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Technique quantitative de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris

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DOI :

10.3791/63358

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17 novembre 2023

 , 
1Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, 3Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

Dans cet article

Résumé

Les microtubules, qui sont des polymères de tubuline, jouent un rôle crucial en tant que composant du cytosquelette des cellules eucaryotes et sont connus pour leur instabilité dynamique. Cette étude a mis au point une méthode de fractionnement des microtubules pour les séparer en microtubules stables, microtubules labiles et tubuline libre afin d’évaluer la stabilité des microtubules dans divers tissus de souris.

Résumé

Les microtubules, composés de dimères de α/β-tubuline, sont un composant crucial du cytosquelette des cellules eucaryotes. Ces polymères tubulaires présentent une instabilité dynamique lorsque les sous-unités hétérodimères de tubuline subissent une polymérisation et une dépolymérisation répétitives. Un contrôle précis de la stabilité et de la dynamique des microtubules, obtenu grâce à des modifications post-traductionnelles de la tubuline et à des protéines associées aux microtubules, est essentiel pour diverses fonctions cellulaires. Les dysfonctionnements des microtubules sont fortement impliqués dans la pathogenèse, y compris les troubles neurodégénératifs. Les recherches en cours se concentrent sur les agents thérapeutiques ciblant les microtubules qui modulent la stabilité, offrant des options de traitement potentielles pour ces maladies et cancers. Par conséquent, la compréhension de l’état dynamique des microtubules est cruciale pour évaluer la progression de la maladie et les effets thérapeutiques.

Traditionnellement, la dynamique des microtubules a été évaluée in vitro ou dans des cellules en culture par fractionnement approximatif ou immunoessai, à l’aide d’anticorps ciblant les modifications post-traductionnelles de la tubuline. Cependant, l’analyse précise du statut de la tubuline dans les tissus à l’aide de telles procédures pose des défis. Dans cette étude, nous avons développé une méthode simple et innovante de fractionnement des microtubules pour séparer les microtubules stables, les microtubules labiles et la tubuline libre dans les tissus de souris.

La procédure a consisté à homogénéiser des tissus de souris disséqués dans un tampon stabilisateur de microtubules à un rapport de volume de 19 :1. Les homogénats ont ensuite été fractionnés par un processus d’ultracentrifugation en deux étapes après une centrifugation lente initiale (2 400 × g) pour éliminer les débris. La première étape d’ultracentrifugation (100 000 × g) a précipité les microtubules stables, tandis que le surnageant résultant a été soumis à une deuxième étape d’ultracentrifugation (500 000 × g) pour fractionner les microtubules labiles et les dimères de tubuline solubles. Cette méthode a permis de déterminer les proportions de tubuline constituant des microtubules stables ou labiles dans le cerveau de la souris. De plus, des variations tissulaires distinctes dans la stabilité des microtubules ont été observées qui étaient corrélées avec la capacité proliférative des cellules constitutives. Ces résultats mettent en évidence le potentiel important de cette nouvelle méthode pour l’analyse de la stabilité des microtubules dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Introduction

Les microtubules (MT) sont des structures tubulaires allongées comprenant des protofilaments constitués de sous-unités hétérodimères α/β-tubuline. Ils jouent un rôle essentiel dans divers processus cellulaires tels que la division cellulaire, la motilité, le maintien de la forme et le transport intracellulaire, ce qui en fait des composants intégraux du cytosquelette eucaryote1. L’extrémité négative des MT, où la sous-unité α-tubuline est exposée, est relativement stable, tandis que l’extrémité positive, où la sous-unité β-tubuline est exposée, subit une dépolymérisation dynamique et une polymérisation2. Ce cycle continu d’ajout et de dissociation des dimères de tubuline à l’extrémité positive, appelé instabilité dynamique, entraîne un processus répétitif de sauvetage et de catastrophe3. Les MT présentent des domaines focaux avec des variations localisées de l’instabilité dynamique, y compris des domaines stables et labiles4.

Un contrôle précis de l’instabilité dynamique des MT est crucial pour de nombreuses fonctions cellulaires, en particulier dans les neurones caractérisés par des morphologies complexes. L’adaptabilité et la durabilité des MT jouent un rôle essentiel dans le développement et le bon fonctionnement des cellules nerveuses 5,6,7. L’instabilité dynamique des MT s’est avérée être associée à diverses modifications post-traductionnelles (PTM) de la tubuline, telles que l’acétylation, la phosphorylation, la palmitoylation, la détyrosination, le delta 2, l’oxydation de la polyglutamine et la polyglycylation. De plus, la liaison des protéines associées aux microtubules (MAP) sert de mécanisme de régulation8. Les PTM, à l’exclusion de l’acétylation, se produisent principalement dans la région carboxy-terminale de la tubuline située sur la surface externe des MT. Ces modifications créent des conditions de surface diverses sur les MT, influençant leur interaction avec les MAP et, en fin de compte, régissant la stabilité des MT9. La présence d’un résidu de tyrosine carboxy-terminale dans la α-tubuline est révélatrice de MT dynamiques, qui sont rapidement remplacées par le pool de tubuline libre. À l’inverse, la détyrosination de l’extrémité carboxy et l’acétylation de Lys40 signifient des MT stables avec une instabilité dynamique réduite 9,10.

Les PTM de la tubuline ont été largement utilisés dans des expériences visant à évaluer la dynamique et la stabilité des MT 5,7,11,12,13,14,15. Par exemple, dans les études de culture cellulaire, les tubulines peuvent être séparées en deux pools : le pool de tubulines libres et le pool MT. Ceci est réalisé en libérant de la tubuline libre par perméabilisation cellulaire avant de fixer les MT restantes 15,16,17,18,19. Les méthodes biochimiques impliquent l’utilisation de stabilisateurs chimiques de MT qui protègent les MT d’une catastrophe, permettant la séparation des MT et de la tubuline libre par centrifugation20,21,22. Cependant, ces procédures ne font pas la différence entre les MT stables et moins stables (labiles), ce qui rend impossible la quantification des MT ou de la tubuline soluble dans des tissus comme le cerveau. Par conséquent, l’évaluation de la stabilité de la TA chez les organismes dans des conditions physiologiques et pathologiques s’est avérée difficile. Pour remédier à cette limite expérimentale, nous avons mis au point une nouvelle technique permettant de séparer avec précision les MT et la tubuline libre dans les tissus de souris23.

Cette méthode unique de fractionnement de la magnétoscopie implique l’homogénéisation des tissus dans des conditions qui maintiennent le statut de la tubuline dans les tissus et la centrifugation en deux étapes pour séparer les MT stables, les MT labiles et la tubuline libre. Cette procédure simple peut être appliquée à de vastes études, y compris la recherche fondamentale sur les MT et les MAP dans les organismes vivants, les analyses physiologiques et pathologiques de la santé et des maladies associées à la stabilité des MT, et le développement de médicaments et d’autres thérapies qui ciblent les MT.

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Protocole

1. Méthode de fractionnement MT

REMARQUE : Toutes les expériences réalisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université Doshisha. Des souris C57BL/6J des deux sexes, âgées de 3 à 4 mois, ont été utilisées ici. Dans ce protocole, les tissus disséqués, par exemple le cerveau, le foie ou le thymus, ont été immédiatement homogénéisés dans un tampon stabilisateur de microtubules (MSB) glacé, qui contenait du Taxol (stabilisateur MT) à une concentration qui empêchait non seulement la dépolymérisation, mais aussi la repolymérisation de la MT. L’homogénat a été séparé en trois fractions par un procédé d’ultracentrifugation en deux étapes (Figure 1). Toutes les étapes de ce protocole ont été réalisées sans interruption dans un environnement à température fraîche, et les tissus et les fractions n’ont pas été congelés jusqu’à ce qu’ils soient dissous dans un tampon d’échantillon de dodécylsulfate de sodium (SDS).

  1. Préparation de MSB et de microtubes
    1. Pour préparer le MSB, mélanger les réactifs suivants : 0,1 M d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES), pH 6,8 (neutralisé par KOH), 10 % de glycérol, 0,1 mM de DTT, 1 mM de MgSO 4, 1 mM d’EGTA, 0,5 % de Triton X-100, inhibiteurs de la phosphatase (1 mM de NaF, 1 mM de β-glycérophosphate, 1 mM de Na3VO 4, 0,5 μM d’acide okadaïque), 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase, et les inhibiteurs de la protéase (0,1 mM de PMSF, 0,1 mM de DIFP, 1 μg/mL de pepstatine, 1 μg/mL d’antidouleur, 10 μg/mL d’aprotinine, 10 μg/mL de leupeptine, 50 μg/mL de TLCK) (voir le tableau des matériaux) et désignés par MSB(-).
    2. Juste avant la dissection tissulaire, ajouter 10 μM de Taxol et 2 mM de GTP (voir le tableau des matériaux) à la MSB(-). Ce tampon est désigné MSB(+). Préparez le tampon le jour de l’utilisation et conservez-le sur de la glace.
    3. Préparez les microtubes pour l’échantillonnage. Microtube vide de 2,0 ml pour le stockage de l’homogénat ; microtube vide de 1,5 mL pour le lysat de surnageant1 (S1), l’échantillon de précipité2 (P2) et l’entreposage de l’échantillon de précipité3 (P3) ; Microtube de 1,5 mL avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée pour le stockage des tissus disséqués ; Microtube de 1,5 mL avec 200 μL de tampon d’échantillon SDS 2x (0,16 M Tris pH 6,8 ; glycérol 20 % ; 2-mercaptoéthanol 2 % ; 4 % SDS) pour le stockage de l’échantillon S1 et du surnageant3 (S3) ; et microtube de centrifugation pour rotors de centrifugation TLA55 et TLA120.2 (voir tableau des matériaux). Étiquetez tous les tubes et placez-les sur de la glace.
  2. Homogénéisation des tissus de souris
    1. Préparez une table réfrigérée pour la dissection des tissus. Tout d’abord, remplissez une boîte de glace pilée et placez deux boîtes de Pétri sur de la glace, l’une avec le côté intérieur vers le haut et l’autre avec le côté extérieur. Remplissez du PBS glacé dans un plat pour le lavage et le stockage transitoires des tissus disséqués. Posez du papier filtre imbibé de PBS sur un autre plat retourné.
    2. Pour sacrifier une souris, effectuez une luxation cervicale sous anesthésie profonde avec un anesthésique mixte de butorphanol, de midazolam et de médétomidine. Ensuite, disséquez immédiatement les tissus, par exemple le cerveau, le foie ou le thymus, et lavez-les avec du PBS glacé dans une boîte de Pétri.
      REMARQUE : Tout type de tissu mou peut être analysé par cette méthode. Cependant, la taille du tissu est limitée par la plage de volume recommandée de l’homogénéisateur utilisé. Par exemple, si un volume de 2 ml d’homogénéisateur est utilisé, 50 à 100 mg de tissu sont recommandés.
    3. Après avoir pesé les microtubes de 1,5 ml remplis de PBS pour le stockage des tissus disséqués, découpez et stockez les tissus à l’intérieur des microtubes, et pesez à nouveau chaque microtube. Le poids humide de chaque tissu peut être calculé en soustrayant le poids du tube avant et après l’ajout du tissu.
    4. Homogénéiser immédiatement le tissu dans un MSB(+) glacé à l’aide d’un homogénéisateur réfrigéré (voir le tableau des matériaux). Le volume de MSB(+) était 19 fois (μL) le poids humide des tissus (mg). Effectuez l’homogénéisation avec 20 coups jusqu’à ce que les morceaux de tissu disparaissent.
      REMARQUE : Par exemple, 1 900 μL de MSB(+) sont utilisés pour 100 mg de tissu. Étant donné que le volume de MSB(+) à ajouter doit être ajusté pour chaque poids humide des morceaux de tissu analysés, il est nécessaire de peser chaque morceau de tissu avec précision.
  3. Centrifugation des homogénats de tissus de souris
    1. Déplacer l’homogénat entier dans un microtube de 2 mL à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une centrifugeuse à 2 400 × g pendant 3 min à 2 °C pour éliminer les débris par précipitation.
    2. Transférez le surnageant entier (fraction S1) dans un nouveau microtube de 1,5 mL et un vortex. Ensuite, aliquotez 200 μL de fraction S1 dans un microtube de centrifugation et centrifugez à 100 000 × g à l’aide d’un rotor TLA-55 pendant 20 min à 2 °C pour obtenir les protéines de poids moléculaire relativement important sous forme de précipité (fraction P2).
      REMARQUE : Le volume de l’échantillon soumis aux étapes d’ultracentrifugation affecte le rayon de centrifugation et l’efficacité de précipitation des molécules. Maintenez le volume de l’échantillon à 200 μL ou moins après cette étape pour éviter un fractionnement inexact.
    3. Centrifuger ensuite tout le surnageant résultant (fraction S2) à 500 000 × g à l’aide d’un rotor TLA-120.2 pendant 60 min à 2 °C pour séparer les complexes protéiques insolubles dans le précipité (fraction P3) des protéines solubles dans le surnageant (fraction S3).
    4. Ajouter 400 μL de tampon d’échantillon 1x SDS (0,08 M Tris pH 6,8 ; 10 % de glycérol ; 1 % de 2-mercaptoéthanol ; 2 % SDS) dans les tubes de fraction P2 et P3 et soniser brièvement pour dissoudre le précipité. Transférez ces échantillons de fraction dans un microtube vide de 1,5 ml.
    5. Dissoudre la fraction S3 totale dans 200 μL de tampon 2x SDS.
    6. Mélangez les fractions S1 restantes avec un volume égal de tampon d’échantillon 2x SDS pour l’utiliser comme courbe standard pour le transfert Western.
    7. Faites bouillir tous ces échantillons à 100 °C pendant 3 min. Une fois les échantillons refroidis à température ambiante, conservez-les à -20 °C.
  4. Quantification des protéines dans chaque fraction
    1. Quantifier les protéines dans les fractions P2, P3 et S3 par Western blot. Tout d’abord, utilisez l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS à 10 % (SDS-PAGE) pour séparer les protéines des fractions P2, P3 et S3 correctement diluées et de l’échantillon S1 dilué en série de n’importe quel individu comme courbe standard. Ensuite, vaporisez les échantillons sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (voir le tableau des matériaux).
      NOTE : Le taux de dilution de chaque fraction dépend de la concentration d’une protéine objective et de la réactivité de l’anticorps. (p. ex., α-tubuline, TUBB3, β-tub et tubuline tyrosinée dans le tissu cérébral : S3 = 1/400, P3 = 1/2 000, P2 = 1/2 000, S1 = 1/50,000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 ; tubuline acétylée dans le tissu cérébral : S3 = 1/200, P3 = 1/400, P2 = 1/8 000, S1 = 1/100 000, 1/40 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/4 000 ; α-tubuline dans le foie : S3 = 1/20, P3 = 1/100, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 ; α-tubuline dans le thymus : S3 = 1/100, P3 = 1/400, P2 = 1/20, S1 = 1/50 000, 1/20 000, 1/10 000, 1/5 000, 1/2 000 dilution de la concentration tissulaire).
    2. Bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée Tris (50 mM de Tris-HCl pH 7,6 ; 152 mM de NaCl) avec 0,1 % de Tween 20 (TBS-T) pendant plus de 30 min.
    3. Immergez la membrane dans l’anticorps primaire contenant le TBS-T (voir le tableau des matériaux) pendant plus de 2 h. Après cela, lavez la membrane avec TBS-T pendant 3 min (3 fois).
    4. Marquer l’anticorps primaire à l’aide d’anticorps secondaires conjugués HRP (voir le tableau des matériaux) dans le TBS-T pendant plus de 1 h. Après cela, lavez la membrane avec TBS-T pendant 3 min (3 fois).
    5. Développer les membranes avec le réactif de chimiluminescence améliorée. Ensuite, analysez les bandes d’intérêt à l’aide d’un analyseur d’images luminescentes (voir Tableau des matériaux).
    6. Quantifier l’intensité des bandes protéiques à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (voir le tableau des matériaux) et créer une courbe standard en traçant les unités de dilution des échantillons S1 dilués utilisés pour la courbe standard le long de l’axe X et les intensités des bandes le long de l’axe Y.
    7. Lire la concentration en protéines (unité) correspondant aux échantillons de fraction diluée. Multipliez la concentration lue par le facteur de dilution de l’échantillon pour obtenir une unité protéique dans chaque fraction. Divisez l’unité mesurée de chaque fraction par l’unité protéique totale (P2 + P3 + S3) pour obtenir un pourcentage.

2. Évaluation des propriétés de la tubuline dans chaque fraction

REMARQUE : Cette méthode biochimique fournit trois groupes de complexes de tubuline définis par des propriétés de sédimentation. Ici, le statut des complexes de tubuline obtenus dans ces fractions a été identifié en fonction de la taille du complexe et des tubulines-PTM. Effectuez toutes les étapes de ce protocole sans interruption dans un environnement à température fraîche, mais ne congelez pas les échantillons de fraction jusqu’à ce qu’ils soient dissous dans le tampon d’échantillon SDS.

  1. Dosage du piège à filtre
    1. Filtrer les fractions S2 et S3 (500 μL chacune) à l’aide d’une colonne de centrifugation d’ultrafiltration de 300 kDa (voir Tableau des matériaux). Effectuer une centrifugation de 14 000 × g à 2 °C jusqu’à ce que l’ensemble du surnageant soit filtré, que les protéines éluées soient recueillies dans des tubes récepteurs et que les protéines piégées restent sur le filtre des tubes réservoirs.
    2. Traduire l’ensemble des filtrats (environ 500 μL) dans les tubes récepteurs en nouveaux microtubes de 1,5 mL et les dissoudre dans 500 μL de tampon d’échantillon SDS 2x.
    3. Solubiliser les résidus sur le filtre des tubes réservoirs dans 1 000 μL de tampon d’échantillon SDS 1x en pipetant et en transférant les échantillons dans un nouveau microtube de 1,5 mL.
    4. Faites bouillir les échantillons à 100 °C pendant 3 min. Une fois les échantillons refroidis à température ambiante, conservez-les à -20 °C.
    5. Analyser les quantités de tubuline par Western blot avec DM1A (anticorps anti-α-tubuline, voir le tableau des matériaux).
  2. Chromatographie d’exclusion de taille
    1. Préparer le tampon porteur (0,1 M MES, pH 6,8 ; 10 % de glycérol ; 1 mM MgSO4 ; 1 mM EGTA ; 0,1 mM DTT) complété par une concentration de 1/10 d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase comme décrit à l’étape 1.1.1. Ensuite, filtrez la solution et stockez-la dans un environnement froid.
    2. Préparer une colonne de chromatographie par filtration sur gel équipée d’un système de chromatographie liquide préparative dans une chambre de chromatographie (voir tableau des matériaux) à 4 °C.
    3. Avant d’injecter des échantillons dans la colonne, faire couler 180 mL du tampon de support pour laver la colonne. Le débit est de 1 mL/min pendant 3 h.
    4. Injecter de la tubuline porcine purifiée disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) comme témoin ou la fraction S3 de cerveaux de souris (500 μL chacun) sur la colonne.
    5. Elute à un débit de 1,0 mL/min avec tampon porteur. Prélever les fractions de 1,5 mL pendant 120 minutes. Surveiller les protéines éluées par absorbance à 280 nm. Maintenez la pression maximale en dessous de 0,3 MPa.
    6. Après avoir vortex les fractions collectées, mélanger 50 μL d’entre elles avec 50 μL de tampon d’échantillon SDS 2x dans un microtube de 1,5 mL. Faites bouillir tous les échantillons à 100 °C pendant 3 min. Une fois les échantillons refroidis à température ambiante, conservez-les à -20 °C.
    7. Analyser les quantités de tubuline par Western blot avec DM1A, anticorps anti-α-tubuline et KMX-1, anticorps anti-β-tubuline (voir le tableau des matériaux).

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Résultats

Quantification de la tubuline dans les fractions P2, P3 et S3 du cerveau de souris par la méthode de fractionnement MT
La tubuline dans les tissus de souris a été séparée en fractions P2, P3 et S3 par la méthode de fractionnement MT et quantifiée par Western blot (Figure 1A). Le précipité de MT qui est resté dans la fraction P2 par ultracentrifugation à 100 000 × g pendant 20 min représentait 34,86 % ± 1,68 % de la tubuline totale dans un cerveau de souris. Le su...

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Discussion

La tâche la plus importante lors de l’étude de l’état de la tubuline dans les tissus d’organismes vivants est d’empêcher la polymérisation ou la dépolymérisation accidentelle de la magnétoscopie pendant la préparation. La stabilité des MT dans les échantillons est affectée par des facteurs tels que la concentration de Taxol dans la MSB, la proportion de quantité tissulaire à tamponner et la température pendant le processus allant du prélèvement des tissus à l’homogénéisation et à la centrifugation. Par conséquent, les co...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à signaler.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par JST, la création de bourses universitaires pour la création d’innovations scientifiques et technologiques (A.HT. ; JPMJFS2145), JST SPRING (A.HT. ; JPMJSP2129), une subvention d’aide pour les boursiers de la JSPS (A.HT ; 23KJ2078), une subvention d’aide à la recherche scientifique (B) JSPS KAKENHI (22H02946 pour la MT), une subvention d’aide à la recherche scientifique dans des domaines innovants intitulée « Brain Protein Aging and Dementia Control » de MEXT (TM ; 26117004), et une bourse de recherche Uehara de la Fondation commémorative d’Uehara (TM ; 202020027). Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
TUBE DE 1,5 ML BOÎTE DE 500Beckman Coulter357448
1A2Sigma-AldrichT9028dilution 1:5 000
Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES)Nacalai Tesque02442-44
300 kDa colonne de spin d’ultrafiltrationAprosciencePT-1013
6-11B1Sigma-AldrichT74511:5 000 dilution
Ä ; KTAprime plusCytiva11001313
anti-souris IgGJackson ImmunoResearch115-035-1461:5 000
dilution antidouleurPeptide Institute Inc.4062
aprotininNacalai Tesque03346-84
Chemi-Lumi One LNacalai Tesque07880-54
Corning système de filtre à videpour bouteilles Corning4307580.22µ ; M 33,2 cmet sup2 ; Membrane nitrocellulosique
DIFPSigma-Aldrich55-91-4  ;
HOMOGÉNÉISATEUR NUMÉRIQUE HK-1AS ONE1-2050-11
DM1ASigma-AldrichT9026dilution 1:5 000
DTTNacalai Tesque14128-46
EGTANacalai Tesque37346-05
FluoroTrans W 3,3 mètres RollPall CorporationBSP0161
glycérolNacalai Tesque17018-25
GTPNacalai Tesque17450-61
MICRO CENTRIFUGEUSE À RAPPORT DE RÉFRIGÉRATION À GRANDE VITESSE KitmanTOMYKITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg colonneCytiva28-9893-35
Logiciel de jauge d’image  ;FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD  ;FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation292-69903
KMX-1MilliporeMAB3408dilution 1:5 000
FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
leupeptinPeptide Institute Inc.43449-62
MgSO4Nacalai Tesque21003-75
Na3VO4Nacalai Tesque32013-92
NaFNacalai Tesque31420-82
acide okadaïqueLC LaboratoriesO-2220  ;
OPTIMA MAX-XPBeckman Coulter393315
pepstatineNacalai Tesque26436-52
PMSFNacalai Tesque27327-81
Tubes à centrifuger en polycarbonate pour TLA120.2Beckman Coulter343778
Cocktail d’inhibiteurs de protéase (cOmplete™ ;, sans EDTA)Roche11873580001
Tubuline purifiée  ;CytosqueletteT240
QSONICA Q55QSonicaQ55
TaxolLC LaboratoriesP-9600
TLA-120.2 rotorBeckman Coulter357656
TLA-55 rotorBeckman Coulter366725
TLCKNacalai Tesque34219-94
Triton X-100Nacalai Tesque12967-45-bêta
 ;-glycérophosphateSigma-AldrichG9422
Analyseur d’images luminescentes LAS-4000 à

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Technique d ultracentrifugationmodifications de la tubulineWestern blotstabilit des microtubulesdynamique du cytosquelette

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