Caractérisation des cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir du sang périphérique porcin

L’endothélium est une structure dynamique très complexe et un composant vital de la paroi vasculaire. Il tapisse la surface interne des vaisseaux sanguins pour fournir une interface physique entre le sang circulant et les tissus environnants. Cette structure hétérogène est connue pour remplir diverses fonctions telles que l’angiogenèse, l’inflammation, la vasorégulation et l’hémostase 1,2,3,4. Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine sont un type de cellule largement étudié pour évaluer la fonctionnalité des cellules endothéliales. Cependant, la variabilité des lots spécifique au patient, le phénotype incohérent et l’efficacité minimale de fractionnement suggèrent la nécessité de déterminer une source cellulaire qui pourrait améliorer toutes ces caractéristiques⁵.

L’obtention d’une population homogène de cellules endothéliales primaires peut être techniquement difficile, et les cellules endothéliales primaires ne possèdent pas une capacité proliférative élevée⁶. Par conséquent, pour étudier la régénération vasculaire et évaluer les processus physiopathologiques, divers groupes ont tenté d’obtenir et d’évaluer différents types de cellules endothéliales dérivées du sang périphérique, par exemple les cellules progénitrices endothéliales (CPE) ou les cellules endothéliales à excroissance sanguine (BOEC)6,7,8,9 . Les premiers CPE en forme de fuseau proviennent de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et ont un pouvoir de croissance limité et une capacité angiogénique limitée à produire des cellules endothéliales matures. De plus, ils ressemblent beaucoup aux monocytes inflammatoires. De plus, leur capacité à se différencier davantage en cellules endothéliales fonctionnelles, proliférantes et matures est encore discutable 6,7,9,10. La culture continue de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) peut donner naissance à une population secondaire de cellules appelées EPC à croissance tardive, BOEC ou cellules endothéliales formant colonies (ECFC)6,7,9,10. Medina et al. en 2018, ont reconnu les limites des CPE, l’ambiguïté de leur nomenclature, ainsi qu’un manque général de concordance avec de nombreux types de cellules distinctes continuellement regroupés sous EPC¹¹. En revanche, les BOEC sont reconnus pour leur rôle dans la réparation vasculaire, la santé et la maladie, et la thérapie cellulaire. D’autres études et l’utilisation thérapeutique de ces cellules reposeront sur des protocoles visant à dériver systématiquement ces types de cellules à partir de cellules progénitrices circulantes.

Les cellules primaires telles que les BOEC peuvent être utilisées comme substitut pour obtenir des cellules endothéliales matures hautement prolifératives⁶. Les BOEC sont phénotypiquement distinctes des premiers EPC et présentent des caractéristiques endothéliales typiques telles que la morphologie pavée et l’expression des jonctions adhérentes et des cavéoles¹². Le profilage génétique par Hebbel et ^al.13,14,15 a révélé que les BOEC ou ECFC sont les véritables cellules endothéliales car elles favorisent la formation de microvasculaires et de gros vaisseaux. Ainsi, les BOEC peuvent être utilisés comme un outil pour évaluer les processus physiopathologiques et la variation génétique¹⁶. Ils sont également considérés comme une excellente source cellulaire pour la thérapie cellulaire pour la régénération vasculaire¹⁷. Par conséquent, un protocole standardisé pour dériver de manière cohérente ces cellules hautement prolifératives est essentiel.

Alors que les BOEC fournissent un outil puissant pour étudier les variations physiopathologiques et génétiques humaines, une source plus homogène de BOEC peut fournir des résultats expérimentaux et thérapeutiques plus robustes et fiables. Une homogénéité supérieure peut être obtenue en utilisant des sources de cellules xénogéniques dérivées d’animaux génétiquement similaires élevés dans des conditions similaires¹⁸. Alors que les sources de cellules xénogéniques sont susceptibles de provoquer une réponse immunitaire de l’hôte, des stratégies d’immunomodulation sont en cours d’élaboration dans le but de générer des animaux et des produits animaux immunocompatibles, y compris des cellules. Les porcs, en particulier, sont une source abondante de sang périphérique et sont couramment utilisés pour étudier les dispositifs médicaux et autres thérapies en raison de similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Par conséquent, cette étude affine le protocole pour l’isolement et l’expansion des BOEC hautement prolifératifs à partir du sang périphérique porcin. Le protocole détaillé ci-dessous est une méthode simple et fiable pour obtenir un grand nombre de BOEC à partir d’un volume de sang relativement faible. Les cultures peuvent être étendues à travers plusieurs passages pour générer des millions de cellules à partir d’un seul échantillon de sang.

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par les comités institutionnels respectifs de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Medical College of Wisconsin et de la Mayo Clinic.

NOTE: Dans cette étude, des porcs domestiques croisés Yorkshire/Landrace/Duroc (Sus domesticus), mâles et femelles, âgés de 40 à 80 kg, âgés de 3 à 6 mois, ont été utilisés.

1. Prélèvement de sang périphérique porcin

1. Préparer le matériel.
   1. Diluer la solution d’héparine à 100 U/mL dans une solution saline stérile.
   2. Ajouter 3 à 4 mL de solution d’héparine à chacun des deux tubes coniques de 50 mL et des deux seringues de 60 mL.
   3. Aspirer la solution d’héparine non diluée (1 000 U/mL) dans un tube d’extension.
   4. Connectez une aiguille de 19 G à une extrémité du tube d’extension rempli d’héparine et une seringue de 60 ml contenant de l’héparine à l’autre extrémité.
2. Anesthésier un porc selon les politiques de l’établissement
   1. Administrer une injection IM d’atropine (0,05 mg / kg), de tilétamine / zolazepam (2-5 mg / kg) et de xylazine (2 mg / kg) pour induire l’anesthésie.
      REMARQUE: une anesthésie adéquate est obtenue une fois que l’animal est inconscient et que les muscles mandibulaires ne sont pas rigides.
   2. Posez l’animal en décubitus dorsal et placez des serviettes enroulées des deux côtés pour assurer la stabilité.
   3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
   4. Fournir un soutien thermique pendant l’anesthésie, y compris des couvertures, des coussins chauffants et / ou une table de procédure chauffée.
3. Nettoyez la région de l’aine fémorale avec une solution de gommage à la bétadine.
4. Percez la veine fémorale ou l’artère avec l’aiguille de 19 G et aspirez lentement (~1-2 mL/s) 50 mL de sang dans la seringue.
   REMARQUE: Dessiner trop vite peut endommager les cellules.
5. En laissant l’aiguille en place, pliez immédiatement le tube d’extension et débranchez la seringue de 60 mL
6. Transférer lentement le sang dans un tube conique de 50 ml contenant de l’héparine.
7. Boucher hermétiquement le tube conique de 50 mL, retourner doucement quelques fois pour mélanger et placer sur de la glace.
8. Connectez la seringue restante de 60 mL contenant de l’héparine au tube d’extension, détachez le tube d’extension et aspirez lentement 50 mL de sang supplémentaires dans la seringue.
9. Retirez immédiatement l’aiguille de l’artère ou de la veine et aspirez lentement le sang restant du tube d’extension dans la seringue.
10. Débranchez la seringue de 60 mL du tube d’extension et transférez lentement le sang dans le tube conique restant contenant de l’héparine de 50 mL.
11. Boucher hermétiquement le tube conique de 50 mL, retourner doucement quelques fois pour mélanger et placer sur de la glace.
12. Appliquez l’hémostase de pression sur la région fémorale de l’aine du porc.
13. Récupérer le porc conformément aux politiques de l’établissement. Surveillez continuellement l’animal jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir la position couchée sternale et retourner à l’aire normale de logement ou de chenil.

2. Isolement des cellules mononucléaires

1. Diluer le sang 1:1 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans quatre tubes coniques de 50 mL.
   NOTE: Ce travail doit être effectué dans une hotte de culture cellulaire en utilisant une technique aseptique pour éviter de contaminer la culture cellulaire.
2. Ajouter 25 mL de solution de gradient de densité prête à l’emploi à température ambiante à huit tubes coniques de 50 mL.
3. Pipeter très lentement 25 mL de solution sanguine/saline à l’intérieur de chaque solution à gradient de densité contenant 50 mL de tube conique en tenant le tube à un angle aigu par rapport à l’extrémité de la pipette.
   REMARQUE: La solution sanguine doit se superposer doucement sur la solution de gradient de densité et maintenir une interface bien définie.
4. Centrifuger les tubes pendant 30 min à 560 x g et à température ambiante (RT).
   REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, désactivez le frein de la centrifugeuse si possible.
5. Utilisez une pipette mince pour recueillir soigneusement la couche leucocytaire (couche trouble de cellules mononucléaires au-dessus de la solution de gradient de densité et sous le plasma clair) de chaque tube et répartir uniformément dans deux nouveaux tubes coniques de 50 mL. Jeter la solution de gradient de densité contenant les tubes.
   NOTE: Recueillir autant de pelage leucocytaire que possible tout en recueillant le moins possible de la solution de gradient de densité et du plasma.

3. Lavage et placage des cellules

1. Enduisez une assiette à 6 puits de fibronectine.
   1. Préparer une solution mère de fibronectine plasmatique humaine en la diluant à 1 mg/mL dans de l’eau stérile. Conserver les aliquotes à -20 °C.
   2. Faire 3,6 mL d’une solution de travail de fibronectine en diluant 600 μL de solution mère de fibronectine dans 3 mL de PBS.
   3. Transférer 600 μL de la solution de travail à base de fibronectine dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et rocher doucement jusqu’à ce qu’il soit uniformément enduit.
   4. Attendez 30 minutes que la fibronectine recouvre les puits et aspirez doucement la solution de chaque puits.
2. En attendant que la fibronectine s’enrobe, lavez les cellules mononucléées
   1. Remplissez les tubes avec jusqu’à 45 ml de PBS
   2. Centrifuger pendant 5 min à 560 x g et 4 °C avec frein bas. Aspirer le surnageant des deux tubes.
   3. Remettez chaque pastille cellulaire en suspension dans 25 mL de PBS.
   4. Répétez pour laver une deuxième fois.
3. Remettez chaque pastille cellulaire en suspension dans 5 mL de PBS et ajoutez 15 mL de solution de chlorure d’ammonium à 0,8 % dans chaque tube.
   REMARQUE: Cette étape consiste à lyser les globules rouges restants.
4. Incuber sur la glace pendant 10 min.
5. Laver les cellules comme avant en remplissant les tubes avec du PBS et une centrifugeuse pendant 5 min à 560 x g et 4 °C avec un frein faible. Aspirer le surnageant des deux tubes.
6. Remettez chaque pastille de cellule dans 25 ml de PBS et répétez pour laver une deuxième fois.
7. Remettez chaque pastille cellulaire en suspension dans 6 mL de milieu de culture EGM-2 additionné de 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et de 1x solution antibiotique/antimycotique contenant 10 000 U/mL de pénicilline, 10 mg/mL de streptomycine et 25 μg/mL d’amphotéricine.
   REMARQUE : Le milieu de culture EGM-2 se compose d’un milieu de culture EBM-2 supplémenté avec 200 μL d’hydrocortisone, 2 mL de facteur de croissance des fibroblastes humains (hFGF-B), 500 μL de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), 500 μL d’analogue recombinant du facteur de croissance analogue à l’insuline (_R3 IGF-1), 500 μL d’acide ascorbique, 500 μL de facteur de croissance épidermique humain (hEGF), 500 μL de gentamicine/amphotéricine et 500 μL d’héparine par 500 mL.
8. Transférer doucement 2 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 6 puits recouverte de fibronectine et creuser doucement jusqu’à ce qu’elle soit uniformément recouverte.
   NOTE: L’objectif est d’ensemencer autant de cellules que possible pour maximiser le nombre de colonies endothéliales qui se formeront.

4. Culture cellulaire

1. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO₂ et 100% d’humidité.
2. Le lendemain, ajouter délicatement 1 mL de milieu de culture frais à chaque puits.
   REMARQUE: il est important d’être doux pour ne pas déranger les cellules qui adhèrent vaguement au revêtement de fibronectine.
3. Le lendemain, effectuez un demi-changement de milieu de culture en aspirant doucement 1,5 mL de milieu de culture de chaque puits et en le remplaçant par 1,5 mL de milieu de culture frais.
4. Au cours de chacun des 5 jours suivants, effectuer doucement un changement complet de milieu de culture à chaque puits (2 mL de milieu de culture frais par puits).
5. Après cela, changez doucement le milieu de culture trois fois par semaine.
6. Visualisez régulièrement les cultures cellulaires sous microscopie optique de faible puissance (objectif 4x).
   REMARQUE : Les colonies de cellules endothéliales adhérentes à excroissance sanguine (BOEC) commenceront à apparaître dans les puits 7 à 10 jours après le placage. Les types de cellules non adhérentes seront éliminés avec des changements moyens, et d’autres types de cellules adhérentes se dissiperont progressivement à mesure que les colonies BOEC se développent.
7. Faire passer les BOEC dans une fiole de T-75 recouverte de fibronectine lorsque ~70%-80% confluent et continuer à changer de milieu de culture trois fois par semaine.
   REMARQUE : La densité d’ensemencement peut être contrôlée en passant les colonies dans un ballon T25. Les passages suivants ne nécessitent pas d’enrobage de fibronectine, et les changements de milieu de culture peuvent être réduits à deux fois par semaine.
8. Les cellules des passages 1 à 3 peuvent être utilisées à des fins expérimentales ou transférées dans un milieu de congélation et stockées dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.

La morphologie des cellules cultivées a été observée depuis le début de la culture jusqu’à ce que les colonies de BOEC soient observées (figure 1). Une plus petite population de cellules adhérentes a commencé à se fixer aux boîtes de culture et à se développer, tandis que les cellules non adhérentes ont été éliminées avec des changements de milieu de culture (Figure 1B). Les colonies sont apparues pour la première fois le jour 6 sous la forme d’une collection de cellules de type endothélial, proliférant radialement vers l’extérieur à partir d’un point central (Figure 1D). Au fur et à mesure que la culture progressait, les colonies cellulaires devenaient plus denses et présentaient une morphologie pavée similaire à celle des cellules endothéliales matures (Figure 1F). La morphologie typique des pavés endothéliaux permet une identification préliminaire facile des BOEC à l’aide d’un microscope optique.

Les colonies de cellules endothéliales sont généralement prêtes à passer après 10 à 14 jours de culture. À l’heure actuelle, la plaque à 6 puits produira généralement ~ 1 million de cellules avec un pourcentage de viabilité de 93% à 98%. Au cours du premier passage, les cellules endothéliales vont se dilater pour produire ~6-10 millions de cellules dans un flacon T75.

Pour évaluer la morphogenèse des BOEC, la matrice de la membrane basale (p. ex. Matrigel) a été plaquée sur des plaques d’angiogenèse de 15 puits à 10 μL/puits et incubée à 37 °C pendant 30 minutes pour permettre la polymérisation. Les cellules du passage 2 ont été ensemencées sur des plaques recouvertes de matrice membranaire basale et imagées à des points temporels de 14 h et 24 h. Une densité d’environ 3 500 cellules par puits a pu former un réseau et des structures tubulaires. La formation de sondes a été observée dans les 14 heures pour le milieu libre sérique (EGM-2 avec suppléments sauf pour FBS) et dans les 24 heures pour le milieu de croissance complet (EGM-2 avec suppléments, y compris FBS). L’ajout de FBS peut avoir dilué les facteurs de croissance spécifiques des cellules endothéliales (par exemple, VEGF) et introduit d’autres facteurs de signalisation entraînant le retard du processus de formation du tube. La microscopie à contraste de phase 2D a été utilisée pour imager la formation de tubes dans un milieu sans sérum (Figure 2A,B) et un milieu de croissance complet (Figure 2C,D). Les cellules des deux milieux ont subi une différenciation morphologique et se sont rapidement organisées en vastes réseaux de structures capillaires en forme de tube. Ces structures étaient composées de cordons cellulaires organisés ressemblant à des réseaux capillaires in vivo. De plus, des micrographies à grossissement 20x illustrent en détail l’organisation multicellulaire complexe des cellules endothéliales et leur différenciation morphologique. Aucune différence morphologique n’a été observée entre les conditions du milieu. Le vaste réseau de structures capillaires en forme de tube suggère fortement la différenciation des cellules cultivées en cellules endothéliales matures et fonctionnelles.

Les BOEC ont également été caractérisés par l’expression du marqueur des cellules endothéliales matures CD31 ou de la molécule d’adhésion plaquettaire des cellules endothéliales 1 (PECAM1) (Figure 3A,B). Les BOEC ont montré une expression uniforme de CD31. De plus, l’analyse par cytométrie en flux a confirmé l’absence de CPE car les cellules étaient colorées négatives pour le marqueur monocytaire CD14 par rapport au groupe témoin positif des PBMC (Figure 3C,D).

Figure 1 : Images de microscopie optique phénotype. Les images de microscopie optique de BOEC cultivés observées à un grossissement de 10x le jour 0, (B) le jour 2, (C) le jour 4, (J) le jour 6, (E) le jour 8 et (F) après le premier passage. Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Différenciation morphologique et organisation des BOEC de passage 2. Une différenciation morphologique et une organisation des BOEC de passage 2 en structures capillaires en forme de tube capillaire ont été observées dans la matrice membranaire basale en 14 heures pour le milieu sans sérum et dans les 24 heures pour le milieu de croissance complet. (A) milieu sans sérum à 4x, (B) milieu sans sérum à 20x, (C) milieu de croissance complet à 4x, et (D) milieu de croissance complet à 20x. Barres d’échelle: 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractérisation des BOEC avec CD31 et CD14. (A) Les BOEC du passage 2-3 ont été colorées pour PECAM1 à l’aide d’anticorps anti-CD31-FITC observés en vert et (B) d’images de microscopie à contraste de phase correspondantes. Les cellules ont été colorées en suspension, et la suspension a été imagée sur une lame de microscope. Barres d’échelle : 200 μm. (C) Analyse par cytométrie en flux des BOEC avec anticorps CD14-AF700 par rapport à (D) cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) témoins positifs. Coloration CD14 positive en bleu et cellules non colorées en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.