Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Caractérisation des cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir du sang périphérique porcin

1.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/63285

⸱

6 janvier 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Medical College of Wisconsin & Marquette University, 2Division of Engineering, Mayo Clinic, 3Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 4Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic

Dans cet article

Résumé

L’endothélium est une structure intégrée dynamique qui joue un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques telles que l’angiogenèse, l’hémostase, l’inflammation et l’homéostasie. L’endothélium joue également un rôle important dans les physiopathologies telles que l’athérosclérose, l’hypertension et le diabète. Les cellules endothéliales forment la paroi interne des vaisseaux sanguins et lymphatiques et présentent une hétérogénéité dans la structure et la fonction. Divers groupes ont évalué la fonctionnalité des cellules endothéliales dérivées du sang périphérique humain en mettant l’accent sur les cellules progénitrices endothéliales dérivées de cellules souches hématopoïétiques ou de cellules endothéliales à excroissance sanguine mature (ou cellules formant des colonies endothéliales). Ces cellules fournissent une ressource autologue pour la thérapeutique et la modélisation des maladies. Les cellules xénogéniques peuvent constituer une autre source thérapeutique en raison de leur disponibilité et de leur homogénéité obtenues en utilisant des animaux génétiquement similaires élevés dans des conditions similaires. Par conséquent, un protocole robuste pour l’isolement et l’expansion des cellules endothéliales de croissance sanguine hautement proliférative à partir du sang périphérique porcin a été présenté. Ces cellules peuvent être utilisées pour de nombreuses applications telles que l’ingénierie tissulaire cardiovasculaire, la thérapie cellulaire, la modélisation de maladies, le criblage de médicaments, l’étude de la biologie cellulaire endothéliale et les co-cultures in vitro pour étudier les réponses inflammatoires et de coagulation dans la xénotransplantation.

Introduction

L’endothélium est une structure dynamique très complexe et un composant vital de la paroi vasculaire. Il tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins pour fournir une interface physique entre le sang circulant et les tissus environnants. Cette structure hétérogène est connue pour remplir diverses fonctions telles que l’angiogenèse, l’inflammation, la vasorégulation et l’hémostase 1,2,3,4. Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine sont un type de cellule largement étudié pour évaluer la fonctionnalité des cellules endothéliales. Cependant, la variabilité des lots spécifique au patient, le phénotype incohérent et l’efficacité minimale de fractionnement suggèrent la nécessité de déterminer une source cellulaire qui pourrait améliorer toutes ces caractéristiques5.

L’obtention d’une population homogène de cellules endothéliales primaires peut être techniquement difficile, et les cellules endothéliales primaires ne possèdent pas une capacité proliférative élevée6. Par conséquent, pour étudier la régénération vasculaire et évaluer les processus physiopathologiques, divers groupes ont tenté d’obtenir et d’évaluer différents types de cellules endothéliales dérivées du sang périphérique, par exemple les cellules progénitrices endothéliales (CPE) ou les cellules endothéliales à excroissance sanguine (BOEC)6,7,8,9 . Les premiers CPE en forme de fuseau proviennent de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et ont un pouvoir de croissance limité et une capacité angiogénique limitée à produire des cellules endothéliales matures. De plus, ils ressemblent beaucoup aux monocytes inflammatoires. De plus, leur capacité à se différencier davantage en cellules endothéliales fonctionnelles, proliférantes et matures est encore discutable 6,7,9,10. La culture continue de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) peut donner naissance à une population secondaire de cellules appelées EPC à croissance tardive, BOEC ou cellules endothéliales formant colonies (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. en 2018, ont reconnu les limites des CPE, l’ambiguïté de leur nomenclature, ainsi qu’un manque général de concordance avec de nombreux types de cellules distinctes continuellement regroupés sous EPC11. En revanche, les BOEC sont reconnus pour leur rôle dans la réparation vasculaire, la santé et la maladie, et la thérapie cellulaire. D’autres études et l’utilisation thérapeutique de ces cellules reposeront sur des protocoles visant à dériver systématiquement ces types de cellules à partir de cellules progénitrices circulantes.

Les cellules primaires telles que les BOEC peuvent être utilisées comme substitut pour obtenir des cellules endothéliales matures hautement prolifératives6. Les BOEC sont phénotypiquement distinctes des premiers EPC et présentent des caractéristiques endothéliales typiques telles que la morphologie pavée et l’expression des jonctions adhérentes et des cavéoles12. Le profilage génétique par Hebbel et al.13,14,15 a révélé que les BOEC ou ECFC sont les véritables cellules endothéliales car elles favorisent la formation de microvasculaires et de gros vaisseaux. Ainsi, les BOEC peuvent être utilisés comme un outil pour évaluer les processus physiopathologiques et la variation génétique16. Ils sont également considérés comme une excellente source cellulaire pour la thérapie cellulaire pour la régénération vasculaire17. Par conséquent, un protocole standardisé pour dériver de manière cohérente ces cellules hautement prolifératives est essentiel.

Alors que les BOEC fournissent un outil puissant pour étudier les variations physiopathologiques et génétiques humaines, une source plus homogène de BOEC peut fournir des résultats expérimentaux et thérapeutiques plus robustes et fiables. Une homogénéité supérieure peut être obtenue en utilisant des sources de cellules xénogéniques dérivées d’animaux génétiquement similaires élevés dans des conditions similaires18. Alors que les sources de cellules xénogéniques sont susceptibles de provoquer une réponse immunitaire de l’hôte, des stratégies d’immunomodulation sont en cours d’élaboration dans le but de générer des animaux et des produits animaux immunocompatibles, y compris des cellules. Les porcs, en particulier, sont une source abondante de sang périphérique et sont couramment utilisés pour étudier les dispositifs médicaux et autres thérapies en raison de similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Par conséquent, cette étude affine le protocole pour l’isolement et l’expansion des BOEC hautement prolifératifs à partir du sang périphérique porcin. Le protocole détaillé ci-dessous est une méthode simple et fiable pour obtenir un grand nombre de BOEC à partir d’un volume de sang relativement faible. Les cultures peuvent être étendues à travers plusieurs passages pour générer des millions de cellules à partir d’un seul échantillon de sang.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par les comités institutionnels respectifs de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Medical College of Wisconsin et de la Mayo Clinic.

NOTE: Dans cette étude, des porcs domestiques croisés Yorkshire/Landrace/Duroc (Sus domesticus), mâles et femelles, âgés de 40 à 80 kg, âgés de 3 à 6 mois, ont été utilisés.

1. Prélèvement de sang périphérique porcin

  1. Préparer le matériel.
    1. Diluer la solution d’héparine à 100 U/mL dans une solution saline stérile.
    2. Ajouter 3 à 4 mL de solution d’héparine à chacun des deux tubes coniques de 50 mL et des deux seringues de 60 mL.
    3. Aspirer la solution d’héparine non diluée (1 000 U/mL) dans un tube d’extension.
    4. Connectez une aiguille de 19 G à une extrémité du tube d’extension rempli d’héparine et une seringue de 60 ml contenant de l’héparine à l’autre extrémité.
  2. Anesthésier un porc selon les politiques de l’établissement
    1. Administrer une injection IM d’atropine (0,05 mg / kg), de tilétamine / zolazepam (2-5 mg / kg) et de xylazine (2 mg / kg) pour induire l’anesthésie.
      REMARQUE: une anesthésie adéquate est obtenue une fois que l’animal est inconscient et que les muscles mandibulaires ne sont pas rigides.
    2. Posez l’animal en décubitus dorsal et placez des serviettes enroulées des deux côtés pour assurer la stabilité.
    3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
    4. Fournir un soutien thermique pendant l’anesthésie, y compris des couvertures, des coussins chauffants et / ou une table de procédure chauffée.
  3. Nettoyez la région de l’aine fémorale avec une solution de gommage à la bétadine.
  4. Percez la veine fémorale ou l’artère avec l’aiguille de 19 G et aspirez lentement (~1-2 mL/s) 50 mL de sang dans la seringue.
    REMARQUE: Dessiner trop vite peut endommager les cellules.
  5. En laissant l’aiguille en place, pliez immédiatement le tube d’extension et débranchez la seringue de 60 mL
  6. Transférer lentement le sang dans un tube conique de 50 ml contenant de l’héparine.
  7. Boucher hermétiquement le tube conique de 50 mL, retourner doucement quelques fois pour mélanger et placer sur de la glace.
  8. Connectez la seringue restante de 60 mL contenant de l’héparine au tube d’extension, détachez le tube d’extension et aspirez lentement 50 mL de sang supplémentaires dans la seringue.
  9. Retirez immédiatement l’aiguille de l’artère ou de la veine et aspirez lentement le sang restant du tube d’extension dans la seringue.
  10. Débranchez la seringue de 60 mL du tube d’extension et transférez lentement le sang dans le tube conique restant contenant de l’héparine de 50 mL.
  11. Boucher hermétiquement le tube conique de 50 mL, retourner doucement quelques fois pour mélanger et placer sur de la glace.
  12. Appliquez l’hémostase de pression sur la région fémorale de l’aine du porc.
  13. Récupérer le porc conformément aux politiques de l’établissement. Surveillez continuellement l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir la position couchée sternale et retourner à l’aire normale de logement ou de chenil.

2. Isolement des cellules mononucléaires

  1. Diluer le sang 1:1 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans quatre tubes coniques de 50 mL.
    NOTE: Ce travail doit être effectué dans une hotte de culture cellulaire en utilisant une technique aseptique pour éviter de contaminer la culture cellulaire.
  2. Ajouter 25 mL de solution de gradient de densité prête à l’emploi à température ambiante à huit tubes coniques de 50 mL.
  3. Pipeter très lentement 25 mL de solution sanguine/saline à l’intérieur de chaque solution à gradient de densité contenant 50 mL de tube conique en tenant le tube à un angle aigu par rapport à l’extrémité de la pipette.
    REMARQUE: La solution sanguine doit se superposer doucement sur la solution de gradient de densité et maintenir une interface bien définie.
  4. Centrifuger les tubes pendant 30 min à 560 x g et à température ambiante (RT).
    REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, désactivez le frein de la centrifugeuse si possible.
  5. Utilisez une pipette mince pour recueillir soigneusement la couche leucocytaire (couche trouble de cellules mononucléaires au-dessus de la solution de gradient de densité et sous le plasma clair) de chaque tube et répartir uniformément dans deux nouveaux tubes coniques de 50 mL. Jeter la solution de gradient de densité contenant les tubes.
    NOTE: Recueillir autant de pelage leucocytaire que possible tout en recueillant le moins possible de la solution de gradient de densité et du plasma.

3. Lavage et placage des cellules

  1. Enduisez une assiette à 6 puits de fibronectine.
    1. Préparer une solution mère de fibronectine plasmatique humaine en la diluant à 1 mg/mL dans de l’eau stérile. Conserver les aliquotes à -20 °C.
    2. Faire 3,6 mL d’une solution de travail de fibronectine en diluant 600 μL de solution mère de fibronectine dans 3 mL de PBS.
    3. Transférer 600 μL de la solution de travail à base de fibronectine dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et rocher doucement jusqu’à ce qu’il soit uniformément enduit.
    4. Attendez 30 minutes que la fibronectine recouvre les puits et aspirez doucement la solution de chaque puits.
  2. En attendant que la fibronectine s’enrobe, lavez les cellules mononucléées
    1. Remplissez les tubes avec jusqu’à 45 ml de PBS
    2. Centrifuger pendant 5 min à 560 x g et 4 °C avec frein bas. Aspirer le surnageant des deux tubes.
    3. Remettez chaque pastille cellulaire en suspension dans 25 mL de PBS.
    4. Répétez pour laver une deuxième fois.
  3. Remettez chaque pastille cellulaire en suspension dans 5 mL de PBS et ajoutez 15 mL de solution de chlorure d’ammonium à 0,8 % dans chaque tube.
    REMARQUE: Cette étape consiste à lyser les globules rouges restants.
  4. Incuber sur la glace pendant 10 min.
  5. Laver les cellules comme avant en remplissant les tubes avec du PBS et une centrifugeuse pendant 5 min à 560 x g et 4 °C avec un frein faible. Aspirer le surnageant des deux tubes.
  6. Remettez chaque pastille de cellule dans 25 ml de PBS et répétez pour laver une deuxième fois.
  7. Remettez chaque pastille cellulaire en suspension dans 6 mL de milieu de culture EGM-2 additionné de 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et de 1x solution antibiotique/antimycotique contenant 10 000 U/mL de pénicilline, 10 mg/mL de streptomycine et 25 μg/mL d’amphotéricine.
    REMARQUE : Le milieu de culture EGM-2 se compose d’un milieu de culture EBM-2 supplémenté avec 200 μL d’hydrocortisone, 2 mL de facteur de croissance des fibroblastes humains (hFGF-B), 500 μL de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), 500 μL d’analogue recombinant du facteur de croissance analogue à l’insuline (R3 IGF-1), 500 μL d’acide ascorbique, 500 μL de facteur de croissance épidermique humain (hEGF), 500 μL de gentamicine/amphotéricine et 500 μL d’héparine par 500 mL.
  8. Transférer doucement 2 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 6 puits recouverte de fibronectine et creuser doucement jusqu’à ce qu’elle soit uniformément recouverte.
    NOTE: L’objectif est d’ensemencer autant de cellules que possible pour maximiser le nombre de colonies endothéliales qui se formeront.

4. Culture cellulaire

  1. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO2 et 100% d’humidité.
  2. Le lendemain, ajouter délicatement 1 mL de milieu de culture frais à chaque puits.
    REMARQUE: il est important d’être doux pour ne pas déranger les cellules qui adhèrent vaguement au revêtement de fibronectine.
  3. Le lendemain, effectuez un demi-changement de milieu de culture en aspirant doucement 1,5 mL de milieu de culture de chaque puits et en le remplaçant par 1,5 mL de milieu de culture frais.
  4. Au cours de chacun des 5 jours suivants, effectuer doucement un changement complet de milieu de culture à chaque puits (2 mL de milieu de culture frais par puits).
  5. Après cela, changez doucement le milieu de culture trois fois par semaine.
  6. Visualisez régulièrement les cultures cellulaires sous microscopie optique de faible puissance (objectif 4x).
    REMARQUE : Les colonies de cellules endothéliales adhérentes à excroissance sanguine (BOEC) commenceront à apparaître dans les puits 7 à 10 jours après le placage. Les types de cellules non adhérentes seront éliminés avec des changements moyens, et d’autres types de cellules adhérentes se dissiperont progressivement à mesure que les colonies BOEC se développent.
  7. Faire passer les BOEC dans une fiole de T-75 recouverte de fibronectine lorsque ~70%-80% confluent et continuer à changer de milieu de culture trois fois par semaine.
    REMARQUE : La densité d’ensemencement peut être contrôlée en passant les colonies dans un ballon T25. Les passages suivants ne nécessitent pas d’enrobage de fibronectine, et les changements de milieu de culture peuvent être réduits à deux fois par semaine.
  8. Les cellules des passages 1 à 3 peuvent être utilisées à des fins expérimentales ou transférées dans un milieu de congélation et stockées dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La morphologie des cellules cultivées a été observée depuis le début de la culture jusqu’à ce que les colonies de BOEC soient observées (figure 1). Une plus petite population de cellules adhérentes a commencé à se fixer aux boîtes de culture et à se développer, tandis que les cellules non adhérentes ont été éliminées avec des changements de milieu de culture (Figure 1B). Les colonies sont apparues pour la première fois le jour 6 sous la forme d’une collection de...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Les BOEC sont un outil puissant qui peut être utilisé dans diverses approches scientifiques et thérapeutiques 7,8,16. Les BOEC ont été utilisés pour analyser l’expression des gènes EC afin d’élucider les facteurs clés responsables du développement des maladies vasculaires et du cancer 5,19,20,21. Les B...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier le financement du NIH/NHLBI R00 HL129068.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille 19 GCovidien1188818112
50 mL Tubes coniquesCorning352098
6 puitsBD Falcon353046
Seringues 60 mLCovidien8881560125
Solution de chlorure d’ammonium (0,8 %)Stemcell Technologies07850
Solution antibiotique/antimycosique (100x)Gibco15240-062
CentrifugeuseThermo Scientific75-253-839
Milieu de culture EGM-2Lonza WalkersvilleCC-3162
Tube d’extensionHanna Pharmaceutical Supply Co.03382C6227
Sérum fœtal bovin (FBS)Atlas BiologicalsF-0500-A
Ficoll-Paque 1077Cytiva17144003Solution à gradient de densité
Héparine sodique injectable (1 000 unités/mL)Pfizer00069-0058-01
Fibronectine plasmatique humaineGibco33016-015
GlaceN/AN/A
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco10010-023
Set de pipettesEppendorf2231300004
Eau stérileGibco15230-162
Pipette fineCelltreat Scientific229280

Références

  1. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  2. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms. Circulation Research. 100 (2), 158-173 (2007).
  3. Pober, J. S., Tellides, G. Participation of blood vessel cells in human adaptive immune responses. Trends in Immunology. 33 (1), 49-57 (2012).
  4. Navarro, S., et al. The endothelial cell protein C receptor: its role in thrombosis. Thrombosis Research. 128 (5), 410-416 (2011).
  5. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  6. Ormiston, M. L., et al. Generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53384(2015).
  7. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. Journal of Clinical Investigation. 105 (1), 71-77 (2000).
  8. Martin-Ramirez, J., Hofman, M., Biggelaar, M. V. D., Hebbel, R. P., Voorberg, J. Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood. Nature Protocols. 7 (9), 1709-1715 (2012).
  9. Gulati, R., et al. Diverse origin and function of cells with endothelial phenotype obtained from adult human blood. Circulation Research. 93 (11), 1023-1025 (2003).
  10. Hebbel, R. P. Blood endothelial cells: utility from ambiguity. The Journal of Clinical Investigation. 127 (5), 1613-1615 (2017).
  11. Medina, R. J., et al. Endothelial progenitors: A consensus statement on nomenclature. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1316-1320 (2018).
  12. Medina, R. J., et al. Molecular analysis of endothelial progenitor cell (EPC) subtypes reveals two distinct cell populations with different identities. BMC Medical Genomics. 3, 18(2010).
  13. Jiang, A., Pan, W., Milbauer, L. C., Shyr, Y., Hebbel, R. P. A practical question based on cross-platform microarray data normalization: are BOEC more like large vessel or microvascular endothelial cells or neither of them. Journal of Bioinformatics and Computational Biology. 5 (4), 875-893 (2007).
  14. Pan, W., Shen, X., Jiang, A., Hebbel, R. P. Semi-supervised learning via penalized mixture model with application to microarray sample classification. Bioinformatics. 22 (19), 2388-2395 (2006).
  15. Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (9), 1584-1595 (2008).
  16. Fernandez, L. A., et al. Blood outgrowth endothelial cells from hereditary haemorrhagic telangiectasia patients reveal abnormalities compatible with vascular lesions. Cardiovascular Research. 68 (2), 235-248 (2005).
  17. Critser, P. J., Yoder, M. C. Endothelial colony-forming cell role in neoangiogenesis and tissue repair. Current Opinion in Organ Transplantation. 15 (1), 68-72 (2010).
  18. Zhao, Y., et al. Isolation and culture of primary aortic endothelial cells from miniature pigs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59673(2019).
  19. Chang Milbauer, L., et al. Genetic endothelial systems biology of sickle stroke risk. Blood. 111 (7), 3872-3879 (2008).
  20. Wei, P., et al. Differential endothelial cell gene expression by African Americans versusCaucasian Americans: a possible contribution to health disparity in vascular disease and cancer. BMC Medicine. 9 (1), 2(2011).
  21. Hasstedt, S. J., et al. Cell adhesion molecule 1: a novel risk factor for venous thrombosis. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 114 (14), 3084-3091 (2009).
  22. Milbauer, L. C., et al. Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Translational Research. 153 (4), 179-189 (2009).
  23. Matsui, H., et al. Ex vivo gene therapy for hemophilia A that enhances safe delivery and sustained in vivo factor VIII expression from lentivirally engineered endothelial progenitors. Stem Cells. 25 (10), 2660-2669 (2007).
  24. De Meyer, S. F., et al. Phenotypic correction of von Willebrand disease type 3 blood-derived endothelial cells with lentiviral vectors expressing von Willebrand factor. Blood. 107 (12), 4728-4736 (2006).
  25. Bodempudi, V., et al. Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Therapy. 17 (12), 855-863 (2010).
  26. Dudek, A. Z., et al. Systemic inhibition of tumour angiogenesis by endothelial cell-based gene therapy. British Journal of Cancer. 97 (4), 513-522 (2007).
  27. Moubarik, C., et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (1), 208-220 (2011).
  28. Pislaru Sorin, V., et al. Magnetic forces enable rapid endothelialization of synthetic vascular grafts. Circulation. 114 (1), 314(2006).
  29. Satyananda, V., et al. New concepts of immune modulation in xenotransplantation. Transplantation. 96 (11), 937-945 (2013).
  30. Klymiuk, N., Aigner, B., Brem, G., Wolf, E. Genetic modification of pigs as organ donors for xenotransplantation. Molecular Reproduction and Development. 77 (3), 209-221 (2010).
  31. Ryczek, N., Hryhorowicz, M., Zeyland, J., Lipiński, D., Słomski, R. CRISPR/Cas technology in pig-to-human xenotransplantation research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3196(2021).
  32. Cooper, D. K., Koren, E., Oriol, R. Genetically engineered pigs. Lancet. 342 (8872), 682-683 (1993).
  33. Cozzi, E., White, D. J. G. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine. 1 (9), 964-966 (1995).
  34. Phelps, C. J., et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science. 299 (5605), New York, N.Y. 411-414 (2003).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Isolement de cellules endothélialesCentrifugation sur gradient de densitéRevêtement à la fibronectineIsolement de cellules mononuclééesCytométrie en fluxMarqueur CD31Essai de formation de tubesIngénierie tissulaire cardiovasculaire
Caractérisation des cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir du sang périphérique porcin
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.