Amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter et caractériser des auto-associations de protéines intrinsèquement désordonnées

Résumé

Un protocole pour l’application de la spectroscopie RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter les interactions inter- et intramoléculaires faibles et transitoires dans les protéines intrinsèquement désordonnées est présenté.

Résumé

Les protéines intrinsèquement désordonnées et les régions intrinsèquement désordonnées dans les protéines constituent une partie importante et fonctionnellement significative du protéome humain. La nature très flexible de ces séquences leur permet de former des interactions faibles, à longue portée et transitoires avec divers partenaires biomoléculaires. Des interactions spécifiques mais de faible affinité favorisent la liaison de promiscuité et permettent à un seul segment intrinsèquement désordonné d’interagir avec une multitude de sites cibles. En raison de la nature transitoire de ces interactions, elles peuvent être difficiles à caractériser par des méthodes de biologie structurale qui reposent sur des protéines pour former une seule conformation prédominante. La RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique est un outil utile pour identifier et définir le fondement structurel des interactions faibles et transitoires. Un protocole détaillé pour l’utilisation de l’amélioration de la relaxation paramagnétique pour caractériser les complexes de rencontre faiblement peuplés qui se forment entre les protéines intrinsèquement désordonnées et leurs protéines, acides nucléiques ou autres partenaires biomoléculaires est décrit.

Introduction

Le trouble intrinsèque (DI) décrit des protéines (IDP) ou des régions à l’intérieur des protéines (IDR) qui ne se replient pas spontanément en structures secondaires ou tertiaires stables, mais qui sont biologiquement actives. Généralement, la fonction des IDP/IDR est de faciliter des interactions spécifiques mais réversibles avec des biomolécules dans des conditions physiologiques¹. Ainsi, les IDP et les IDR sont impliqués dans une gamme de fonctions cellulaires, y compris le recrutement, l’organisation et la stabilisation de complexes multiprotéiques, par exemple, l’assemblage et l’activité du splicéosome², le recrutem....

Protocole

Exigences générales pour le protocole: installations de purification des protéines, spectromètre UV-Vis, spectromètre RMN à haut champ et logiciel d’exploitation, logiciel d’analyse post-traitement, y compris; NMRPipe³², Sparky 33, (ou CCPN Analysis 34, ou NMRViewJ³⁵).

1. Expression recombinante et purification d’une protéine pour les mesures PRE

1. Concevoir une construction d’expression pour la protéine d’intérêt afin qu’il y ait un seul résidu de cystéine présent. De multiples mutations seront nécessaires pour introduire une cystéine li....

Résultats

Des PRE intramoléculaires ¹H _{N-Γ 2} ont été enregistrées sur un fragment auto-associatif, intrinsèquement désordonné (résidus 171-264) dérivé du domaine de faible complexité de la protéine de liaison à l’ARN EWSR1⁴² (Figure 3). Les résidus à proximité séquentielle étroite du point de fixation de l’étiquette de spin (p. ex. résidus 178 ou 260 à la figure 3) devraient être considérablement élargis et.......

Discussion

Une méthode pour caractériser les interactions transitoires qui existent à de faibles populations entre des protéines intrinsèquement désordonnées et divers partenaires de liaison utilisant PRE a été présentée. Dans l’exemple montré, la protéine s’auto-associa, et donc le PRE peut provenir d’une combinaison d’interactions inter et intramoléculaires. Cette méthode est facilement étendue à des échantillons hétérogènes où les interactions entre deux protéines différentes peuvent être caractérisées. Des informations compléme.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,45 et micro ; m et 0,22 & micro ; Filtres à seringue	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	Filtrer le lysat avant la première étape de purification et avant la chromatographie d’exclusion stérique.
Boîte de Pétri de 100 mm	Fisher	FB0875713	plaques de gélose pour la transformation bactérienne.
14N Chlorure d’ammonium	Sigma Aldrich	576794	L’utilisation de 15N dans le milieu M9 produira une protéine visible RMN 14N produira une protéine invisible RMN
15N Chlorure d’ammonium	Sigma Aldrich	299251	L’utilisation de 15N dans le milieu M9 produira une protéine visible par RMN 14N produira une protéine invisible RMN
L Fiole à chicanes Fernbach	Corning	431523	Culture d’expression bactérienne
3-Maleimido-Proxyl	Sigma Aldrich	253375	Nitroxide spin label
50 mL Tubes à centrifuger coniques	Thermo Fisher	14-432-22	Solution/protéine stockage
Filtre centrifuge Amicon	Millipore Sigma	UFC900308	Concentration en protéines
Ampicillan	Sigma Aldrich	A5354	Antibiotique pour un marqueur sélectif, le choix exact dépend de la construction d’expression plasmide
Balance analytique	Oahus	30061978	Explorer Pro, pour peser les réactifs
Acide ascorbique	Sigma Aldrich	AX1775	Réduit l’étiquette de spin de prostituure de nitrote
Autoclave			Stériliser la verrerie et les milieux de culture
Chlorure	de calcium Sigma Aldrich	C4901	Composant du milieu M9
Bouteilles à centrifuger Thermo	Fisher	010-1459	Récolter les cellules d’E. coli après expression de protéines recombinantes
Centrifugeuse, manivelle	Thomas Scientific	0241C68	Centrifugeuse manuelle à basse vitesse Boekel avec seaux de 15 mL pouvant accueillir des tubes RMN
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	Éliminer les composés paramagnétiques contaminants des solutions tampons
Poste de travail			Linux ou Mac OS compatible avec les progiciels de traitement et d’analyse de données RMN tels que NMRPipe et Sparky
Oxyde de deutérium	Sigma Aldrich	151882	Nécessaire pour le signal de verrouillage RMN
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	M9 Composant de média
Phosphate de sodium dibasique	Sigma Aldrich	S5136	Composant de média M9
Réactif d’Ellman (acide 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoïque)	Thermo Fisher	22582	Quantification des résidus de cystiene libre
Tubes à centrifuger à grande vitesse Thermo	Fisher	3114-0050	Utilisé pour éliminer le lysat bactérien.
Instrument RMN à haut champ (600 - 800 MHz)	Bruker		Equipé d’une sonde cryogénique multicanaux et d’une colonne IMAC de contrôle de température
, HisTrap FF	Cytvia	17528601	Fractionnement initial d’un lysat bactérien brut
Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758	Induit l’expression protéique pour les gènes sous contrôle de l’opérateur
lac LB	agar Thermo Fisher	22700025	Les articles sont utilisés pour transformer E. coli afin d’exprimer des protéines d’intérêt, il est acceptable de remplacer l’un de ces articles par des produits similaires.
Bouillon LB	Thermo Fisher	12780052
Système de chromatographie à basse pression	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic est utilisé pour les chomatographes à basse pression tels que l’exécution de colonnes IMAC
Sulfate	de magnésium Sigma Aldrich	M7506	M9 Composant de média
Système de chromatographie à moyenne pression	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC est équipé d’un détecteur multi-longueurs d’onde, de moniteurs de pH et de conductivité, et d’un collecteur automatique de fractions
Solution vitaminique MEM	Sigma Aldrich	M6895	M9 Composant de milieu
Microfluidiseur	Avestin	EmulsiFlex-C3	Fournit une lyse cellulaire bactérienne rapide et efficace
Micropipettes	Thermo Fisher		Ensemble calibré de micropippetters avec embouts jetables correctement ajustés (disponible auprès de plusieurs fabricants, par exemple Eppendorf)
Phosphate de potassium monobasique	Sigma Aldrich	1551139	M9
Pipettes RMN	Sigma Aldrich	255688	Pour retirer l’échantillon du tube RMN Tube d’échantillonnage
RMN	NewEra	NE-SL5	Convient aux spectromètres
RMN à haut champCentrifugeuse préparative	Beckman Coulter	Avanti J-HC	Récolte des cellules d’E. coli après expression de protéines recombinantes
Tubes à centrifuger en polystyrène à fond rond	Corning	352057	Lysat bactérien transparent Incubateur
à secousses	Eppendorf	S44I200005	Croissance à température contrôlée de cultures de démarrage et d’expression d’E. coli
Chlorure de sodium	Sigma Aldrich	S5886	Composant du milieu M9
Bain d’eau sonique et source de vide	Thomas Scientific		Utilisé pour dégazer les solutions tampons
Sonicator	Thermo Fisher	FB505110	Utilisé pour la lyse cellulaire bactérienne ou le cisaillement de l’ADN bactérien
Spectrophotomètre	Diluphotomètre Implen	OD600 Surveiller	la croissance des cultures d’expression de protéines E.coli
Superdex 200 Exculsion de taille 16/600 Colum	Cytvia	28989333	Étape finale de purification des protéines
Logiciel Topspin, version 3.2 ou ultérieure	Bruker		Logiciel d’exploitation pour l’instrument RMN
Cellules E. coli compétentes pour la transformation	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) E. coli chimiquement compétent, d’autres souches peuvent être compatibles
Tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)	ThermoFisher	20490	Agent réducteur compatible avec certaines conjugaisons sulfhydryl-réactives
Spectrophotomètre UV-Vis	Implen	NP80	Mesure de la concentration en protéines.
Bain-marie, température contrôlée	ThermoFisher	FSGPD25	Pour l’étape de choc thermique de la transformation bactérienne
Extrait de levure	Sigma Aldrich	Y1625	Pour compléter le milieu M9 si nécessaire

3 informatique à composant de milieu