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Article de méthode

Un modèle simplifié pour la transplantation valvulaire cardiaque hétérotopique chez les rongeurs

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DOI :

10.3791/62948

⸱

21 septembre 2021

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1Department of Surgery, Medical University of South Carolina

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode simple et efficace pour la transplantation de feuillets valvulaires aortiques sous la capsule rénale afin de permettre l’étude de l’alloréactivité des valves cardiaques.

Résumé

Il existe un besoin clinique urgent de remplacements valvulaires cardiaques qui peuvent se développer chez les enfants. La transplantation valvulaire cardiaque est proposée comme un nouveau type de greffe avec le potentiel de fournir des valves cardiaques durables capables de croissance somatique sans avoir besoin d’anticoagulation. Cependant, l’immunobiologie des greffes de valve cardiaque reste inexplorée, soulignant la nécessité pour des modèles animaux d’étudier ce nouveau type de greffe. Des modèles antérieurs chez le rat pour la transplantation de valve aortique hétérotopique dans l’aorte abdominale ont été décrits, bien qu’ils soient techniquement difficiles et coûteux. Pour relever ce défi, un modèle de greffe sous-capsulaire rénale a été développé chez les rongeurs comme une méthode pratique et plus simple pour étudier l’immunobiologie de la transplantation valvulaire cardiaque. Dans ce modèle, une seule feuillet valvulaire aortique est récoltée et insérée dans l’espace sous-capsulaire rénal. Le rein est facilement accessible et le tissu transplanté est solidement contenu dans un espace sous-capsulaire bien vascularisé et pouvant accueillir une variété de tailles de tissus. De plus, comme un seul rat peut fournir trois folioles aortiques de donneur et qu’un seul rein peut fournir plusieurs sites pour les tissus transplantés, moins de rats sont nécessaires pour une étude donnée. Ici, la technique de transplantation est décrite, offrant une étape importante dans l’étude de l’immunologie de la transplantation de valve cardiaque.

Introduction

Les malformations cardiaques congénitales sont l’incapacité congénitale la plus courante chez l’homme, touchant 7 enfants nés sur 1 000 chaque année1. Contrairement aux patients adultes chez lesquels diverses valves mécaniques et bioprothétiques sont systématiquement implantées, les patients pédiatriques n’ont actuellement pas de bonnes options pour le remplacement de la valve. Ces implants conventionnels n’ont pas le potentiel de grandir chez les enfants receveurs. En conséquence, des réopérations morbides sont nécessaires pour échanger les implants valvulaires cardiaques contre des versions successivement plus grandes à mesure que les enfants grandissent, les enfants affectés nécessitant souvent jusqu’à cinq chirurgies à cœur ouvert ou plus au cours de leur vie 2,3. Des études ont montré que l’absence d’intervention ou de décès est significativement plus faible pour les nourrissons que pour les enfants plus âgés, avec 60% des nourrissons avec des valves cardiaques prothétiques faisant face à une nouvelle opération ou à la mort dans les 3 ans suivant leur opération initiale4. Par conséquent, il est urgent de délivrer une valve cardiaque capable de se développer et de maintenir sa fonction chez les patients pédiatriques.

Pendant des décennies, les tentatives de remplacement des valves cardiaques en croissance ont été centrées sur l’ingénierie tissulaire et les cellules souches. Cependant, les tentatives de traduction de ces valves à la clinique ont été infructueuses jusqu’à présent 5,6,7,8. Pour résoudre ce problème, une transplantation de valve cardiaque est proposée comme une opération plus créative pour fournir des remplacements valvulaires cardiaques en croissance ayant la capacité de s’auto-réparer et d’éviter la thrombogenèse. Au lieu de transplanter tout le cœur, seule la valve cardiaque est transplantée et grandira ensuite avec l’enfant receveur, semblable aux transplantations cardiaques conventionnelles ou à un autographe pulmonaire Ross 9,10,11. Après l’opération, les enfants receveurs recevront une immunosuppression jusqu’à ce que la valve transplantée puisse être échangée contre une prothèse mécanique de taille adulte lorsque la croissance de la valve n’est plus nécessaire. Cependant, la biologie de la transplantation des greffes de valve cardiaque reste inexplorée. Par conséquent, des modèles animaux sont nécessaires pour étudier ce nouveau type de greffe.

Plusieurs modèles de rats ont déjà été décrits pour la transplantation hétérotopique de la valve aortique dans l’aorte abdominale 12,13,14,15,16,17,18. Cependant, ces modèles sont extrêmement délicats, nécessitant souvent des chirurgiens formés pour opérer avec succès. De plus, ils sont coûteux et prennent beaucoup de temps19. Un nouveau modèle de rat a été développé pour créer un modèle animal plus simple pour étudier l’immunobiologie des greffes de valve cardiaque. Des feuillets valvulaires aortiques simples sont excisés et insérés dans l’espace sous-capsulaire rénal. Le rein est particulièrement adapté à l’étude du rejet de greffe car il est fortement vascularisé avec un accès aux cellules immunitaires circulantes20,21. Alors que plusieurs autres ont utilisé un modèle sous-capsulaire rénal pour étudier la biologie de la transplantation d’autres greffes telles que le pancréas, le foie, les reins et la cornée 22,23,24,25,26,27, il s’agit de la première description de la transplantation de tissu cardiaque dans cette position. Ici, la technique de transplantation est décrite, offrant une étape importante dans l’étude de l’immunologie de la transplantation de valve cardiaque.

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Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité de recherche animale à la suite du Guide des nationals de santé pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Informations sur le modèle animal (rats)

  1. Utilisez un microscope opératoire (voir tableau des matériaux) avec un grossissement jusqu’à 20x pour toutes les interventions chirurgicales.
  2. Utilisez des souches syngéniques (telles que Lewis-Lewis) ou allogéniques (telles que Lewis-Brown Norway) pour les greffes au besoin de l’expérience.
  3. Utilisez des rats âgés de 5 à 7 semaines et d’un poids corporel de 100 à 200 g appropriés pour la question expérimentale.

2. Enlèvement de la fourrure, préparation de la peau et anesthésie

  1. Effectuer toutes les opérations dans des conditions stériles.
    REMARQUE: L’étape est effectuée dans un espace chirurgical dédié et dans des conditions stériles.
  2. Placez les rats dans une chambre d’induction anesthésique et induisez une anesthésie avec 5% d’isoflurane dans l’oxygène. Maintenir l’anesthésie avec 3,5% d’isoflurane dans l’oxygène tout au long de la procédure.
  3. Pour l’opération du donneur, retirez la fourrure du rat de l’ombilic à l’encoche sternale à l’aide de tondeuses à fourrure. Pour l’opération receveuse, clipser les cheveux sur le champ chirurgical à la ligne axillaire postérieure des côtes au bassin. Ensuite, préparez la peau avec un désinfectant chirurgical.
  4. Obtenir un plan chirurgical d’anesthésie avant de commencer la procédure. Confirmez une profondeur d’anesthésie adéquate en comprimant fermement les orteils du rat avec une pince. Si le rat se retire à cause de la douleur, titrez l’anesthésique au besoin.
  5. Surveiller cliniquement la fréquence respiratoire et la profondeur de l’anesthésie tout au long de la procédure; le niveau d’isoflurane est ajusté au besoin pour maintenir un rythme respiratoire de 55 à 65 respirations / min.

3. Opération du donateur

  1. Préparez et anesthésiquez le rat comme indiqué à l’étape 2. Inciser la peau du xiphoïde à l’encoche sternale à l’aide de ciseaux disséquants. Effectuez une sternectomie en coupant les côtes de chaque côté latéral au sternum jusqu’à ce qu’un accès optimal au cœur soit obtenu.
  2. Hépariniser le rat avec une injection de 100 U/100 g dans l’oreillette gauche.
  3. Sacrifiez le donneur par exsanguination.
  4. Excisez le thymus pour améliorer la visualisation des grands vaisseaux. Ensuite, retirez le cœur en bloc avec l’aorte ascendante jusqu’au niveau de l’artère nominale.

4. Préparation des feuillets de la valve aortique

  1. Placez le cœur du donneur dans une boîte de Petri stérile immédiatement après la cardiectomie. Disséquez le cœur du donneur dans un tampon d’entreposage frigorifique glacé (voir tableau des matériaux).
  2. À l’aide de pinces et de ciseaux à ressort Vannas, disséquez le cœur du donneur jusqu’à ce qu’il ne reste que la racine aortique avec un brassard ventriculaire de 1 mm proximal à la valve aortique.
  3. Ouvrez la valve aortique en faisant une coupe longitudinale pour ouvrir le sinus de Valsalva entre les sinus gauche et non coronaire pour visualiser les trois folioles.
    REMARQUE: La coupe doit être sur toute la longueur du sinus de Valsalva. Les dimensions réelles dépendent de la taille du rat.
  4. Exciser chaque notice de valve aortique individuellement. Plus précisément, utilisez une pince émoussée pour saisir le bord de la feuillet et utilisez des ciseaux à ressort Vannas pour exciser la feuillette en coupant d’une commissure jusqu’à l’anneau, puis vers la commissure suivante.
    REMARQUE: Prenez des précautions particulières pour ne saisir que le bord de la foliole afin de minimiser la perturbation des cellules endothéliales valvulaires.
  5. Conservez les échantillons après l’excision de la notice dans une solution tampon de stockage glacé jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être implantés chez le rat receveur. Implantez toutes les notices dans les 4 h suivant le stockage frigorifique.

5. Opération du destinataire

  1. Préparez et anesthésiquez le rat comme indiqué à l’étape 2. Utilisez un coussin chauffant maintenu à 36-38 °C pour effectuer la chirurgie.
  2. Administrer la buprénorphine (0,03 mg/kg par voie sous-cutanée) à tous les rats receveurs avant la chirurgie et toutes les 6 à 12 heures après l’opération, au besoin, pour soulager la douleur.
  3. Placez le rat dans une position couchée latérale droite pour accéder au rein gauche.
    REMARQUE: Le rein gauche est préféré en raison de sa position plus caudale par rapport au rein droit.
  4. Inciser la peau sur le flanc longitudinalement sur 1 pouce à l’aide de ciseaux.
    REMARQUE: L’incision doit rester plus petite que la taille du rein pour fournir suffisamment de tension pour empêcher le rein de se rétracter dans la cavité abdominale pendant la procédure.
  5. De même, inciser la paroi abdominale sous-jacente.
  6. Extérioriser le rein
    1. À l’aide du pouce et de l’index, appliquez une légère pression dorsale et ventrale tout en utilisant une pince incurvée pour soulever le pôle caudal du rein à travers l’incision abdominale et cutanée. Extérioriser l’extrémité crânienne du rein de la même manière.
    2. Alternativement, le rein peut être extériorisé en saisissant la graisse périrénale et en tirant vers le haut avec une légère tension.
      REMARQUE: Veillez à ne pas saisir directement le rein ou les vaisseaux rénaux.
    3. Une fois le rein extériorisé, gardez-le humide avec une solution saline chaude ruisselée sur le rein.
  7. Créez une poche sous-capsulaire.
    1. Appliquez légèrement une pression sur la capsule rénale à l’aide d’un ensemble de pinces contondantes afin que la capsule rénale puisse être clairement distinguée du parenchyme sous-jacent. Simultanément, à l’aide d’un autre ensemble de pinces contondantes, saisissez soigneusement la capsule et tirez doucement vers le haut pour créer un trou dans la capsule.
      REMARQUE: En raison de la nature délicate de la capsule, une force minimale est nécessaire pour établir cette incision.
    2. Continuez à utiliser des pinces contondantes pour prolonger l’incision jusqu’à ce qu’un espace d’environ 2 mm ait été créé pour accueillir le feuillet de la valve aortique.
    3. Développez une poche sous-capsulaire peu profonde légèrement plus grande que le feuillet valvulaire tout en soulevant le bord de l’incision avec un ensemble de pinces et en avançant une sonde contondante sous la capsule rénale.
  8. Transplantez la valve aortique dans la poche sous-capsulaire.
    1. Récupérez la notice aortique de l’entrepôt frigorifique et placez-la dans le champ chirurgical.
    2. Tout en soulevant la capsule fibreuse de bord, avancez la foliole aortique dans la poche sous-capsulaire avec une pince émoussée.
      REMARQUE: Assurez-vous que le tissu est suffisamment éloigné de l’incision pour qu’il soit fermement fixé sous la capsule. Des précautions doivent être prises pour éviter d’endommager le parenchyme sous-jacent ou de déchirer davantage la capsule fibreuse.
    3. L’incision dans la capsule rénale peut être laissée ouverte.
  9. Repoussez doucement le rein à sa position anatomique en utilisant une contre-traction appliquée sur les bords de l’incision.
  10. Fermez l’incision abdominale avec une suture chirurgicale stérile courante. Fermez la peau avec des agrafes.
  11. Soins postopératoires
    1. Après l’opération, placez le rat dans une cage propre sur un coussin chauffant avec accès à la nourriture et à l’eau.
    2. Surveillez l’animal quotidiennement pour évaluer la cicatrisation de routine des plaies et les signes de douleur ou de détresse. Retirez les agrafes après 7-10 jours.

6. Prélèvement de tissus à des fins d’analyse

  1. Aux critères d’évaluation sélectionnés après la transplantation, euthanasier l’animal par exsanguination. Plus précisément, effectuez une laparotomie médiane et transectez l’aorte abdominale sous 5% d’isoflurane en oxygène.
  2. Mobilisez le rein et excisez-le en coupant l’artère rénale, la veine et l’uretère avec des ciseaux.
    REMARQUE: Veillez à ne pas saisir la zone contenant la feuillet transplantée.
  3. Placez le rein dans le formol pendant la nuit, incorporez-le dans de la paraffine et coupez-le pour la coloration souhaitée. Orienter l’échantillon avec la capsule rénale orientée vers l’avant et le parenchyme rénal vers l’arrière.

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Résultats

Une représentation graphique de la conception expérimentale est fournie pour le modèle de rat (Figure 1). De plus, une racine aortique disséquée du cœur du donneur et une feuillet valvulaire aortique individuelle préparée pour l’implantation sont également montrées à la figure 2. Ensuite, une image représentative de la position de la feuillet valvulaire aortique sous la capsule rénale pour l’implantation est montrée à la figure 3A e...

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Discussion

Importance et applications potentielles
Alors que les valves cardiaques mécaniques et bioprothétiques sont couramment utilisées chez les patients adultes nécessitant un remplacement valvulaire, ces valves n’ont pas le potentiel de croissance et, par conséquent, sont sous-optimales pour les patients pédiatriques. La transplantation valvulaire cardiaque est une opération expérimentale conçue pour fournir des remplacements valvulaires cardiaques en croissance aux nouveau-nés et aux nourrissons atteints d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

La figure 1 a été créée avec biorender.com. Ce travail a été soutenu en partie par le programme de recherche chirurgicale de la Fondation AATS à TKR, le Fonds d’excellence pour les enfants détenu par le Département de pédiatrie de l’Université médicale de Caroline du Sud à TKR, une subvention de la Fondation Emerson Rose Heart à TKR, la philanthropie du sénateur Paul Campbell à TKR, les subventions de formation postdoctorale institutionnelle NIH-NHLBI (T32 HL-007260) à JHK et BG, et le Medical University of South Carolina College of Medicine Pre-clerkship FLEX Research Fund to MAH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chlordie de sodium à 0,9 %, USPBaxterNDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactine 910EthiconJ415H
7,5 % de povidone et d’iodeCareFusion29904-004
70 % ETOHFisher ScientificBP82031GAL
Chambre d’induction d’anesthésieHarvard Apparatus75-2030Chambre d’induction étanche à l’air pour rats
Appareil d’anesthésieHarvard Apparatus75-0238Système d’anesthésie mobile avec
masque d’anesthésieAppareil Harvard59-8255Masque d’anesthésie pour rats
bruns Norway Rats (BN/Crl)Charles RiverCode de souche 091Mâle, 5-7 semaines, 100-200 g
Chlorhydrate de buprénorphine, 0,3 mg/mLPAR PharmaceuticalNDC 42023-179-050,03 mg/kg, administré par voie sous-cutanée
Tondeuse à cheveux électriqueWAHL79434
Coussin chauffant électriqueHarvard Apparatus72-0492Maintenu à 36-38 ° ; C
HeparinSagent PharmaceuticalsNDC 25021-400-10100U/100g injection dans l’oreillette gauche
Seringue à insuline, 1 mLFisher Scientific14-841-33
Pince à iris courbéeWorld Precision Instruments15917
Pince à iris droiteWorld Precision Instruments15916
Isoflurane, USPPiramal Soins intensifsNDC 66794-017-25Induit à 5 % d’isoflurance dans l’oxygène et maintenu avec 3,5 % d’isoflurane dans l’oxygène
Rats Lewis (LEW/ Crl)Charles RiverStrain Code 004Mâle, 5-7 semaines, 100-200 g
Micro-pinceWorld Precision Instruments500233Dumont #5
Micro-ciseauxWorld Precision Instruments501930Ciseaux
Needle DriverWorld Precision Instruments500226Ryder Needle
Driver Microscope opératoireAmScopeSM-3BZ-80SStéréomicroscope 3,5x - 90x Boîte
Pétri FisherScientificFB0875714
Petrolatum pommade ophtalmiqueDechraNDC 17033-211-38
Agrafes cutanéesEthiconPXR35Proximate 35
Cotons-tiges stérilesPuritan25-806 1WC
Éponges de gaze stérilesFisher Scientific22-037-902
Ciseaux chirurgicauxWorld Precision Instruments1962CMetzenbaum Ciseaux
Université du Wisconsin Tampon (Servator B)S.A.L.F S.p.A.6484A1Stocké à 4 ° ; L
passive Vannas à ressort de

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