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Article de méthode

Mesure du taux de consommation d’oxygène dans les tranches striatales aiguës de souris adultes

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DOI :

10.3791/63379

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8 juin 2022

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1Department of Neuroscience, Thomas Jefferson University, 2School of Biomedical Engineering, Drexel University, 3Department of Pathology, MitoCare Center, Thomas Jefferson University, 4School of Life Sciences, Peking University

Dans cet article

Résumé

Le taux de consommation d’oxygène (OCR) est un indicateur commun de la fonction mitochondriale et peut être utilisé pour étudier différents modèles de maladie. Nous avons développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur Seahorse XF pour mesurer directement l’OCR dans les tranches striatales aiguës de souris adultes qui est plus pertinente physiologiquement que d’autres méthodes.

Résumé

Les mitochondries jouent un rôle important dans la production cellulaire d’ATP, la régulation des espèces réactives de l’oxygène etle contrôle de la concentration de Ca 2 +. Le dysfonctionnement mitochondrial a été impliqué dans la pathogenèse de multiples maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer. Pour étudier le rôle des mitochondries dans les modèles de ces maladies, nous pouvons mesurer la respiration mitochondriale via le taux de consommation d’oxygène (OCR) comme proxy de la fonction mitochondriale. L’OCR a déjà été mesurée avec succès dans des cultures cellulaires, ainsi que dans des mitochondries isolées. Cependant, ces techniques sont moins pertinentes physiologiquement que la mesure de l’OCR dans les tranches de cerveau aiguës. Pour surmonter cette limitation, les auteurs ont développé une nouvelle méthode utilisant un analyseur Seahorse XF pour mesurer directement l’OCR dans les tranches striatales aiguës de souris adultes. La technique est optimisée en mettant l’accent sur le striatum, une zone du cerveau impliquée dans la MP et la maladie de Huntington. L’analyseur effectue un test de cellules vivantes à l’aide d’une plaque de 24 puits, ce qui permet la mesure cinétique simultanée de 24 échantillons. La méthode utilise des morceaux perforés circulairement de tranches cérébrales striatales comme échantillons. Nous démontrons l’efficacité de cette technique en identifiant une OCR basale inférieure dans des tranches striatales d’un modèle murin de MP. Cette méthode intéressera grandement les chercheurs travaillant dans le domaine de la MP et de la maladie de Huntington.

Introduction

Le dysfonctionnement mitochondrial a été impliqué dans plusieurs maladies neurologiques, y compris la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer 1,2,3. Les modèles tels que les souris et les rats PINK1 knockout (KO) présentent une altération de la fonction mitochondriale 4,5,6,7,8,9,10,11. Les mitochondries isolées du striatum (STR) ou du cerveau entier d’une souris ROSE1 KO âgée présentent des défauts dans le complexe I 7,10,12,13. La mesure directe du taux de consommation d’oxygène (OCR) est l’une des méthodes les plus courantes pour évaluer la fonction mitochondriale puisque l’OCR est couplée à la production d’ATP, la fonction principale des mitochondries14. Par conséquent, la mesure de l’OCR dans des modèles de maladie ou des échantillons / tissus dérivés du patient peut aider à étudier comment le dysfonctionnement mitochondrial conduit à la maladie.

Actuellement, il existe plusieurs façons de mesurer l’OCR mitochondriale, y compris l’électrode Clark et d’autresélectrodes O2, le colorant fluorescent O 2 et l’analyseur de flux extracellulaire 15,16,17,18,19. En avantage, les méthodes à base d’électrodes O2 permettent d’ajouter facilement divers substrats. Cependant, ils sont insuffisants pour mesurer simultanément plusieurs échantillons. Par rapport aux méthodestraditionnelles à base d’électrodes O 2, l’analyseur de flux extracellulaire, un outil couramment utilisé pour l’OCR dans les cultures cellulaires ou les mitochondries purifiées, offre un débit amélioré de 15,18,20. Néanmoins, toutes ces méthodes sont généralement appliquées pour mesurer l’OCR dans des mitochondries isolées ou des cultures cellulaires 6,16,17,19,20,21. L’isolement des mitochondries cause des dommages par inadvertance, et les mitochondries extraites ou les cultures cellulaires sont moins pertinentes physiologiquement que les tranches de cerveau intactes22. Même lorsque les microélectrodes sont utilisées en tranches, elles sont moins sensibles et plus difficiles à utiliser que dans les cellules cultivées23.

Pour relever ces défis, nous avons développé une méthode utilisant l’analyseur de flux extracellulaire XF24, qui permet d’analyser plusieurs paramètres métaboliques à partir de tranches cérébrales striatales aiguës de souris24. Cette technique fournit une quantification directe continue de la respiration mitochondriale via l’OCR. En bref, de petites sections de tranches cérébrales striatales sont placées dans des puits de la plaque d’îlot, et l’analyseur utilise des biocapteurs fluorescents à base d’oxygène et de protons pour mesurer l’OCR et le taux d’acidification extracellulaire, respectivement 17,21,25.

L’une des caractéristiques uniques de l’analyseur est les quatre puits d’injection, qui permettent la mesure continue de l’OCR tout en injectant séquentiellement jusqu’à quatre composés ou réactifs; cela permet de mesurer plusieurs paramètres de respiration cellulaire, tels que l’OCR mitochondriale basale, l’OCR liée à l’ATP et l’OCR mitochondriale maximale. Les composés injectés lors des mesures pour le protocole montrés ici étaient des concentrations de travail de 10 mM de pyruvate dans le puits de la première solution (port A), de 20 μM d’oligomycine dans le puits de la deuxième solution (port B), de 10 μM de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) dans le troisième puits (port C) et de 20 μM d’antimycine A dans le quatrième puits (port D), d’après Fried et al.25. Il convient de noter que ces concentrations étaient des concentrations de travail et que des solutions mères de 10x, 11x, 12x et 13x ont été injectées dans les ports de solution A à D, respectivement. Le but de l’utilisation de chaque solution était le suivant: 1) Le pyruvate était nécessaire car, sans lui, l’ajout de FCCP aurait une réponse OCR diminuée causée par une limitation des substrats disponibles; 2) L’oligomycine inhibe l’ATP synthase et permet de mesurer la respiration liée à l’ATP; 3) FCCP découple l’oxydation de la phosphorylation et permet la mesure de la capacité mitochondriale maximale; 4) L’antimycine A inhibe le complexe III dans la chaîne de transport d’électrons et, par conséquent, permet la mesure de l’OCR non liée aux mitochondries.

La concentration d’oligomycine utilisée a été déterminée pour les raisons suivantes : 1) La dose recommandée d’oligomycine pour la plupart des types de cellules (mitochondries isolées ou cultures cellulaires) est de 1,5 μM. D’après l’expérience, généralement 3x-10x de la dose de cellules dissociées est utilisée pour les expériences de tranches, car il peut y avoir un gradient et la pénétration de la solution dans les tranches prend du temps. Par conséquent, la concentration doit être comprise entre 5 μM et 25 μM. 2) Une concentration de 20 μM a été choisie sur la base de Fried et al.25. Des concentrations plus élevées n’ont pas été essayées en raison de la toxicité non spécifique de l’olélicine. 3) Dans le rapport d’Underwood et al.26, les auteurs ont fait une expérience de titrage pour l’oligomycine et ont constaté que des doses de 6,25, 12,5, 25 et 50 μg / mL entraînaient une inhibition similaire. La concentration plus élevée d’oligomycine (50 μg/mL) n’a pas inhibé davantage, mais a eu une plus grande variance. 4) Dans notre observation, le facteur déterminant semble être la capacité de pénétration de l’olligomycine. Il est difficile pour l’oligomycine de pénétrer dans le tissu, et c’est pourquoi il faut au moins 7 à 8 cycles pour atteindre le plateau, la réponse maximale. Tant qu’il atteint le plateau, l’inhibition est supposée être maximale.

L’un des principaux défis techniques de l’adaptation de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer l’OCR dans les tranches striatales est de prévenir l’hypoxie tissulaire. Comme le tampon n’a pas été oxygéné pendant toute la durée des mesures (environ 4 h), l’hypoxie était un problème central. Cela est particulièrement vrai pour les échantillons de tissus plus épais, où l’oxygène ne peut pas diffuser dans les échantillons. Pour surmonter ce problème, des tranches ont été sectionnées à 150 μm d’épaisseur, de sorte que l’oxygène ambiant puisse pénétrer au milieu des tranches de cerveau. De plus, 4 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) ont été ajoutés au tampon du liquide céphalo-rachidien artificiel préoxygéné (ACSF), ce qui a facilité la détermination de l’OCR maximale, comme suggéré précédemment23. Nous avons examiné si les cellules étaient vivantes. Tout d’abord, Hoechst 33258 (10 μM) et l’iodure de propidium (10 μM) ont été utilisés pour examiner si les cellules étaient saines dans ces conditions. Nous avons ensuite examiné si les neurones épineux moyens étaient fonctionnellement sains à l’aide de l’enregistrement patch-clamp. Nous avons ensuite évalué si les terminaux dopaminergiques (DA) dans les tranches striatales étaient fonctionnellement sains en mesurant la libération de DA à l’aide de la voltampérométrie à balayage rapide. Les résultats ont montré que les tranches striatales qui n’étaient pas oxygénées (groupe ACSF/BSA) étaient aussi saines que le groupe témoinoxygéné 24.

Nous avons ensuite testé différentes combinaisons d’épaisseur de tranche et de taille de poinçon pour déterminer les conditions optimales de la tranche striatale pour le test de respiration de flux. Des tranches striatales dorsales de différentes épaisseurs (150 μm et 200 μm) et de différentes tailles de poinçonnage (1,0 mm, 1,5 mm et 2,0 mm de diamètre) ont été utilisées pour l’analyse OCR à l’aide de l’analyseur. Les tranches striatales de 150 μm d’épaisseur avec une taille de poinçon de 1,5 mm de diamètre avaient l’efficacité de couplage la plus élevée et des OCR dans une plage optimale pour l’analyseur24.

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Protocole

Toutes les procédures, y compris le travail sur les animaux, ont été menées conformément aux directives nationales et internationales et ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Thomas Jefferson. Des souris mâles FVB/NTac âgées de 3 à 14 mois ont été utilisées. Les étapes suivantes ont été effectuées dans un environnement non stérile, mais il faut faire preuve de prudence pour que tout reste aussi propre que possible.

REMARQUE: La méthode présentée ici a été établie et utilisée dans la recherche rapportée par Zhi et al.24. Les expériences décrites ici utilisaient un analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF24 (voir tableau des matériaux). Ces méthodes peuvent être adaptées à l’analyseur XFe24, et certains résultats ont été confirmés à l’aide de cet analyseur.

1. Capteurs à cartouche hydratée (1 jour avant le test)

  1. Ouvrez le kit de dosage du flux extracellulaire (voir tableau des matériaux) et retirez à la fois la cartouche du capteur (verte) et la plaque d’utilité (claire; Figure 1A). Placez la cartouche du capteur de côté (capteurs vers le haut) et ne touchez pas les capteurs.
  2. Ajouter 600 μL de solution d’étriquant (pH 7,4) à chaque puits de la plaque utilitaire. Placez la cartouche de capteur sur le dessus de la plaque utilitaire et immergez les capteurs dans la solution d’étalonnage. Assurez-vous que l’encoche triangulaire de l’utilitaire et la plaque de la cartouche du capteur sont correctement alignées (Figure 1B).
  3. Scellez le kit de dosage de flux extracellulaire avec un film d’étanchéité pour éviter l’évaporation de la solution d’étriquant, puis placez-le dans un incubateur à 37 °C non complété par du CO2 ou de l’oxygène pendant la nuit.

2. Préparer la plaque de tissu (le jour de l’essai)

  1. Ouvrez la microplaque de capture des îlots et retirez la plaque des îlots pour la présence de tissus.
  2. Réchauffer un volume approprié (625 μL par puits) de liquide céphalo-rachidien artificiel modifié préoxygéné (ACSF, composition 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM de glucose, 10 mM HEPES, pH 7,2) tampon à 37 °C dans un tube de 50 mL. Ajouter ensuite le BSA à une concentration finale de 4 mg/mL pour préparer le tampon respiratoire. En général, 50 mL suffisent pour une plaque.
  3. Ajouter 625 μL de tampon respiratoire (tampon ACSF pré-oxygéné avec 25 mM de glucose et 4 mg/mL de BSA) à chaque puits de la plaque istolaire soigneusement et éviter de secouer la plaque. Assurez-vous qu’aucune goutte résiduelle n’est sur le dessus de la cartouche du capteur et qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le tampon de chaque puits.

3. Préparation aiguë de tranches striatales et placement de tranches excisées

  1. Décapiter la souris après luxation cervicale et disséquer immédiatement le cerveau dans 10 mL de solution de coupe pré-oxygénée glacée (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM de glucose, pH 7,4).
  2. Section tranches striatales coronales avec un vibratome suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux) à une épaisseur de 150 μm dans une solution de coupe pré-oxygénée glacée.
  3. Récupérer les tranches dans 50 mL d’ACSF oxygéné (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM de glucose, 2 mM HEPES, pH 7,4) et conserver en solution jusqu’à 30 min à température ambiante (RT).
  4. Après récupération, transférer les tranches dans une boîte de Petri de 35 mm x 10 mm avec 5 mL de tampon respiratoire.
  5. Utilisez un poinçon de biopsie en acier inoxydable (p. ex., 1,5 mm de diamètre) pour créer un morceau de tissu circulaire dans la zone souhaitée du cerveau tranché. Gardez la tranche dans le tampon tout en appuyant doucement avec le poinçon. Assurez-vous que le poinçon est poussé assez fort pour couper le tissu. Retirez le reste du tissu, soulevez le poinçon et retirez le morceau de tissu circulaire dans le tampon.
  6. Coupez l’extrémité même d’une pointe de pipette de 1 mL pour faire un trou d’un diamètre de 1,5 à 2,0 mm et utilisez-la pour maintenir et transférer la tranche perforée vers le haut de l’écran de capture. Aspirez un morceau de tissu cérébral perforé et placez-le soigneusement sur le côté maillé de l’écran de capture (Figure 2A). L’écran de capture sera un morceau de plastique circulaire avec le maillage attaché d’un côté.
    REMARQUE: Les écrans de capture sont inclus dans l’emballage de microplaques (voir tableau des matériaux) et sont similaires à celui utilisé dans Schuh et al.23.
  7. Utilisez doucement un mouchoir en papier pour sécher brièvement l’écran de capture. Une fois l’humidité éliminée, le tissu devient collant, ce qui permet à la tranche de s’attacher au centre de la maille. Ne séchez pas trop la tranche car, sinon, elle sera endommagée.
  8. Maintenez la tranche d’écran de capture vers le bas avec une pince à épiler et placez-la dans l’un des puits de la plaque d’îlot en incubation (Figure 2B). Veillez à ne pas laisser tomber la tranche; si c’est le cas, retirez l’écran et placez-y une nouvelle tranche.
    REMARQUE: Ne placez pas de tranches de cerveau dans les deux puits de correction de fond (A1 et D6) dans la plaque des îlots.
  9. Incuber la plaque d’îlots à 37 °C dans un incubateur pendant au moins 30 min pour permettre l’équilibrage de la température et du pH avant d’effectuer le test.

4. Chargement des cartouches avec les composés souhaités

  1. Diluer les composés souhaités dans de l’ACSF modifié (37 °C) jusqu’à la concentration finale sur le stock de 10x, 11x, 12x et 13x de la concentration de travail pour les ports A à D, respectivement, et ajuster à pH 7,4. Le test administrera les composés dans l’ordre du port A au port D. Pour cette expérience, les solutions suivantes ont été utilisées, avec leur concentration de travail respective mentionnée avant elles: 10 mM de pyruvate (port A), 20 μM d’oligomycine (port B), 10 μM ou d’autres concentrations de FCCP (port C) et 20 μM d’antimycine A (port D).
  2. Préchargez délicatement 75 μL des composés dilués dans les orifices d’injection appropriés de la cartouche du capteur. Placez les pointes à mi-chemin dans les orifices d’injection à un angle de 45° avec la pointe contre la paroi de l’orifice d’injection. Les embouts ne doivent pas être insérés complètement au bas des orifices d’injection, car cela pourrait provoquer une fuite de composé à travers le port.
  3. Retirez soigneusement les embouts des orifices pour éviter de créer des bulles d’air. Ne touchez aucune partie de la cartouche pour éviter d’atténuer les bulles d’air.
  4. Inspectez visuellement les orifices d’injection pour un chargement uniforme. Assurez-vous que tout le liquide est dans le port et qu’aucune goutte résiduelle n’est présente sur le dessus de la cartouche.
  5. Placez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire et mettez-la dans un incubateur (sans CO2) pendant 30 min pour lui permettre de chauffer à nouveau jusqu’à 37 °C. Manipulez soigneusement en ne tenant que la plaque utilitaire. Déplacez-vous le moins possible.

5. Étalonnage et exécution du test

  1. Chargez le modèle de test dans le logiciel. Appuyez sur le bouton vert START .
  2. Assurez-vous de charger le bon protocole. Le protocole contient une combinaison de séquences de mesure de 3 min, 3 min d’attente et 2 min (ces trois étapes forment une seule mesure). Modifiez la distance de la tête de sonde de 26 600 à 27 800 dans les paramètres matériels sous paramètres de l’instrument25. Il n’est pas nécessaire de changer la tête de sonde pour l’analyseur XFe24. Appuyez sur DÉMARRER.
  3. Chargez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire dans le plateau de l’instrument. L’encoche va à l’avant, dans le coin gauche. Assurez-vous que la plaque est bien assise et plate. Chargez la cartouche de capteur remplie de médicament dans l’analyseur pour l’étalonnage.
  4. Suivez les instructions à l’écran afin d’étalonner et d’équilibrer les capteurs. Cela prend environ 30 min.
  5. Une fois l’étape d’étalonnage terminée, retirez la plaque d’étalonnage et remplacez-la par la plaque d’îlots (contenant les tranches de maille et de tissu).
  6. Mesurez la consommation d’oxygène dans chaque puits de la plaque à l’aide des protocoles d’essai. Le protocole contient une combinaison de séquences de mélange de 3 minutes, d’attente de 3 minutes et de séquences de mesure de 2 minutes (ces trois étapes forment une mesure), moment auquel l’OCR est calculé.
  7. Pour l’ensemble de l’expérience, inclure des mesures OCR 4x pour créer une ligne de base, suivies de l’injection du port A (pyruvate) avec des mesures 4x, puis de l’injection du port B (oligomycine) avec des mesures 8x, puis de l’injection du port C (FCCP) avec des mesures 5x, et, enfin, de l’injection du port D (antimycine A) avec des mesures 6x.
    REMARQUE: Ce nombre de mesures après chaque injection de composé est déterminé en fonction du moment où la mesure atteint le plateau.
  8. Analysez les données de mesure OCR et les données d’efficacité de couplage.

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Résultats

La première étape de cette étude consistait à optimiser l’épaisseur de la tranche et la taille du poinçon utilisée pour exciser une section du striatum de la tranche (figure 3A). Une tranche de 150 μm d’épaisseur et une taille de poinçon de 1,5 mm ont donné les meilleurs résultats déterminés par l’efficacité du couplage (Figure 3B-C). Comme le montre la figure 3B, l’OCR est relativement stable penda...

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Discussion

La méthode que nous avons développée a permis d’utiliser un analyseur XF pour mesurer l’OCR dans des tranches striatales de souris adultes sur une période de 4 h. Cette méthode offre une nouvelle façon de mesurer la bioénergétique cellulaire dans les poinçons excisés à partir de structures cérébrales anatomiquement définies. Étant donné que les échantillons de tissus analysés sont plutôt petits, les paramètres métaboliques de zones cérébrales spécifiques impliquées dans une maladie peuvent être étudiés. En outre, l’utili...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Wangchen Tsering et Pamela Walter pour leur lecture critique et leur édition de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 à C.J. L. et NS098393 à H.Z.) et le Département de neurosciences de l’Université Thomas Jefferson (Startup Funds à H.Z.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Appareil de mesure du pH de paillasse Accumet AB150Thermo Fisher Scientific13-636-AB150Pour mesurer le pH
de l’antimycine A de streptomyces sp.SIGMAA8674Pour inhiber le complexe III des mitochondries
Albumine sérique bovine (BSA)SIGMAA6003Pour fabriquer du liquide céphalo-rachidien artificiel modifié (BSA-ACSF)
Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP)SIGMAC2920Pour découpler la respiration mitochondriale
D-GlucoseSIGMAG8270Pour fabriquer du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
DMSOSIGMAD8418Pour dissouder les composés
HEPESSIGMAH3375Pour fabriquer du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
Incubateur humidifié sans CO2Fisher Scientific11-683-230DPour hydrater les plaques à 37 ° ; C
Oligomycine de Streptomyces diastatochromogenesSIGMAO4876Pour inhiber l’ATP synthase mitochondriale
ParafilmSIGMA-ALDRICHFilm d’étanchéité
RotenoneTocris3616Pour inhiber le complexe I des mitochondries
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mLSeahorse Bioscience103681-100Solution pour l’étalonnage des hippocampes
Analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF ÉquipementSeahorse Bioscienceutilisé pour analyser le taux de consommation d’oxygène, ancienne génération
Analyseur de flux extracellulaire Seahorse XFe24 ÉquipementSeahorse Bioscienceutilisé pour analyser le taux de consommation d’oxygène, nouvelle génération
Seahorse XF24 FluxPaksSeahorse Bioscience101174-100Ensemble de cartouches de capteur d’analyseur de flux, de plaques de culture tissulaire, d’écrans de capture, etc. solution d’étalonnage et plaques d’étalonnage ; kit de dosage.
Pyruvate de sodiumSIGMAP2256Pour éviter toute contrainte limitant le substrat de l’approvisionnement en substrat
Poinçons de biopsie en acier inoxydableMiltexDispositif utilisé pour poinçonner des tranches
Boîte de culture cellulaire stérile, 35 x 10 mmEppendrof0030700102Utilisé pour le poinçonnage de tranches
VibratomeLeicaVT1200Pour trancher le tissu cérébral
Bain d’eauThermo Scientific Precision282-115Pour chauffer les tampons et les solutions

Références

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