Article de méthode

Quantification de la distribution subcellulaire du glycogène dans les fibres musculaires squelettiques à l’aide de la microscopie électronique à transmission

DOI :

10.3791/63347

⸱

7 février 2022

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1Research center for applied health science, University College South Denmark, 2Department of Sports Science and Clinical Biomechanics, University of Southern Denmark, 3Department of Biomedical Sciences, Core Facility for Integrated Microscopy, University of Copenhagen

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une procédure de post-fixation modifiée augmente le contraste des particules de glycogène dans les tissus. Cet article fournit un protocole étape par étape décrivant comment manipuler le tissu, effectuer l’imagerie et utiliser des méthodes stéréologiques pour obtenir des données impartiales et quantitatives sur la distribution du glycogène subcellulaire spécifique au type de fibre dans le muscle squelettique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avec l’utilisation de la microscopie électronique à transmission, des images à haute résolution d’échantillons fixes contenant des fibres musculaires individuelles peuvent être obtenues. Cela permet de quantifier les aspects ultrastructuraux tels que les fractions volumiques, les rapports surface/volume, la morphométrie et les sites de contact physique de différentes structures subcellulaires. Dans les années 1970, un protocole pour améliorer la coloration du glycogène dans les cellules a été développé et a ouvert la voie à une série d’études sur la localisation subcellulaire du glycogène et la taille des particules de glycogène à l’aide de la microscopie électronique à transmission. Alors que la plupart des analyses interprètent le glycogène comme s’il était réparti de manière homogène dans les fibres musculaires, ne fournissant qu’une seule valeur (par exemple, une concentration moyenne), la microscopie électronique à transmission a révélé que le glycogène est stocké sous forme de particules de glycogène discrètes situées dans des compartiments subcellulaires distincts. Ici, le protocole étape par étape de la collecte de tissus à la détermination quantitative de la fraction volumique et du diamètre des particules de glycogène dans les compartiments subcellulaires distincts des fibres musculaires squelettiques individuelles est décrit. Considérations sur la façon de 1) prélever et colorer des échantillons de tissus, 2) effectuer des analyses d’images et le traitement des données, 3) évaluer la précision des estimations, 4) discriminer entre les types de fibres musculaires, et 5) les pièges méthodologiques et les limites sont inclus.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les particules de glycogène sont composées de polymères ramifiés de glucose et de diverses protéines associées1 et constituent un carburant important lors de demandes métaboliques élevées2. Bien qu’elles ne soient pas largement reconnues, les particules de glycogène constituent également un carburant local, où certains processus subcellulaires utilisent préférentiellement le glycogène malgré la disponibilité d’autres carburants plus durables comme le glucose plasmatique et les acides gras3,4.

L’importance du stockage du glycogène en tant que combustible localisé spécifique subcellulaire a été discutée dans plusieurs revues5,6 principalement basées sur certaines des premières documentations sur la distribution subcellulaire du glycogène par microscopie électronique à transmission (TEM)7,8. Les premières études ont utilisé différents protocoles pour augmenter le contraste du glycogène des techniques de coloration histochimique aux colorations négatives et positives9,10. Un développement méthodologique important a été le protocole de post-fixation raffiné avec l’osmium réduit en ferrocyanure de potassium11,12,13,14, qui a considérablement amélioré le contraste des particules de glycogène. Ce protocole affiné n’a pas été utilisé dans certains des travaux pionniers sur l’épuisement du glycogène induit par l’exercice15, mais a été réintroduit par Graham et ses collègues16,17.

Sur la base des images en 2 dimensions, la distribution subcellulaire du glycogène est le plus souvent décrite comme des particules de glycogène situées dans trois pools: subsarcolemmal (juste sous la membrane de surface), intermyofibrillaire (entre les myofibrillaires) ou intramyofibrillaire (dans les myofibrillaires). Cependant, les particules de glycogène pourraient également être décrites comme associées, par exemple, au réticulum sarcoplasmique7 ou aux noyaux18. En plus de la distribution subcellulaire, l’avantage de la teneur en glycogène estimée par TEM est également que la quantification peut être effectuée au niveau de la fibre unique. Cela permet d’étudier la variabilité fibre à fibre et d’effectuer des analyses corrélatives avec les types de fibres et les composants cellulaires tels que les mitochondries et les gouttelettes lipidiques.

Ici, le protocole pour le contenu volumétrique spécifique au type de fibre TEM estimé des trois pools subcellulaires communs de glycogène (sous-sarmateux, intermyofibrillaire et intramyofibrillaire) dans les fibres musculaires squelettiques est décrit. La méthode a été appliquée aux muscles squelettiques des humains19, des rats20 et des souris21; ainsi que les oiseaux et les poissons22; et les cardiomyocytes de rats23.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole actuel utilisant des échantillons de muscles squelettiques biopsiés humains a été approuvé par les comités régionaux d’éthique de la recherche en santé pour le sud du Danemark (S-20170198). Les biopsies musculaires ont été obtenues par une incision dans la peau du muscle vastus lateralis à l’aide d’une aiguille Bergström avec aspiration après anesthésie locale (1-3 mL de lidocaïne 2% par incision). Si des muscles entiers isolés de rats ont été utilisés, les animaux ont été sacrifiés par luxation cervicale avant que les biopsies musculaires ne soient obtenues, conformément aux directives du comité d’éthique animale de l’hôpital universitaire d’Odense, au Danemark.

1. Fixation primaire, post-fixation, intégration, sectionnement et contraste

  1. Préparer 1,6 mL de solution fixatrice primaire (2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate de sodium de 0,1 M (pH 7,3)) dans un tube de microcentrifugation de 2 mL. Conservez-le à 5 °C pendant 14 jours maximum.
  2. À partir de la biopsie musculaire ou du muscle entier, isolez un petit échantillon, qui a un diamètre maximal de 1 mm dans n’importe quelle direction et est un peu plus long dans le sens longitudinal de la fibre que transversalement (à des fins d’orientation).
  3. Placer l’échantillon dans le tube contenant la solution de fixation primaire froide. Conserver à 5 °C pendant 24 h.
  4. Laver l’échantillon quatre fois (15 min entre chaque lavage) dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M (pH 7,3). À l’aide de pipettes de transfert, retirez le tampon utilisé du tube en laissant l’échantillon intact, puis ajoutez le tampon frais.
    REMARQUE : Après le lavage final, l’échantillon peut être conservé dans le tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M à 5 °C pendant plusieurs mois11. Le protocole peut être mis en pause ici.
  5. Postfix avec 1 % de tétroxyde d’osmium (OsO4) et 1,5 % de ferrocyanure de potassium (K4Fe(CN)6) dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,1 M (pH 7,3) pendant 120 min à 4 °C.
    REMARQUE: L’utilisation de ferrocyanure de potassium à 1,5% (K4Fe (CN)6) est essentielle pour un contraste optimal des particules de glycogène11,12,13.
  6. Rincer deux fois à l’eau double distillée à température ambiante (RT).
  7. Déshydrater en s’immergeant dans une série graduée d’alcool (éthanol) à RT en utilisant les concentrations suivantes : 70 % (10 min), 70 % (10 min), 95 % (10 min), 100 % (10 min) et 100 % (10 min).
    REMARQUE: À chaque étape, l’échantillon est immergé dans de l’éthanol, qui n’est ensuite que partiellement retiré pour éviter le séchage de l’échantillon. Enfin, les restes d’éthanol sont jetés.
  8. Infiltrer avec des mélanges gradués d’oxyde de propylène et de résine eposidique à RT en utilisant les rapports de volume suivants (oxyde de propylène/résine épsidique) : 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (nuit). Le lendemain, incorporer les spécimens dans de la résine épsidique 100% fraîche dans des moules et polymériser à 60 °C pendant 48 h.
    REMARQUE: Cette méthode graduée est conforme aux protocoles précédents11,12. Le protocole peut être mis en pause ici.
  9. Coupez des sections ultra-minces (60-70 nm) de fibres orientées longitudinalement et collectez-les sur des grilles de cuivre à un trou comme suit.
    1. Montez le bloc d’un spécimen sur le support ultramicrotome.
    2. Coupez le bloc à la surface avec une lame de rasoir afin d’atteindre le niveau du tissu.
    3. Montez un couteau diamanté (ultracut 45) devant l’échantillon et alignez la surface de l’échantillon parallèlement au couteau.
    4. Produire une section semi-mince (1 μm) avec le couteau à diamant pour vérifier l’orientation de l’échantillon. Tacher la section semi-mince avec du bleu de toluidine pour l’observation en microscopie optique.
    5. Coupez davantage le bloc pour réduire la zone d’intérêt afin d’obtenir des sections ultraminces appropriées.
    6. Taille de sections ultraminces (60-70 nm) avec un deuxième couteau diamanté (ultracoupé 45).
    7. Collectez 1 à 2 sections sur des grilles de cuivre à un trou à l’aide d’une boucle parfaite.
      REMARQUE: La grille de cuivre à un trou a un seul trou au milieu avec une membrane de support Formvar.
  10. Contrastez les sections avec l’acétate d’uranyle et le citrate de plomb en immergeant les grilles ci-dessus dans une solution d’acétate d’uranyle (0,5% dans de l’eau double distillée) pendant 20 min, puis dans une solution de citrate de plomb (1% dans de l’eau double distillée) pendant 15 min. Lavez les grilles dans de l’eau double distillée entre et après les deux taches.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Imagerie

  1. Allumez le microscope électronique à transmission (fonctionnant à une tension d’accélération de 80 kV), l’ordinateur et le logiciel d’enregistrement d’images. Enregistrez des images numériques avec une caméra CCD numérique à balayage lent 2 k x 2 k et le logiciel d’imagerie associé.
  2. Insérez la grille avec plusieurs sections dans l’étape du microscope.
  3. Filtrer la grille initialement à faible grossissement (p. ex., x100) pour déterminer la qualité des sections (c.-à-d. trous dans la membrane de support, débris, etc.) et choisir les sections de la meilleure qualité. À faible grossissement, déterminez la direction des fibres musculaires.
  4. Ensuite, augmentez le grossissement avec le faisceau centré sur une fibre périphérique dans la section. Focalisez l’image à un grossissement supérieur à 30 k pour garantir suffisamment de détails fins dans l’image, guidés par une transformation de Fourier rapide en temps réel, si disponible. Enfin, enregistrez des images avec un temps d’exposition de 1 s au grossissement souhaité.
  5. Acquérir un total de 24 images d’une fibre sélectionnée au hasard, soit 12 images de l’espace myofibrillaire et 12 images de l’espace sous-sarmatel, à un grossissement compris entre 10 k et 40 k. Assurez-vous que les images sont réparties sur la longueur et la largeur de la fibre dans un ordre aléatoire mais systématique pour obtenir des résultats non biaisés (Figure 1A).
    REMARQUE: Le grossissement optimal dépend de la résolution de la caméra disponible et de la taille des micrographies. L’objectif est d’atteindre une résolution finale, où les diamètres des particules de glycogène peuvent être mesurés par paliers de 1 nm, et d’inclure une surface totale de la région myofibrillaire d’au moins 70 μm2 et une longueur totale de la fibre d’au moins 25 μm répartie en 12 images de l’espace myofibrillaire et 12 images de l’espace sous-mastomatmateux par fibre, respectivement. Les 24 images par fibre donneront très probablement une précision (coefficient d’erreur) du contenu volumétrique des différents pools de glycogène entre 0,1 et 0,2 dans les fibres individuelles des muscles squelettiques humains, rat et souris20,21,24 (Figure 2E).
  6. Répétez les étapes 2.4 et 2.5 jusqu’à ce qu’un total de 6 à 10 fibres soient imagées. Si nécessaire, coupez des sections supplémentaires (séparées d’au moins 150 μm pour éviter le chevauchement de fibres déjà imagées) et répétez les étapes 1.9-2.5.

3. Analyses d’images

  1. Importez des images dans ImageJ en cliquant sur Fichier > Ouvrir.
  2. Définissez l’échelle globale pour qu’elle corresponde à la taille d’origine de l’image en cliquant sur Analyser > Définir l’échelle.
  3. Zoomez à 100% en cliquant sur Image > Zoom > In.
  4. Mesurez l’épaisseur d’un disque Z par image de l’espace myofibrillaire (12 par fibre) à l’aide de l’outil Ligne droite du menu Outils (Figure 1D). Calculez l’épaisseur moyenne du disque Z de chacune des 6 à 10 fibres.
  5. Définissez 2-3 fibres avec le disque Z moyen le plus épais comme fibres de type 1 et 2-3 fibres avec le disque Z moyen le plus mince comme fibres de type 2. Ne tenez pas compte des fibres intermédiaires 2-4 pour d’autres analyses (Figure 1E).
    REMARQUE: Les étapes suivantes sont répétées pour chacune des 4-6 fibres de l’échantillon. Les fractions volumiques de glycogène sont estimées par comptage ponctuel comme décrit ailleurs25,26. La taille des grilles est choisie pour obtenir une précision satisfaisante des estimations. Ceci est souvent obtenu en atteignant 250 hits, ce qui dicte ensuite le nombre total de points nécessaires et, à son tour, la surface par point.
  6. Utilisez l’outil Ligne segmentée pour mesurer la longueur de la myofibrille la plus externe visible juste en dessous de la région sous-sarmate (Figure 2A).
    REMARQUE: Cette longueur est utilisée pour exprimer le glycogène sous-sarmateux par surface (c.-à-d. longueur de la myofibrille la plus externe multipliée par l’épaisseur de la section (60 nm); voir l’étape 4.5). Par conséquent, seule la région sous-sarmate, représentée par cette longueur, est incluse dans l’analyse.
  7. Insérez une grille en cliquant sur Outils d’analyse > > Grille et définissez la zone par point à 32 400 nm2. Comptez le nombre de résultats dans la longueur disponible dans les 12 images sous-sarmateuses, où un croisement frappe le glycogène sous-sarmateux (Figure 2A). Un hit est défini comme une particule de glycogène présente dans le coin supérieur droit d’une croix.
  8. Insérez une grille en cliquant sur Outils d’analyse > > Grille et définissez la surface par point à 160 000 nm2. Comptez le nombre de frappes dans les 12 images myofibrillaires, où une croix frappe l’espace intramyofibrillaire (Figure 2B).
  9. Insérez une grille en cliquant sur Outils d’analyse > > Grille et définissez la zone par point à 3 600 nm2. Comptez le nombre de hits dans les 12 images myofibrillaires, où un croisement frappe le glycogène intramyofibrillaire (Figure 2C).
  10. Insérez une grille en cliquant sur Outils d’analyse > > Grille et définissez la surface par point à 32 400 nm2. Comptez le nombre de coups dans les 12 images myofibrillaires, où un croisement frappe le glycogène intermyofibrillaire (Figure 2D).
  11. À l’aide de l’outil Ligne droite , mesurez le diamètre de cinq particules de glycogène choisies au hasard de chaque pool pour chacune des 12 images afin d’obtenir une moyenne de 60 particules par pool et par fibre.
    REMARQUE: La moyenne de 60 particules couvre en grande partie la variation à l’intérieur de la fibre (Figure 2F).

4. Calculs

  1. Calculer la fraction d’aire apparente (AA) de l’espace intramyofibrillaire par espace myofibrillaire comme la somme de tous les résultats divisés par la somme de tous les points des 12 images (à partir de l’étape 3.8).
  2. Calculez la fraction apparente de glycogène intramyofibrillaire par zone myofibrillaire, de glycogène intermyofibrillaire par zone myofibrillaire et de glycogène sous-narcomateux par zone d’image comme la somme de tous les résultats divisés par la somme de tous les points des 12 images (des étapes 3.7, 3.9 et 3.10).
  3. Calculer la fraction volumique (VV) du glycogène intramyofibrillaire, intermyofibrillaire et sous-sarmatelique, respectivement, comme la fraction d’aire apparente (AA) moins le produit de la densité de surface (SV) avec l’épaisseur de section (t), où la densité de surface est la densité numérique des particules multipliée par la surface moyenne des particules:
    Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
    où
    Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
    t = 0,06 μm
    H = diamètre moyen des particules (μm)
    REMARQUE: La fraction volumique est plus petite que la fraction de surface apparente en raison de la contribution des bouchons des particules dont le centre se trouve à l’extérieur de la tranche25.
  4. Pour exprimer le glycogène intramyofibrillaire par espace intramyofibrillaire, divisez la fraction d’aire du glycogène intramyofibrillaire (étape 4.2) par la fraction d’aire de l’espace intramyofibrillaire (étape 4.1). Le glycogène intermyofibrillaire est exprimé par espace myofibrillaire tel que calculé à l’étape précédente (étape 4.3).
  5. Pour exprimer le glycogène sous-sarmatel par surface de la fibre (VS) (myofibrille la plus externe), convertir la fraction volumique du glycogène en une quantité absolue en multipliant par le volume de l’image (produit de l’épaisseur de la surface et de la section) et en divisant par le produit de la longueur moyenne disponible (à partir de l’étape 3.6) avec l’épaisseur de la section (t).
  6. Estimer la teneur volumétrique totale en glycogène à l’aide des valeurs des étapes 4.1, 4.4 et 4.5, comme suit :
    Glycogène myofibrillaire = Glycogène intermyofibrillaire + (glycogène intramyofibrillaire · fraction d’aire de l’espace intramyofibrillaire)
    En supposant un rayon de fibre moyen de 40 μm27, le rapport volume/surface est de 20:1, de sorte que le glycogène total est:
    Glycogène total (VV) = Glycogène myofibrillaire + (glycogène sous-sarmateux (VS) / 20)
    REMARQUE: Le rapport volume / surface de 20: 1 peut varier d’une fibre à l’autre en fonction de la taille réelle de la fibre et de la taille de la région sous-sarmate. Cela n’est pas pris en compte dans le présent protocole.
  7. À partir de là, la contribution relative de chaque pool est calculée en fractions de glycogène total:
    Glycogène intermyofibrillaire / Glycogène total = Glycogène intermyofibrillaire / Glycogène total
    Glycogène intramyofibrillaire / Glycogène total = (Glycogène intramyofibrillaire · fraction d’aire de l’espace intramyofibrillaire) / Glycogène total
    Glycogène sous-sarmateux / Glycogène total = Glycogène sous-sarmolmal / 20 / Glycogène total
  8. Pour chaque pool de glycogène, calculez le coefficient d’erreur (CE), qui exprime l’incertitude de l’estimation du glycogène au niveau de la fibre, en fonction du nombre d’images (n), du nombre total de croisements dans chaque image (x) et du nombre de croisements frappant le glycogène dans le pool pertinent dans chaque image (y) comme suit28:
    CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑y-1

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En utilisant ce protocole, les particules de glycogène apparaissent noires et distinctes (figures 1 et figure 2). Les valeurs normales du glycogène sont représentées à la figure 3. Ces données sont basées sur un total de 362 fibres provenant de 41 jeunes hommes en bonne santé recueillies dans différentes études antérieures19,24,29,30,31.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étape critique de la méthode est l’utilisation d’osmium réduit par le ferrocyanure de potassium pendant la post-fixation. La sélectivité de ce fixateur modifié pour la détection du glycogène ne peut pas être entièrement expliquée par la chimie, mais comprend également des résultats expérimentaux démontrant qu’aucune détection de telles particules dans des tissus connus pour être exempts de glycogène ou dans l’espace extracellulaire11.

Les paramètres critiques sont la ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le Comité olympique suédois.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Oxyde de 1,2-propylèneMerck75-56-9
Embedding 812 résine medium kitTaabT031
Solution de glutaraldéhyde 25 %Merck1.04239.0250
ITEMLogiciel d’imagerieOlympus
Leica EM AC20LeicaSystème de contraste automatique
OSIS Veleta appareil photo numériqueOlympus
Tétroxyde d’osmium 4 % solutionPolysciences0972A
Philips CM 100 Transmission EMPhilips
Hexacyanoferrate de potassium (II) trihydratéSigma-Aldrich455989-245G
Cacodylatbuffer sodique 0,2 M ph 7,4Ampliqon.comAMPQ40989.0500
Ultra-microtome Leica UC7Leica
Ultrostain citrate de plomb 3 %, solution stabiliséeLeica16707235
acétate d’uranyle dihydratéPolysciences6159-44-0

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Coloration du glycog netypes de fibres musculairesanalyse d imagestaille des particules de glycog nequantification ultrastructuralecompartiments subcellulaires

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