurones spinaux uniques visualisés par le signal EGFP-TDP-43z à l’aide de sélections à main levée, puis en cliquant sur Ajouter[t] dans le gestionnaire de retour sur investissement.
  6. Définissez un axe principal du soma en traçant une ligne droite à l’aide de Droite et en cliquant sur Analyser | Profil de tracé pour les images EGFP-TDP-43z (C1) et opTDP-43h (C2) à 48 et 72 chf.
  7. Normalisez le profil du tracé en divisant les valeurs par la valeur la plus élevée pour chaque signal EGFP-TDP-43z et opTDP-43h. Tracez les valeurs normalisées avec les coordonnées x-y, où x et y représentent l’axe principal des intensités fluorescentes soma et relatives, respectivement, à l’aide du graphique XY dans un logiciel statistique.

7. Comparaison ratiométrique entre les signaux opTDP-43h et EGFP-TDP-43z à l’aide d’ImageJ/Fiji

  1. Ouvrez le fichier image dans ImageJ/Fiji et définissez les retours sur investissement des cellules mnr2b positives uniques à l’aide d’une image de projection d’intensité maximale de EGFP-TDP-43z comme dans 6.1-6.5. Ajoutez un retour sur investissement à l’extérieur de la moelle épinière ventrale (par exemple, notochord) pour représenter le signal de fond (retour sur investissement d’arrière-plan).
  2. Pour chaque image EGFP-TDP-43z et opTDP-43, créez une projection de plusieurs tranches en cliquant sur Image | Piles | | de projet Z Additionnez les tranches et définissez la tranche Démarrer et la tranche Stop qui couvrent la colonne du moteur hémispinal.
  3. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement créé avec l’image de projection d’intensité maximale. Affichez les retours sur investissement sur l’image Sum Slices en sélectionnant la fenêtre d’image pour EGFP-TDP-43z, puis en cliquant sur Afficher tout dans le gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Mesurer dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir des valeurs moyennes pour chaque retour sur investissement.
  4. Acquérir des valeurs moyennes pour opTDP-43h en suivant la même procédure que celle prévue à la section 7.3.
  5. Pour chaque ROI, après avoir soustrait la moyenne du ROI de fond, divisez la moyenne soustraite pour opTDP-43h par la moyenne soustraite pour EGFP-TDP-43z pour obtenir la valeur ratiométrique. Les valeurs ratiométriques peuvent être comparées entre différents points temporels et présentées à l’aide du graphique en colonnes dans le logiciel Prism.

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Résultats

Imagerie en direct des protéines TDP-43 optogénétiques et non optogénétiques dans les motoneurones rachidiens mnr2b+ des larves de poisson zèbre
Pour induire la transition de phase TDP-43 dans les motoneurones spinaux chez le poisson-zèbre, un TDP-43h humain marqué avec mRFP1 et CRY2olig22 aux N- et C-termini, respectivement, a été construit et désigné comme opTDP-43h14 (Figure 1A)...

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Discussion

L’expression médiée par mnr2b-BAC de l’opTDP-43h et de l’EGFP-TDP-43z chez le poisson-zèbre offre une occasion unique d’imagerie en direct de la transition de phase TDP-43 dans les motoneurones spinaux. La transparence optique des tissus corporels des larves de poisson zèbre permet la stimulation optogénétique simple et non invasive de l’opTDP-43h. Les comparaisons entre les motoneurones spinaux uniques au fil du temps ont démontré que l’oligomérisation dépendante de la lumière de l’opTDP-43h provoque son regrou...

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Déclarations de divulgation

KA et KK sont les inventeurs de la propriété intellectuelle décrite dans ce manuscrit et des brevets provisoires ont été déposés par l’Institut national de génétique.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numbers JP19K06933 (KA) et JP20H05345 (KA).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope confocalOlympusFV1200
Microscope à épifluorescenceZEISSAxioimager Z1
Stéréomicroscope à fluorescenceLeicaMZ16FA
Plat à base en verreIWAKI3910-035
IncubateurMEECN-25C
Panneau LEDNanoleaf LimitedNanoleaf AURORA smarter kit
Mupid-2plusTAKARAAD110
NucleoBond BAC100MACHEREY-NAGEL740579
NuSieve GTG AgaroseLONZA50181
ObjectifOlympusXLUMPlanFL N 20× ;/1.00
ObjectifZEISSPlan-Neofluar 5x/0.15
Capteur de puissance optiqueHIOKI3664
Capteur optiqueHIOKI9742-10
Solution de rouge de phénol 0,5MerckP0290-100ML
PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseTAKARAR050A
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704
Plat à six puitsFALCON353046
Sonde spectromètre BLUE-WaveStellerNet Inc.VIS-50
Aiguille de seringueTERUMONN-2725R
TaKaRa Ex TaqTAKARARR001A
TricaneSigma-AldrichA5040
Zebrafish BAC clone CH211-172N16BACPAC GenomicsCH211-172N16
 %

Références

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Transition de phase de TDP 43TDP 43 optog n tiqueagr gation prot iquetransgen se BACmicroscopie confocalestimulation par lumi re bleueagr gation cytoplasmiquescl rose lat rale amyotrophique
Transition de phase optogénétique du TDP-43 dans les motoneurones spinaux des larves de poisson zèbre
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