Modèle de saignement par transsection veineuse de la queue chez des souris hémophiliques A entièrement anesthésiées

Résumé

Le modèle de saignement par transsection de la veine caudale raffinée (TVT) chez les souris anesthésiées est une méthode in vivo sensible pour l’évaluation des saignements hémophiles. Ce modèle de saignement TVT optimisé utilise la perte de sang et le temps de saignement comme critères d’évaluation, affinant d’autres modèles et évitant la mort comme critère d’évaluation.

Résumé

Les modèles de saignement de la queue sont des outils importants dans la recherche sur l’hémophilie, en particulier pour l’évaluation des effets du procoagulant. Le modèle de survie par transsection de la veine caudale (TVT) a été préféré dans de nombreux contextes en raison de la sensibilité aux doses cliniquement pertinentes de FVIII, tandis que d’autres modèles établis, tels que le modèle du clip de la queue, nécessitent des niveaux plus élevés de composés procoagulants. Pour éviter d’utiliser la survie comme critère d’évaluation, nous avons développé un modèle TVT établissant la perte de sang et le temps de saignement comme critères d’évaluation et d’anesthésie complète pendant toute l’expérience. En bref, les souris anesthésiées sont positionnées avec la queue immergée dans une solution saline tempérée (37 ° C) et dosées avec le composé d’essai dans la veine latérale droite de la queue. Après 5 min, la veine latérale gauche de la queue est transectée à l’aide d’un guide modèle, la queue est retournée à la solution saline et tous les épisodes de saignement sont surveillés et enregistrés pendant 40 minutes tout en recueillant le sang. Si aucun saignement ne se produit à 10 min, 20 min ou 30 min après la blessure, le caillot est remis en question doucement en essuyant la coupe deux fois avec un tampon de gaze humide. Après 40 minutes, la perte de sang est quantifiée par la quantité d’hémoglobine saignée dans la solution saline. Cette procédure rapide et relativement simple se traduit par des saignements cohérents et reproductibles. Par rapport au modèle de survie TVT, il utilise une procédure plus humaine sans compromettre la sensibilité à l’intervention pharmacologique. En outre, il est possible d’utiliser les deux sexes, réduisant ainsi le nombre total d’animaux à élever, conformément aux principes des 3R. Une limitation potentielle dans les modèles de saignement est la nature stochastique de l’hémostase, qui peut réduire la reproductibilité du modèle. Pour contrer cela, la perturbation manuelle du caillot garantit que le caillot est remis en question pendant la surveillance, empêchant l’hémostase primaire (plaquette) d’arrêter le saignement. Cet ajout au catalogue de modèles de lésions hémorragiques offre une option pour caractériser les effets du procoagulant de manière standardisée et humaine.

Introduction

Les modèles animaux sont essentiels pour comprendre la pathogenèse de l’hémophilie et pour développer et tester des schémas thérapeutiques et des thérapies. La souris knock-out de facteur VIII (F8-KO) est un modèle largement utilisé pour l’étude de l’hémophilie A ^1,2. Ces souris récapitulent les principales caractéristiques de la maladie et ont été largement utilisées pour le développement de traitements, tels que les produits recombinants FVIII ^3,4,5 et les stratégies de thérapie génique ^6,7

Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été approuvées par l’organisme de bien-être animal de Novo Nordisk A/S et l’Inspection danoise de l’expérimentation animale, ministère danois de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche. La méthode optimisée de 40 minutes inclut l’anesthésie et le temps de dosage dans la conception (Figure 1). Des souris hémophiles des deux sexes âgées de 10 à 16 semaines sont nécessaires pour cette procédure.

1. Préparatifs avant l’étude

1. Préparer les solutions posologiques aux concentrations correctes.
2. Démarrez le bain-marie et chauffez à 37 °C. R....

Résultats

Pour évaluer l’applicabilité du modèle optimisé, une étude a été réalisée chez des souris F8-KO (C57BL genetic background) administrées avec une thérapie de remplacement du facteur VIII recombinant disponible dans le commerce (rFVIII); quatre doses différentes ont été testées : 1 UI/kg, 5 UI/kg, 10 UI/kg et 20 UI/kg. De plus, nous avons testé le témoin correspondant du véhicule (négatif) chez des souris F8-KO et un groupe de type sauvage (WT) en utilisant des souris C57BL comme groupe témoin positif pour évaluer la plage.......

Discussion

Cette méthode optimisée de transsection de la veine caudale (TVT) présente plusieurs avantages par rapport à la méthode de survie TVT. Les animaux sont entièrement anesthésiés pendant toute la durée de l’étude, ce qui facilite la manipulation des souris et augmente le bien-être des animaux. De plus, contrairement au modèle de survie TVT, l’observation de nuit n’est pas nécessaire, et ce modèle optimisé offre la possibilité de mesurer la perte de sang et d’observer le temps de saignement exact sur 40 min. En outre, des pé.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#11 Lame de scalpel	Swann-Morton	503
15 mL tubes à centrifuger	Greiner Bio-One, Autriche	188271
aiguilles 30 G connectées à 300 µ ; L seringues de précision (insuline) pour le dosage BD	Micro-Fine + seringue à insuline U-100	320830
Advate	Takeda, Japon		Thérapie de remplacement du facteur VIII recombinant (rFVIII)
Tampons d’alcool 70 % éthanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifugeuse	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Gabarit de coupe (Acier inoxydable)	Autoproduit, vous êtes invités à contacter les auteurs pour les dessins exacts		Figure supplémentaire 2 : Spécifications de taille : 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Rainure : 3 mm de profondeur et 3 mm de largeur ; rayon 1,5 mm
Solution de lyse des érythrocytes (RBC)	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gaze
Analyseur hématologique	Sysmex	CT-2000iv
Lampe chauffante sur pied	Phillips	IR250
Coussin chauffant avec thermostat	CMA	modèle 150
Étalons et contrôles de l’hémoglobine - 8,81 mmol / l dépendant du lot	HemoCue, Danemark	Calibrateur HemoCue, 707037	Les étalons et les contrôles sont fabriqués à partir de 2 verres différents de calibrateur HemoCue. La valeur est déterminée par rapport à la méthode internationale de référence pour l’hémoglobine (ICSH).
Système d’anesthésie isofluorane complet avec tubes, masques et boîte à induction	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Loupe avec lumières	Eschenbach
Gabarit de mesure (aluminium)Autoproduit,	vous êtes invités à contacter les auteurs pour les dessins exacts		Figure supplémentaire 1 : Spécifications de taille : 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Rainure : 2,5 mm de profondeur et 2,5 mm de largeur ; rayon 1,25 mm
Micropipettes + pointes	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	Photomètre
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0,9 % NaCl	Fresenius Kabi, Suède	883264
Bloc de repère de queue spécial pour la coupe de		queue TVT
Support de queue
Aspiration de liquide sous vide	Vacusafe comfort, IBS
Bain-marie et thermostat	TYP 3/8 Julabo