Boîte à outils open-source: réseau de microélectrodes en fibre de carbone de paillasse pour l’enregistrement des nerfs

Une grande partie de la recherche en neurosciences repose sur l’enregistrement de signaux neuronaux à l’aide de l’électrophysiologie (ePhys). Ces signaux neuronaux sont cruciaux pour comprendre les fonctions des réseaux neuronaux et de nouveaux traitements médicaux tels que les interfaces ^{cerveau-machine} et nerf périphérique1,2,3,4,5,6. La recherche sur les nerfs périphériques nécessite des électrodes d’enregistrement neuronales sur mesure ou disponibles dans le commerce. Les électrodes d’enregistrement neuronal - des outils uniques avec des dimensions à l’échelle du micron et des matériaux fragiles - nécessitent un ensemble spécialisé de compétences et d’équipements pour être fabriquées. Une variété de sondes spécialisées ont été développées pour des utilisations finales spécifiques; cependant, cela implique que les expériences doivent être conçues autour de sondes commerciales actuellement disponibles, ou qu’un laboratoire doit investir dans le développement d’une sonde spécialisée, ce qui est un processus long. En raison de la grande variété de recherches neuronales dans le nerf périphérique, il existe une forte demande pour une sonde ePhys ^{polyvalente4,7,8}. Une sonde ePhys idéale comporterait un petit site d’enregistrement, une faible impédance9 et un prix financièrement réaliste pour la mise en œuvre dans un ^système3.

Les électrodes commerciales actuelles ont tendance à être soit des électrodes extraneurales ou à manchette (Neural ^Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff ^Electrode11), qui se trouvent à l’extérieur du nerf, ou intrafasciculaires, qui pénètrent dans le nerf et se trouvent dans le fascicule d’intérêt. Cependant, comme les électrodes de brassard sont plus éloignées des fibres, elles captent plus de bruit des muscles voisins et d’autres fascicules qui peuvent ne pas être la cible. Ces sondes ont également tendance à resserrer le nerf, ce qui peut entraîner une encrassement biologique - une accumulation de cellules gliales et de tissu cicatriciel - à l’interface de l’électrode pendant que le tissu guérit. Les électrodes intrafasciculaires (telles que ^LIFE12, ^TIME13 et Utah Arrays14) ajoutent l’avantage de la sélectivité des fascicules et ont de bons rapports signal/bruit, ce qui est important pour discriminer les signaux pour l’interfaçage des machines. Cependant, ces sondes ont des problèmes de biocompatibilité, les nerfs se déformant au fil du temps3,15,16. Lorsqu’elles sont achetées commercialement, ces deux sondes ont des conceptions statiques sans option de personnalisation spécifique à l’expérience et sont coûteuses pour les nouveaux laboratoires.

En réponse aux problèmes de coût élevé et de biocompatibilité présentés par d’autres sondes, les électrodes en fibre de carbone peuvent offrir aux laboratoires de neurosciences un moyen de construire leurs propres sondes sans avoir besoin d’équipement spécialisé. Les fibres de carbone sont un matériau d’enregistrement alternatif avec un petit facteur de forme qui permet une insertion à faible dommage. Les fibres de carbone offrent une meilleure biocompatibilité et une réponse cicatricielle considérablement plus faible que le ^{silicium17,18,19} sans le traitement intensif en salle blanche5,13,14. Les fibres de carbone sont flexibles, durables, facilement intégrées à d’autres ^{biomatériaux19}, et peuvent pénétrer et enregistrer à partir du ^nerf7,20. Malgré les nombreux avantages des fibres de carbone, de nombreux laboratoires trouvent la fabrication manuelle de ces matrices difficile. Certains ^groupes21 combinent des fibres de carbone en faisceaux qui donnent collectivement un diamètre plus grand (~200 μm); cependant, à notre connaissance, ces faisceaux n’ont pas été vérifiés dans le nerf. D’autres ont fabriqué des réseaux d’électrodes en fibre de carbone individualisés, bien que leurs méthodes nécessitent des guides en fibre de carbone fabriqués en salle ^{blanche22,23,24} et des équipements pour peupler leurs réseaux17,23,24. Pour y remédier, nous proposons une méthode de fabrication d’un réseau de fibres de carbone qui peut être effectué sur la paillasse du laboratoire et qui permet des modifications impromptues. Le réseau résultant maintient des pointes d’électrodes individualisées sans outils spécialisés de remplissage de fibres. De plus, plusieurs géométries sont présentées pour répondre aux besoins de l’expérience de recherche. S’appuyant sur des travaux ^{antérieurs8,17,22,25}, ce document fournit des méthodologies détaillées pour créer et modifier manuellement plusieurs styles de tableaux avec un minimum de temps de formation en salle blanche.

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan.

1. Choisir un réseau de fibres de carbone

1. Choisissez une carte de circuit imprimé (PCB) parmi l’un des trois modèles illustrés à la figure 1.
   REMARQUE: Pour ce protocole, Flex Arrays sera au centre des préoccupations.
   1. Reportez-vous aux conceptions de PCB sur le site Web de Chestek Lab (https://chestekresearch.engin.umich.edu), gratuitement et prêtes à être envoyées et commandées pour impression via une imprimerie de PCB.
   2. Reportez-vous au tableau 1 pour obtenir un résumé des connecteurs de chaque carte et de leurs spécifications afin de vous aider à choisir le connecteur qui fonctionnera pour la configuration expérimentale spécifique.

2. Soudage du connecteur à la carte de circuit imprimé

1. Réglez un fer à souder à 315 °C (600 °F).
2. Appliquez un flux sur tous les tampons de soudure sur le PCB.
   REMARQUE: Le flux dans un tube peut être pressé à travers les tampons, tandis que le flux dans un pot peut être appliqué avec l’extrémité en bois d’un applicateur à pointe de coton en étalant généreusement le flux sur tous les tampons.
3. Formez de petits monticules de soudure sur les coussinets arrière du Flex Array (Figure 2A).
4. Soudez la rangée inférieure des broches du connecteur à la rangée arrière des plaquettes de soudure (Figure 2B).
   REMARQUE: Toutes les conceptions de cartes fournies par le laboratoire Chestek ont été conçues de manière à ce que les connecteurs s’associent précisément à leur carte désignée.
   1. Pour ce faire, soudez les broches de chaque côté du connecteur avec un accès facile aux monticules de soudure. Une fois fixé, poussez doucement la pointe du fer à souder entre les broches avant pour souder les connexions restantes à l’arrière.
      REMARQUE: Une fois que la rangée arrière de broches est sécurisée, le reste du connecteur s’alignera avec chaque broche au-dessus de son tampon de soudure attribué.
5. Soudez la rangée avant de broches à la planche en appliquant une petite quantité de soudure à chaque broche. Appliquez une couche de flux supplémentaire si la soudure ne se produit pas rapidement.
   1. Nettoyez l’excès de flux avec de l’alcool isopropylique à 100% (IPA) et une brosse à poils courts.
6. Encapsulez les connexions soudées dans de l’époxy retardé (Figure 2 C,D) à l’aide d’une aiguille de 23 G et d’une seringue de 1 mL placée côté biseauté vers le bas sur les broches. Poussez l’époxy à travers la seringue lentement afin qu’il s’écoule dans et le long des connexions.
   1. Laissez la planche pendant la nuit afin que l’époxy retardé puisse durcir.
      REMARQUE: Alors que l’insert du produit pour l’époxy retardé indique qu’il durcit en 30 minutes, le laisser pendant la nuit permet une connexion plus stable à se former.
7. Fixez l’arrière de la carte sur les côtés du connecteur en posant une petite ligne d’époxy retardé sur la face arrière de la carte et en la tirant sur les bords du connecteur.
   1. Laissez la planche durcir à nouveau pendant la nuit.
      Remarque : À ce stade, stockez les tableaux ou poursuivez la génération. En cas de pause dans la build, stockez les tableaux dans une boîte propre et sèche à température ambiante.

3. Population de fibres

1. Coupez un capillaire en verre tiré de manière à ce que son extrémité s’insère entre les traces du réseau (Figure 3A).
   1. À l’aide d’un extracteur de verre et d’un filament, fabriquez des capillaires en utilisant les réglages suivants: Chaleur = 900, Traction = 70, Vitesse = 35, Temps = 200, Pression = 900.
      REMARQUE: Les numéros sont sans unité et spécifiques à cet appareil (voir le tableau des matériaux).
2. Utilisez les extrémités en bois de deux applicateurs à pointe de coton (un pour chaque partie d’époxy argenté) pour prélever un petit rapport ~ 1: 1 d’époxy d’argent dans un plat en plastique et mélangez en utilisant les mêmes bâtons que ceux utilisés pour ramasser. Jetez les applicateurs après le mélange.
3. Coupez 2 à 4 mm de l’extrémité du faisceau de fibre de carbone sur un morceau de papier d’imprimante à l’aide d’une lame de rasoir. Pour séparer facilement les fibres du paquet, qui sont difficiles à séparer, tirez doucement un morceau de papier laminé sur le dessus du paquet.
   REMARQUE: Le morceau de papier laminé transfère statiquement dans les fibres, qui se sépareront d’elles-mêmes.
4. Appliquez de l’époxy argenté entre toutes les autres paires de traces sur un côté de la planche avec le capillaire en verre (Figure 3B).
   1. Prenez une petite goutte d’époxy sur l’extrémité d’un capillaire tiré. Appliquez doucement entre toutes les autres traces à l’extrémité de la planche, en comblant l’espace.
      REMARQUE: L’espace doit être comblé au sommet des deux traces sans déborder pour toucher les traces voisines. Chaque trace est connectée à un canal. Cette méthode de population époxy signifie que chaque fibre aura deux canaux connectés à elle. En effet, deux traces permettent un meilleur alignement des fibres et la redondance des canaux permet d’assurer la connexion électrique.
5. Utilisez une pince à épiler revêtue de téflon pour placer une fibre de carbone dans chaque trace époxy (Figure 3C).
6. Utilisez un capillaire tiré propre pour ajuster les fibres de carbone, de sorte qu’elles soient perpendiculaires à l’extrémité de la carte Flex Array et enfouies sous l’époxy (Figure 3D).
7. Placez les tableaux sur un bloc de bois avec des extrémités fibrées surplombant le bord du bloc.
   REMARQUE: Le poids du back-end gardera le tableau sur le bloc.
8. Cuire le bloc de bois et les matrices à 140 °C pendant 20 min pour durcir l’époxy argenté et verrouiller les fibres en place.
9. Répétez les étapes 3.4 à 3.8 pour l’autre côté de la carte.
   REMARQUE: Les matrices peuvent être stockées après n’importe quelle étape de cuisson; cependant, la statique des boîtes de stockage peut entraîner l’éloignement des fibres de la carte si trop peu d’époxy argenté a été appliqué lors du remplissage de la carte.
   1. Créez une plate-forme adhésive surélevée dans une boîte afin que la majeure partie de la carte puisse être collée à l’adhésif, ce qui permet aux extrémités fibreuses de la carte d’être suspendues dans la boîte pour éviter la rupture de la fibre. Conserver à température ambiante.
      REMARQUE: Si les fibres s’éloignent de la planche pendant le stockage, grattez l’époxy des traces avec un capillaire en verre tiré propre et répétez les étapes 3.1-3.8 pour remplacer les fibres. À partir de ce moment, les matrices doivent être stockées avec les fibres suspendues de cette manière pour éviter la rupture des fibres.

4. Appliquer de l’époxy ultraviolet (UV) pour isoler les fibres de carbone

1. Utilisez un capillaire propre et appliquez une petite gouttelette (~0,5 mm de diamètre d’époxy UV sur les traces exposées d’un côté de la planche (Figure 4A). Continuez à ajouter des gouttelettes d’époxy UV jusqu’à ce que les traces soient complètement couvertes.
   REMARQUE: Ne laissez pas l’époxy UV pénétrer sur les fibres de carbone au-delà de l’extrémité du PCB pour assurer une insertion en douceur plus tard.
2. Durcissez l’époxy UV sous une lumière de stylo UV pendant 2 min (Figure 4B).
3. Répétez les étapes 4.1 à 4.2 pour l’autre côté de la carte.
4. Coupez les fibres à 1 mm à l’aide d’un réticule stéréoscope et de ciseaux chirurgicaux.
   REMARQUE : Les tableaux peuvent être stockés à ce stade jusqu’à ce qu’ils soient prêts à passer aux étapes suivantes. Ils doivent être stockés dans une boîte qui éloignera les fibres de carbone de la boîte elle-même. Les matrices peuvent être stockées à température ambiante indéfiniment.

5. Vérification des connexions électriques avec des scans d’impédance de 1 kHz (Figure 5)

1. Immergez les fibres de carbone de 1 mm dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Pour compléter le circuit, utilisez un chlorure d’argent-argent (Ag| AgCl) électrode de référence et une tige en acier inoxydable (contre-électrode).
   1. À l’aide d’une pince à bécher, suspendez l’Ag| Électrode AgCl dans le PBS 1x et connectez-la à la référence du système d’impédance utilisé.
   2. À l’aide d’une pince à bécher, suspendez la tige en acier inoxydable dans le PBS 1x et connectez-la à l’entrée de contre-électrode du système d’impédance utilisé.
3. Exécutez un scan d’impédance de 1 kHz pour chaque fibre à l’aide d’un potentiostat réglé sur une fréquence de balayage de 1 kHz à 0,01 _Vrms dans une seule forme d’onde sinusoïdale. Réglez le potentiostat sur 0 V au début de chaque scan pendant 5 s pour stabiliser le signal enregistré. Enregistrez les mesures via le logiciel associé au potentiostat.
   REMARQUE: Les mesures peuvent être prises à n’importe quel point de la construction; cependant, ils ne sont nécessaires qu’avant l’isolation et pendant la préparation de la pointe. Le tableau 2 répertorie les plages typiques d’impédances après chaque étape de construction à 1 kHz pour la référence de l’utilisateur.
4. Rincez les fibres dans de l’eau désionisée (DI) en les trempant trois fois dans un petit bécher et laissez-les sécher à température ambiante.
   REMARQUE : Les baies peuvent être laissées dans le stockage jusqu’à ce que l’utilisateur puisse passer à l’étape suivante.

6. Isolation parylène C

REMARQUE: Le parylène C a été choisi comme matériau isolant pour les fibres de carbone car il peut être déposé à température ambiante sur des lots de matrices et fournit un revêtement hautement conforme.

1. Masquez le connecteur Flex Array à l’aide du connecteur d’accouplement.
2. Placez un lot de 8 à 12 matrices dans une boîte de stockage avec une plate-forme adhésive surélevée afin qu’elles puissent être isolées en une seule fois. Placez les matrices de manière à ce que l’extrémité du connecteur se trouve sur la plate-forme adhésive avec l’extrémité fibrée de la matrice en surplomb (Figure 6) pour empêcher les fibres de coller à l’adhésif et de se détacher et pour assurer un revêtement uniforme de parylène sur les fibres.
3. Enduire les matrices dans un système de dépôt de parylène C d’une épaisseur de 800 nm dans une salle blanche, en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié tel que défini par la salle blanche individuelle utilisée.
   REMARQUE: Ici, l’EPI a été défini comme des chaussures de salle blanche, un costume, un couvre-chef, des lunettes, un masque et des gants en latex. Il convient de noter qu’il s’agit d’un EPI standard pour entrer dans une salle blanche. Cette étape peut être sous-traitée à une entreprise de revêtement de parylène moyennant des frais; cependant, un service commercial peut être en mesure de recouvrir plus de baies à la fois. Chaque système de dépôt de parylène C peut avoir des précautions de sécurité différentes. Contactez le technicien avant utilisation pour assurer la sécurité de l’utilisateur.
4. Retirez le connecteur d’accouplement utilisé comme masque de la matrice Flex.
5. Placez les baies dans une nouvelle boîte pour le stockage jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.

7. Méthodes de préparation des pointes

REMARQUE: Deux préparations de pointe dans cette section utilisent des lasers pour couper les fibres. Les EPI appropriés, tels que des lunettes résistantes aux longueurs d’onde utilisées, doivent toujours être portés lors de l’utilisation du laser, et les autres utilisateurs de laboratoire à proximité du laser doivent également être dans l’EPI. Bien que les longueurs de fibres répertoriées dans ces étapes soient des longueurs recommandées, les utilisateurs peuvent essayer n’importe quelle longueur qui convient à leurs besoins. L’utilisateur doit choisir l’une des méthodes de préparation de la pointe suivantes, car la découpe aux ciseaux seule ne suffira pas à réexposer ^{l’électrode25}.

1. Grenat d’aluminium à l’yttrium dopé au néodyme (Nd:YAG) découpé au laser
   1. Coupez les fibres à 550 μm avec des ciseaux chirurgicaux.
   2. Utilisez un laser pulsé Nd:YAG de 532 nm (5 mJ/impulsion, durée de 5 ns, 900 mW) pour couper 50 μm de l’extrémité des fibres afin de réexposer le carbone sous le parylène C (prend généralement 2-3 impulsions).
      1. Alignez les pointes de fibre à l’aide du stéréoscope intégré fourni avec ce système laser.
         REMARQUE: Ce système permet à l’utilisateur d’aligner une fenêtre (ici, 50 μm x 20 μm (hauteur x largeur)) a été utilisé pour englober l’extrémité de la fibre.
      2. Focalisez le stéréoscope sur l’extrémité de la fibre à un grossissement de 500x pour une coupe précise et précise.
         REMARQUE: Le parylène C s’ablation légèrement (<10 μm) de la pointe, laissant une pointe cylindrique émoussée.
2. Affûtage de chalumeau25,26,27
   1. Coupez les fibres à 300 μm avec des ciseaux chirurgicaux.
   2. Immergez le réseau dans un plat d’eau désionisée, côté connecteur vers le bas, et fixé au fond du plat avec une petite quantité de mastic.
   3. Utilisez une caméra à stylet pour aligner les fibres avec la surface de l’eau de sorte que les fibres touchent à peine la surface de l’eau.
   4. Ajustez une flamme de chalumeau au butane à 3-5 mm et faites-la passer sur le dessus des fibres dans un mouvement de va-et-vient pour aiguiser les fibres.
      REMARQUE: Les pointes de fibres brilleront en orange lorsque la flamme passera au-dessus d’elles.
   5. Retirez le réseau du mastic et inspectez-le sous un stéréoscope pour les pointes pointues sous un grossissement de 50x.
      REMARQUE: Si des pointes pointues sont observées, aucun autre chalumeau n’est nécessaire. Si les pointes semblent émoussées, répétez les étapes 7.2.2 à 7.2.5.
3. Découpe laser ^UV28
   REMARQUE: Le laser UV ne peut être utilisé que sur des conceptions à force d’insertion nulle (ZIF) et à large carte à l’heure actuelle en raison du grand point focal du laser UV utilisé qui est plus grand que le pas des fibres de carbone Flex Array.
   1. Coupez les fibres de carbone à 1 mm avec des ciseaux chirurgicaux.
   2. Fixez un laser UV à trois étages motorisés configurés orthogonalement.
      REMARQUE: Le laser UV est un semi-conducteur multimode en nitrure d’indium-gallium (InGaN) avec une puissance de sortie de 1,5 W et une longueur d’onde de 405 nm.
      1. Assurez-vous que le laser dispose d’un faisceau continu pour un alignement et une découpe rapides et efficaces.
   3. Fixez le réseau en place pour maintenir un plan fixe et plat d’électrodes pour que le laser puisse passer. Assurez-vous que le réseau est maintenu à une distance appropriée du laser afin que les fibres soient en lumière avec le point focal du laser. Pour ce faire, fournissez une puissance inférieure au laser et ajustez la distance pour mieux se concentrer sur la ^fibre28.
   4. Déplacez le point focal du laser UV sur le plan de la fibre à une vitesse de 25 μm / s pour couper les fibres à la longueur souhaitée (ici, toutes les fibres sont coupées à 500 μm).
      REMARQUE: Les fibres émettront une lumière vive avant d’être coupées. Conservez les fibres après le traitement jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être recouvertes d’un polymère conducteur.

8. Revêtement conducteur de poly(3,4-éthylènedioxythiophène):p-toluènesulfonate (PEDOT:pTS) pour une impédance réduite

1. Mélanger des solutions de 0,01 M de 3,4-éthylènedioxythiophène et de 0,1 M de p-toluènesulfonate de sodium dans 50 mL d’eau DI et remuer pendant la nuit sur une plaque d’agitation (~450 tr/min) ou jusqu’à ce qu’aucune particule ne puisse être observée dans la solution.
   REMARQUE: Conservez la solution dans un récipient résistant à la lumière. Réfrigérer la solution après le mélange pour la garder utilisable jusqu’à 30 jours.
2. Exécutez une analyse d’impédance de 1 kHz en utilisant les mêmes paramètres qu’auparavant (étapes 5.2-5.3) dans 1x PBS. Notez quelles fibres ont une bonne connexion (<1 MΩ, généralement 14-16 des 16 fibres).
3. Electroplate avec PEDOT:pTS pour abaisser l’impédance des électrodes.
   1. Immergez les pointes de fibres dans la solution PEDOT:pTS.
   2. Suivez les étapes décrites à l’étape 5.2, en éteignant la solution PBS 1x pour PEDOT:pTS et en court-circuitant toutes les connexions à la carte vers le canal actuel appliqué.
   3. Appliquer 600 pA par bonne fibre pendant 600 s à l’aide d’un potentiostat.
   4. Éteignez la cellule et laissez-la reposer pendant 5 secondes à la fin de la course.
4. Retirez les fibres de la solution et rincez-les à l’eau DI.
5. Reprenez les impédances de 1 kHz pour vérifier que les fibres ont été enduites avec succès (utilisez les mêmes paramètres que ceux indiqués aux étapes 5.2 à 5.3).
   REMARQUE: Les bonnes fibres sont désignées comme toute fibre ayant une impédance inférieure à 110 kΩ.

9. Connexion de la terre et des fils de référence

1. Grattez doucement le parylène C du sol et les vias de référence sur la planche à l’aide d’une pince à épiler. Raccourcissez le sol et les vias de référence ensemble par paires sur cette conception de carte.
   REMARQUE: La masse et les vias de référence se trouvent près du connecteur sur la matrice Flex et sont les quatre petits cercles d’or près des connecteurs. Les utilisateurs n’auront qu’à retirer le parylène C des vias les plus proches des fibres de carbone pour les mesures.
2. Coupez deux longueurs de 5 cm de fil d’argent isolé avec une lame de rasoir. Désinsulez les extrémités des fils de 2 à 3 mm d’une extrémité à fixer au Flex Array et d’environ 10 mm des extrémités opposées pour faciliter la mise à la terre et le référencement pendant la chirurgie.
3. Chauffer le fer à souder à 600 °F. Appliquez une petite quantité de flux sur les vias.
4. Insérez un fil (extrémité exposée de 2 à 3 mm) dans chacun des vias ePhys de la carte. Appliquez la soudure sur le dessus des vias (Figure 7A). Laissez refroidir la sonde, puis retournez-la pour appliquer une petite quantité de soudure à l’arrière de la via (Figure 7A).
5. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez tout fil exposé qui dépasse du monticule de soudure arrière, car cela contribue à réduire le bruit observé lors de l’enregistrement (Figure 7B).
6. Replacez les matrices dans la boîte de stockage, en pliant les fils vers l’arrière et loin de la fibre. Fixez les fils sur le ruban adhésif pour éviter les interactions potentielles fibre-fil (Figure 7C).

10. Intervention chirurgicale

REMARQUE: Le cortex de rat a été utilisé pour tester l’efficacité des fibres préparées au laser UV comme cela a été décrit ^{précédemment7,20}. Ces sondes fonctionneront dans les nerfs en raison de leur géométrie et de leurs niveaux d’impédance similaires à ceux des fibres préparées par chalumeau. Cette chirurgie a été réalisée avec beaucoup de prudence pour valider que le laser UV n’a pas modifié la réponse des électrodes.

1. Anesthésier un rat Long Evans mâle adulte en utilisant une combinaison de kétamine (90 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Confirmez l’anesthésie avec un test de pincement des orteils. Appliquez une pommade sur les yeux pour empêcher les yeux du rat de se dessécher pendant la chirurgie.
2. Créer une craniotomie de 2 mm x 2 mm au-dessus du cortex moteur de l’hémisphère droit. Identifiez le coin inférieur gauche de la craniotomie en mesurant 1 mm avant de bregma et 1 mm latéral de ligne médiane.
3. Montez le réseau dans un instrument stéréotaxique et mettez à zéro l’instrument stéréotaxique à la dure-mère en abaissant doucement les fibres jusqu’à ce qu’elles touchent la surface de la dure-mère. Soulevez le réseau loin du site chirurgical et déplacez-le sur le côté jusqu’à ce qu’il soit prêt à être inséré.
4. Réséquez la dure-mère en tirant doucement une aiguille avec une extrémité barbelée sur la surface du tissu. Une fois qu’une partie de la dure-mère s’ouvre sur le cerveau, utilisez une paire de pinces fines pour aider à éloigner la dure-mère.
5. Insérez les fibres dans la craniotomie et 1,2 mm dans le cerveau à l’aide d’un instrument stéréotaxique, en abaissant lentement à la main.
6. Enregistrez les données ePhys pendant 10 minutes avec un headstage et un préamplificateur spécifiques à ePhys.
   1. Réglez le filtre passe-haut du préamplificateur pour traiter le signal à 2,2 Hz, l’antialias à 7,5 kHz et l’échantillon à 25 kHz.
      REMARQUE: Pour ces mesures, seule l’activité spontanée est enregistrée. Aucun stimulus n’est appliqué.
7. Euthanasie
   1. Placer le rat sous isoflurane à 5% sous 1 L/ min d’oxygène jusqu’à ce que les signes de vie aient cessé (20-30 min). Confirmez l’euthanasie par décapitation.

11. Tri des pointes

1. Utilisez un logiciel de tri des pics pour trier et analyser les données à l’aide des méthodes précédemment ^signalées8.
2. Utilisez un filtre passe-haut sur tous les canaux (coin 250 Hz, Butterworth ^{du 4e} ordre) et réglez le niveau de détection de la forme d’onde sur -3,5 × seuil RMS.
   1. Utilisez un modèle gaussien pour regrouper et piquer des pointes présentant des caractéristiques similaires. Combinez et faites la moyenne des amas d’au moins 10 formes d’onde à inclure dans une analyse plus approfondie.
   2. Éliminez ou supprimez toutes les formes d’onde qui ne sont pas des pics de l’ensemble de données.
3. Exportez les données une fois que tous les canaux ont été triés et utilisez un logiciel d’analyse pour tracer et analyser plus en détail les formes d’onde.

12. Imagerie microscopique électronique à balayage (MEB)

REMARQUE : cette étape rendra les tableaux inutilisables et ne doit être utilisée que pour inspecter les résultats du traitement des pointes afin de vérifier que les tableaux sont correctement traités. Cette étape n’a pas besoin d’être effectuée pour créer une baie réussie. Vous trouverez ci-dessous un aperçu général du processus SEM; toutefois, les utilisateurs qui n’ont jamais utilisé SEM doivent recevoir l’aide d’un utilisateur formé.

1. Coupez l’extrémité fibrée du PCB et montez-la sur un talon SEM masqué par du ruban de carbone. Placez les matrices sur une petite plate-forme de ruban de carbone empilé (4-5 couches) pour empêcher les fibres de carbone de coller au talon SEM.
2. Enduire les matrices d’or (100-300 Å) selon les procédures décrites par le fabricant de l’enduit de pulvérisation d’or.
3. Pour inspecter les effets du traitement de la pointe, imagez les réseaux dans un MEB à une distance de travail de 15 mm et une force de faisceau de 20 kV.
   REMARQUE: Les matrices peuvent être imagées sans revêtement de pulvérisation sous un vide faible, comme illustré à la figure 8D pour les fibres découpées au laser UV. Pour cette configuration, il est recommandé d’avoir une distance de travail de 11-12 mm et une force de faisceau de 4 kV.

Validation de l’astuce : images SEM
Des travaux antérieurs20 ont montré que la découpe aux ciseaux entraînait des impédances peu fiables lorsque le parylène C se pliait sur le site d’enregistrement. La découpe aux ciseaux n’est utilisée ici que pour couper les fibres à la longueur souhaitée avant le traitement avec une méthode de découpe de finition supplémentaire. Des images SEM des pointes ont été utilisées pour déterminer la longueur et la géométrie du carbone exposé (figure 8).

Les fibres découpées au laser Scissor et Nd:YAG ont déjà été examinées17,20. Les fibres découpées aux ciseaux (Figure 8A) ont des géométries de pointe incohérentes, le parylène C se pliant sur l’extrémité lors de la coupe20. Les fibres découpées au laser Nd:YAG restent cohérentes dans la zone, la forme et l’impédance du site d’enregistrement (Figure 8B). Les fibres soufflées20 conduisent à la plus grande variabilité de taille et de forme de l’électrode et à une pointe aiguisée, permettant l’insertion dans les tissus durs. En moyenne, 140 μm de carbone ont été réexposés, avec une zone de transition en douceur entre l’isolant en carbone et l’isolant parylène C (figure 8C). Les fibres UV découpées au laser étaient similaires aux fibres soufflées, montrant 120 μm de carbone exposé à partir de la pointe (Figure 8D). Les impédances ont indiqué que les méthodes de découpe de pointe au laser UV ou au chalumeau conviennent aux ePhys et constituent des solutions viables pour les laboratoires n’ayant pas accès à un laser Nd:YAG.

Validation de l’astuce : enregistrement électrique
La figure 9 montre les impédances résultantes de chaque méthode de préparation à l’aide de Flex Arrays. Les valeurs résultantes se situent dans une plage appropriée pour l’enregistrement ePhys. Les fibres découpées au laser Nd:YAG ont donné la plus petite surface mais les impédances les plus élevées, même avec le revêtement PEDOT:pTS (carbone nu: 4138 ± 110 kΩ; avec PEDOT:pTS: 27 ± 1,15 kΩ; n = 262). Vient ensuite la relation inverse dans les fibres chalumeautées (carbone nu : 308 ± 7 kΩ ; avec PEDOT:pTS : 16 ± 0,81 kΩ ; n = 262) et uv découpées au laser (carbone nu : 468 ± 85,7 kΩ ; avec PEDOT:pTS : 27 ± 2,83 kΩ ; n = 7) qui ont une grande surface et de faibles impédances. Cependant, dans tous les cas, les fibres revêtues de PEDOT:pTS tombent sous le seuil de 110 kΩ défini précédemment pour indiquer une bonne électrode à faible impédance.

Des enregistrements ePhys aigus ont été pris sur un rat Long Evans implanté de manière aiguë avec un réseau ZIF avec des fibres laser UV découpées au laser et traitées PEDOT:pTS pour démontrer la viabilité de cette méthode. ePhys a déjà été testé et éprouvé avec des fibres découpées aux ciseaux20 et Nd:YAG-17 et traitées au chalumeau7,8 et n’a donc pas été revalidé dans ce texte. Des enregistrements aigus de quatre fibres de traitement laser UV (2 mm de longueur) qui ont été implantées simultanément dans le cortex moteur du rat (n = 1) sont présentés à la figure 10. Trois unités ont été trouvées dans toutes les fibres, ce qui suggère que le traitement des fibres avec le laser UV peu coûteux est similaire à d’autres méthodes de découpe qui permettent à la fibre de carbone d’enregistrer des unités neuronales, comme s’y attendraient les SEM et les impédances. Bien que les réseaux de fibres de carbone soient faciles à construire et à modifier pour répondre aux besoins de l’utilisateur, il convient de noter qu’une validation supplémentaire est nécessaire pour certaines versions (tableau 3), tandis que d’autres sont moins adaptées à certaines tâches finales.

Parylène C commercial
Le fournisseur a déterminé que les réseaux revêtus commercialement avaient une épaisseur de parylène C de 710 nm, bien dans la plage cible d’isolation. Les matrices ont été préparées pour les enregistrements ePhys à l’aide de la préparation de la pointe du chalumeau. Des impédances ont été prises après la préparation des pointes et comparées aux données existantes. Une sonde chalumeautée et revêtue de PEDOT:pTS avait une impédance moyenne de 14,5 ± 1,3 kΩ sur 16 fibres. Des images SEM ont été prises de la pointe et de la tige pour comparer le dépôt de parylène C (figure 11 A, B, respectivement). Ces résultats montrent que l’utilisation d’un fournisseur commercial n’a pas modifié les valeurs d’impédance attendues, ce qui suggère qu’il s’agira d’une substitution tout aussi viable aux dépôts dans la salle blanche de l’université.

Analyse des coûts des appareils
À condition que tous les outils et matériaux en vrac (p. ex. époxydes, soudures) soient accessibles au chercheur, que les frais d’utilisation du parylène C soient de 41 $ et un lot de 8 sondes, le coût total des matériaux est de 1168 $ (146 $ par sonde). L’effort du personnel (tableau 4) est d’environ 25 h pour le lot. Si vous utilisez une étape de fabrication substituée, le coût des sondes variera en fonction du coût commercial du revêtement parylène C (500 à 800 $ indiqués). Le temps des étapes de génération (tableau 4) est regroupé pour toutes les instances d’une tâche répétée pour plus de simplicité. Les temps de construction pour les conceptions avec un pas plus grand (Wide Board et ZIF) sont considérablement réduits car les étapes manuelles intensives (par exemple, le placement de la fibre de carbone) sont plus faciles et plus rapides à effectuer.

Figure 1 : connecteurs et cartes de circuits imprimés associées. (A) Wide Board avec l’un des seize connecteurs nécessaires en médaillon (barre d’échelle encastrée = 5 mm). (B) ZIF et l’un des deux connecteurs et un carénage. (C) Flex Array avec un connecteur à 36 broches; barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 : étapes de soudage et d’isolation du Flex Array. (A) Pose de la soudure pour les broches du connecteur inférieur. (B) Broches arrière fixées en place avec les broches avant prêtes à souder. (C) Flex Array isolé époxy à réglage retardé; Notez que l’époxy à réglage différé ne couvre pas les vias de référence et de mise à la terre de chaque côté. (D) À l’arrière du Flex Array avec une bande d’époxy à réglage différé à travers les vias du tampon (pas la masse et les vias de référence) et enroulée autour du côté de la carte vers le bord du connecteur. Barre d’échelle = 0,5 cm (B) et 1 cm (A, C, D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Application d’époxy d’argent et alignement de fibres de carbone entre les traces du Flex Array. Les capillaires ont été mis en évidence avec une superposition blanche. (A) L’extrémité du capillaire s’insère entre les traces pour obtenir (B) un dépôt époxy argenté propre (désigné par des flèches à l’extrémité du capillaire et à l’intérieur des traces) sans débordement en dehors des paires de traces. (C) Les fibres de carbone sont placées dans l’époxy puis (D) redressées avec un capillaire propre. Barres d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Isolation par application d’époxy UV (A) L’époxy UV est appliqué à l’aide d’un capillaire propre et de deux gouttes d’époxy UV (marquées de superpositions blanches). L’époxy UV est appliqué en gouttelettes de 0,25 à 0,75 mm de diamètre jusqu’à ce que l’époxy UV forme une bulle lisse sur le dessus des traces. (B) L’époxy UV est durci sous la lumière UV. Le Flex Array est placé en mastic sur un bloc de bois pour faciliter le mouvement et l’alignement sous la lumière UV. La lumière UV est maintenue avec un support ~ 1 cm au-dessus de l’extrémité du Flex Array. L’encart (B) montre le profil latéral d’un Flex Array correctement isolé par époxy UV. La bulle époxy UV de chaque côté de la planche mesure environ 50 μm de hauteur. Barres d’échelle = 500 μm (A et encadré B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Configuration pour les mesures d’impédance. Toutes les pièces sont étiquetées et les connecteurs et adaptateurs du système dépendent du système. PBS est mis en vedette car la solution est échangée contre PEDOT:pTS plus tard dans la génération ; toutefois, la configuration est identique sinon. Abréviations : PBS = solution saline tamponnée au phosphate; PEDOT:pTS = poly(3,4-éthylènedioxythiophène):p-toluènesulfonate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Flex Array préparé pour le revêtement Parylène C. Le Flex Array est fixé à une plate-forme en mousse surélevée avec du ruban adhésif, côté adhésif vers le haut pendant le processus de revêtement. Barre d’échelle = 10 mm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Fils de masse et de référence fixés au Flex Array finalisé. La soudure a été appliquée de chaque côté de la via de chaque côté de la planche (A) pour créer une liaison sécurisée. Les vias ePhys sont étiquetés sur la carte comme GND et Ref et appariés sur les côtés opposés de la carte les uns des autres. Il existe deux vias supplémentaires également étiquetés GND et Ref2. Les deux vias GND sont court-circuités ensemble. Ref2 est destiné à être utilisé dans des expériences électrochimiques. L’excès de fil dans (A) est indiqué par une boîte rouge et est retiré (B) de l’arrière de la sonde (la boîte rouge indique où se trouvait le fil) pour aider à réduire le bruit et à manipuler la sonde. (C) Final Flex Array stocké pour une utilisation future. Notez que les vias GND et Ref appariés sur cette carte le rendent désigné pour les enregistrements ePhys. Barres d’échelle = 200 μm (A, B). Abréviations : ePhys = électrophysiologie; GND = sol; Réf = référence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8: Images SEM de fibres avec différentes techniques de découpe de pointe. (A) Fibre découpée aux ciseaux avec très peu de carbone exposé. (B) Découpe laser Nd:YAG. (C) Fibre soufflée avec ~ 140 mm de carbone exposé à partir de la pointe. (D) Fibres UV découpées au laser avec environ 120 mm de carbone exposés à partir de la pointe. Les flèches rouges indiquent la zone de transition entre le parylène C et la fibre de carbone nue. Barres d’échelle = 5 μm (A), 10 μm (B), 50 μm (C, D). Abréviations : SEM = microscopique électronique à balayage; Nd:YAG = Grenat d’aluminium à l’yttrium dopé au néodyme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Différences d’impédance entre l’application du seul traitement (exposition au carbone nu) et l’ajout de PEDOT:pTS. Dans tous les cas, l’ajout de PEDOT:pTS diminue l’impédance d’un ordre de grandeur. Taille de l’échantillon : Nd:YAG = 262, Chalumeau = 262, UV = 7. La différence de taille de l’échantillon UV est due à la nouveauté de la méthode de préparation; cependant, il montre une plage similaire à celle du chalumeau, comme prévu. Les données d’impédance sont exprimées sous forme d’erreur-type moyenne ±. Abréviations : PEDOT:pTS = poly(3,4-éthylènedioxythiophène):p-toluènesulfonate; Grenat d’aluminium à l’yttrium dopé au néodyme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10: Données de pic électrophysiologique aigu provenant de quatre électrodes UV découpées au laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 11 : Réseaux commerciaux revêtus de parylène C. (A) Le réseau affûté montre un affûtage uniforme sur toutes les fibres, ce qui indique qu’il n’y a pas d’inconvénients au revêtement commercial. (B) Après le chalumeau, la transition (boîte rouge) entre la fibre de carbone nue et le parylène C ne montre aucune différence perceptible entre les réseaux revêtus dans une salle blanche. Barres d’échelle = 200 μm (A) et 10 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Chaque circuit imprimé est associé à un connecteur et à un pas différents. Abréviation : PCB = carte de circuit imprimé.

Tableau 2 : Plage typique d’impédances après chaque étape de construction (n = 272). *n = 16. PEDOT:Les sondes traitées par pTS au-dessus de 110 kΩ peuvent encore enregistrer des signaux; cependant, toutes les électrodes traitées tombent généralement en dessous de cette valeur. Abréviations : PEDOT:pTS = poly(3,4-éthylènedioxythiophène):p-toluènesulfonate; Grenat d’aluminium à l’yttrium dopé au néodyme.

Tableau 3 : Utilisations validées de chaque planche avec les méthodes de découpe décrites. Toutes les méthodes de coupe comprenaient l’électrodéposition de PEDOT:pTS. « Non viable » indique qu’un facteur de forme de la conception empêche ce traitement de pointe d’être testé à ce moment-là (c.-à-d. le pas de fibre). Abréviations : Grenat d’aluminium à l’yttrium dopé au néodyme; MEB = microscopie électronique à balayage; ePhys = électrophysiologie; ZIF = force d’insertion nulle.

Tableau 4 : Temps requis pour chaque étape d’un processus de fabrication. La soudure du connecteur et des fils de terre et de référence a été combinée ici pour simplifier la liste d’activités. Abréviations : PEDOT:pTS = poly(3,4-éthylènedioxythiophène):p-toluènesulfonate; Grenat d’aluminium à l’yttrium dopé au néodyme.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.