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Research Article
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Erratum Notice
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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Le présent protocole décrit le développement d’une boîte à outils open source à 5 choix de temps de réaction en série pour les modèles animaux de rongeurs, en utilisant Arduino et le matériel associé et une boîte à outils Matlab polyvalente, y compris un script facultatif pour l’entraînement comportemental automatisé. Les scripts sont personnalisables et facilitent la mise en œuvre de différents modèles d’essai et de test.
La tâche de temps de réaction en série à 5 choix (5-CSRTT) est un test comportemental souvent utilisé pour étudier l’attention visuospatiale et l’impulsivité chez les rongeurs. La tâche exige que les animaux accordent une attention particulière à un réseau horizontal de cinq petites ouvertures équipées de sources lumineuses et, dans une fenêtre de temps limitée, piquent une ouverture cible éclairée pour obtenir une récompense alimentaire au magasin de nourriture situé dans le mur opposé de la chambre. La tâche prend en compte les mesures de contrôle comportemental telles que la précision de la réponse et les temps de réaction et permet de déduire une attention sélective et une impulsivité. La difficulté de la tâche peut être contrôlée en modifiant la durée du stimulus et la conception de la tâche en général. Les appareils disponibles dans le commerce se composent généralement d’une chambre expérimentale et d’un logiciel particulier pour spécifier les paramètres de la tâche, mais en raison du matériel et du logiciel fixes, ils posent de nombreuses limites aux changements dans la conception expérimentale générale et les exigences spécifiques de la tâche et la sortie de données connexes. Cet article explique une alternative entièrement personnalisable basée sur un microcontrôleur monocarte facile à utiliser et des composants électrotechniques standard, un script Arduino en libre accès et une boîte à outils Matlab pour le contrôle matériel et les spécifications des tâches comportementales, respectivement. La boîte à outils comprend une procédure d’escalier optionnelle, permettant une formation comportementale automatisée. La configuration matérielle complète, qui peut être installée dans des chambres personnalisées, et le logiciel librement adaptable encouragent la conception non standardisée des tâches et des chambres. La conception du système et le code open source pour le contrôle matériel et la configuration expérimentale sont décrits.
Le 5-CSRTT est un test comportemental, souvent utilisé chez les rongeurs pour étudier les processus attentionnels visuels et l’impulsivité 1,2,3,4,5,6, tels que la détermination du rôle du système cholinergique dans l’attention et l’influence des inhibiteurs de la recapture de la noradrénaline sur les comportements impulsifs7 . L’appareil standard permet d’observer diverses mesures de contrôle telles que la précision de la réponse, les temps de réaction, le comportement impulsif et compulsif, la capacité motrice et la motivation 1,2,3,4,5. Il se compose d’un réseau horizontal de cinq ouvertures équipées de LED, d’un magasin de nourriture sur les murs de la chambre s’opposant aux ouvertures et de lumières de maison 2,5. Dans une tâche typique, la lumière de la maison est éclairée et le début d’une séance est marqué par l’éclairage du magasin alimentaire, où une pastille gratuite est livrée. Le cours d’essai est lancé lorsque l’animal pique le chargeur pour récupérer le granulé1. Après cela, la lumière du magasin alimentaire s’éteint et l’intervalle entre les essais (ITI) commence, au cours duquel l’animal est censé diriger son attention vers les ouvertures. Une fois l’ITI écoulé, un éclairage de stimulus est présenté dans l’une des ouvertures 1,2,5. Le stimulus est donné pour une longueur spécifique connue sous le nom de durée du stimulus (StD). L’animal peut réagir au stimulus pendant qu’il est présenté ou pendant une fenêtre de temps limitée après la fin de la MST, connue sous le nom de maintien limité (LH). Pour répondre, l’animal doit piquer le nez dans l’ouverture cible et, si cela est fait correctement, une récompense est libérée dans le magazine alimentaire 1,2,5. Sinon, toute réponse incorrecte, ainsi que toute réponse avant la présentation du stimulus (anticipée ou prématurée) ou tout défaut de réponse (omission) entraîne un délai d’attente (TO), pendant lequel la lumière de la maison est éteinte pendant une certaine durée 1,2,5 (Figure 1). En général, la précision du stimulus discriminatif mesure le fonctionnement attentionnel, tandis que les réponses prématurées et persévérantes (réponses répétées aux ouvertures après la présentation du stimulus) sont considérées comme des mesures du comportement impulsif et de la compulsivité, respectivement 1,4,5,6.

Figure 1 : Séquences d’essai possibles d’un 5-CSRTT typique. Après l’intervalle intertenseur, le voyant de stimulation est allumé pendant une durée spécifique, puis éteint pendant l’intervalle de maintien limité. Le rat peut soit répondre correctement et recevoir une récompense, soit répondre de manière incorrecte et obtenir un délai d’attente pendant ce temps. Si le rat ne répond pas à temps, son omission entraîne un délai d’attente. De même, s’il répond avant la présentation du stimulus lumineux, sa réponse prématurée entraîne un délai d’attente. Un autre essai commence après la collecte de la récompense ou la fin de la période de temporisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le 5-CSRTT est largement utilisé en raison de sa flexibilité: en modifiant les paramètres de la conception de l’essai, différentes sous-catégories d’attention peuvent être étudiées. Par exemple, alors que l’animal est censé répartir son attention sur les cinq ouvertures différentes (attention visuospatiale), l’utilisation de stimuli non pertinents (par exemple, des stimuli auditifs) permet de tester l’attention sélective ou soutenue 1,2,5,6. À cette fin, la configuration expérimentale peut être étendue en incluant des haut-parleurs, qui peuvent être utilisés comme stimuli distrayants ou même renforçant 1,2,5,6. De plus, la charge attentionnelle peut être directement modulée en modifiant la présentation du stimulus ou en randomisant la durée ITI10. Le 5-CSRTT n’est pas seulement utilisé chez les rongeurs 3,7, mais a récemment été adapté pour tester les primates non humains 1,7,8 et les poissons 7,9, ce qui démontre davantage sa faisabilité. Une boîte à outils 5-CSRTT entièrement personnalisable permet d’adapter facilement le paradigme standard des rongeurs à d’autres modèles animaux. De plus, la flexibilité de personnalisation de la boîte à outils 5-CSRTT encourage également la recherche utilisant des conceptions de tâches non standard.
La boîte à outils 5-CSRTT entièrement personnalisable présentée ici contient un script Arduino pour le contrôle matériel, programmé dans un environnement de développement intégré. Il se compose également d’une boîte à outils Matlab (version R2019b ou plus récente) pour le contrôle des expériences. Le protocole suivant explique comment configurer la boîte à outils 5-CSRTT avec le paradigme standard largement utilisé et affiche les configurations facultatives pour les paradigmes non standard.
La procédure expérimentale de ce protocole a été réalisée conformément aux recommandations de la directive européenne 2010/63 pour le bien-être des animaux d’expérimentation et conformément à la loi sur le bien-être animal émise par le gouvernement fédéral allemand et approuvée par les autorités locales. Étant donné que la recherche ne nécessitait qu’une formation comportementale, aucun animal n’a été euthanasié et tous ont été gardés dans l’élevage après la recherche. La recherche a été menée sur dix rats à capuchon Lister mâles (âgés de 4 mois au début de l’entraînement comportemental).
1. Hébergement, élevage et manipulation des animaux
2. Préparation du matériel et du logiciel de contrôle
3. Préparation du logiciel de contrôle de l’expérience
4. Configuration des paramètres utilisés dans la boîte à outils 5-CSRTT
5. Expérience comportementale

Figure 2 : L’appareil 5-CSRTT utilisé pour la présente étude. L’appareil fonctionne sur un ordinateur portable équipé de la boîte à outils 5-CSRTT, qui fournit un script pour contrôler le microcontrôleur et tous les équipements connexes et plusieurs scripts pour contrôler l’expérience 5-CSRTT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La boîte à outils entièrement personnalisable est facile à utiliser et basée sur un microcontrôleur monocarte et des composants électrotechniques standard. La figure 3 montre un schéma simplifié de circuit et de câblage. L’ensemble de l’ouverture se compose de 5 LED comme stimuli lumineux et de cinq capteurs infrarouges pour détecter les piqûres de nez. La lumière de la maison se compose d’une bande avec huit LED, et le magasin alimentaire est fait d’une ouverture avec une porte à rabat avec un micro-interrupteur, un distributeur de granulés entraîné par moteur et une bande avec huit LED pour l’éclairage. Le circuit illustre également les connexions pour les composants optionnels tels que le haut-parleur buzzer passif pour le retour auditif et un potentiomètre numérique pour le réglage du volume. Pour obtenir une liste de l’équipement utilisé dans le développement de cette boîte à outils, veuillez consulter le Tableau des matériaux.

Figure 3 : circuit simplifié du matériel du microcontrôleur. Pour être facilement et rapidement personnalisable, l’équipement du microcontrôleur est connecté via une breadboard. De haut à gauche en bas à gauche, dans le sens des aiguilles d’une montre : Une carte de microcontrôleur est connectée à un bouclier moteur et à un moteur CC (représentant le moteur distributeur de granulés). À droite se trouvent les bandes LED pour les lumières de la maison et des magazines alimentaires, et au milieu se trouvent les cinq LED blanches pour la lumière de stimulation et les cinq paires de capteurs infrarouges utilisées dans les ouvertures. Sous la carte du microcontrôleur se trouve un simple microcommutateur (représentant l’interrupteur utilisé dans la porte du rabat du magasin alimentaire). Enfin, un haut-parleur buzzer passif et un potentiomètre numérique sont représentés au milieu. Cette image a été réalisée à l’aide du logiciel open source Fritzing. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Liaison et fonctions de tous les composants des scripts de contrôle de l’expérience et diagramme simplifié de la fonction « Code ». (A) Le script « Utilisateur » envoie ses paramètres à la fonction « Code », qui à son tour est directement liée à la fonction « Escalier », ce qui lui permet de mettre à jour tout paramètre utilisé dans la fonction « Code » pendant que l’expérience est en cours. La fonction « Code » envoie ensuite ses résultats à la fonction « DataProc » à la fin de la session. (B) Avant de démarrer une session d’expérimentation, la fonction « Code » vérifie d’abord si elle est censée démarrer le protocole d’accoutumance. Sinon, il configure les paramètres en fonction des définitions choisies dans le script « Utilisateur ». Avant le début de chaque essai, la fonction vérifie ensuite si la touche ÉCHAP du clavier a été enfoncée. Si ce n’est pas le cas, il se poursuit avec un nouveau procès. Sinon, il arrête la session d’expérience et transmet les données collectées à la fonction DataProc. Cette vérification critique avant chaque début d’essai permet au programme de s’arrêter avant que la limite de temps choisie ne soit atteinte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les interactions entre les différents scripts de contrôle de l’expérience peuvent être vues à la figure 4A. Le script « Utilisateur » inclut tous les paramètres qui définissent l’expérience. Là, les variables qui déterminent le moment de l’expérience, le nombre et la luminosité des stimuli éclairés, la durée de l’ITI, etc. peuvent être librement choisies. La fonction Code (dossier supplémentaire 5) comprend une description détaillée d’un seul essai et de tous les résultats possibles, qui est réitérée tout au long de l’expérience, comme le montre la figure 4B. De plus, il s’agit d’un protocole d’accoutumance de l’animal à l’appareil. La fonction Code vérifie également régulièrement les performances de l’animal. De plus, la fonction Escalier est optionnelle. La performance du sujet est comparée aux critères précédemment définis, et les paramètres souhaités sont automatiquement mis à jour si la performance de l’animal répond à ces critères. La fonction Escalier peut également prendre en compte les résultats acquis de la séance de la veille. Pendant que l’expérience est en cours, une vérification des performances à la fin d’un essai calculera l’exactitude, les omissions et le nombre total de réponses correctes des essais terminés et comparera le résultat avec les critères souhaités pour une mise à jour de niveau, comme spécifié dans la fonction Escalier. Enfin, la fonction DataProc traite toutes les données collectées et génère des graphiques simples pour une analyse rapide. À la fin d’une session, la boîte à outils enregistre automatiquement toutes les données dans un fichier *.mat et génère un fichier *.xlsx supplémentaire avec les informations essentielles de l’expérience.

Figure 5 : Exemple de différentes configurations de stimulus de la boîte à outils 5-CSRTT. Le diagramme illustre les combinaisons possibles de stimuli cibles en fonction de la configuration choisie. Les configurations « toutes » et « simples » sont utilisées dans le paradigme standard (pour l’accoutumance et l’expérience comportementale). Les configurations « voisin » et « décalé » montrent des configurations de stimulus non standard, permettant l’utilisation d’autres nombres de stimuli éclairés, qui peuvent également avoir un contraste différent de celui du stimulus cible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’étape de protocole 4.2.7.7 mentionne une fonctionnalité facultative : la modification du regroupement des ouvertures cibles. Le paradigme standard 5-CSRTT utilise un seul stimulus cible. Ici, nous illustrons comment la boîte à outils présentée permet de modifier le paradigme standard. La figure 5 montre quelques combinaisons de groupes possibles sur un total de cinq ouvertures concernant la configuration choisie. La configuration « tout » éclaire toutes les ouvertures disponibles de sorte que chaque ouverture est maintenant une ouverture cible, ce qui peut être utile dans les étapes de formation initiales. La configuration voisine s’assure que le nombre (librement choisi) d’ouvertures cibles sera voisin les uns des autres. Les paramètres peuvent être spécifiés de telle sorte que les voisins ne seront pas identiques à l’ouverture cible mais seront éclairés à un contraste plus faible (voire plus élevé). L’utilisation d’ouvertures avec différents contrastes d’éclairage permet de tester de nouveaux paradigmes, tels que l’utilisation de récompenses de niveau différent pour les piqûres de nez dans les ouvertures à contraste élevé ou faible. La figure 5 montre un exemple avec trois ouvertures cibles avec un éclairage identique. La configuration unique est généralement utilisée dans le 5-CSRTT standard, où une seule cible est éclairée. Enfin, la configuration décalée étend la configuration voisine. Il déplace le stimulus voisin vers la dernière ou la première ouverture au cas où l’ouverture cible se trouve à la première ou à la dernière position, respectivement. Comme dans la configuration voisine, la force d’éclairage des voisins peut être librement choisie, étant identique ou différente de l’ouverture cible. En outre, le nombre total de stimuli éclairés peut être librement choisi. La boîte à outils calcule ensuite automatiquement tous les stimuli possibles. Toutefois, le paramètre « Config.LED.NumHighLED » doit être défini sur « 1 » pour cette configuration.
Selon le protocole, l’entraînement des rats (N = 10) pour le 5-CSRTT a été effectué selon les étapes d’entraînement présentées dans le tableau 1.
Tableau 1 : Calendrier de formation 5-CSRTT et critères pour passer au niveau suivant. (A) L’intervalle entre les essais a été maintenu constant à 5 s dans tous les niveaux d’entraînement. (B) Durée du stimulus pour chaque niveau de formation. (C) Fenêtre de temps de maintien limité (LH), le temps maximum toléré entre le stimulus désactivé et toute réponse piquée du nez. (D) Le nombre total de réponses correctes nécessaires pour réussir le niveau de formation respectif. (E) Le pourcentage d’exactitude est calculé comme suit
: . (F) Le pourcentage d’erreurs d’omission est défini comme
. Ce critère n’inclut pas les réponses prématurées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
La performance des rats a été comparée au nombre de jours d’entraînement (sessions) nécessaires pour compléter chaque niveau d’entraînement indiqué dans le tableau 1. Tous les animaux ont commencé au niveau d’entraînement 1 avec une StD et une LH de 60 s chacune. Cependant, certains rats (N = 5) ont reçu une formation d’accoutumance améliorée pour tester certaines des options de stimulus supplémentaires rapportées précédemment, ce qui explique la différence dans le nombre de séances que les animaux individuels ont maintenues au niveau d’entraînement 1. L’achèvement du niveau a été marqué par l’atteinte d’un total de 30 réponses correctes ou plus. La MST et la LH ont diminué au cours des niveaux suivants, tandis que les critères pour passer au niveau de formation suivant sont devenus plus stricts, augmentant la demande attentionnelle de la tâche 1,6.
Le tableau 2 montre la feuille de calcul *.xlsx générée automatiquement d’un exemple de rat au cours d’une session. Le rat a commencé avec la configuration spécifiée dans le niveau d’entraînement 5. Après quatre essais, le rat est passé au niveau 6, compte tenu des essais effectués au cours de la session en cours et de la précision obtenue lors de la session précédente. Le nombre d’essais à effectuer au minimum dans la session en cours pour passer au niveau de formation suivant est spécifié dans la variable « Config.Experiment.MinNumTrials ». Au cours de la même session, le rat est passé au niveau d’entraînement 7 après avoir terminé 66 essais au niveau 6 et atteint l’exigence de > précision de 80% et <'omission de 20%. Au total, les rats ont été entraînés pendant 26 jours en utilisant la configuration des niveaux d’entraînement fournie dans le tableau 1. Le nombre de séances passées par niveau de formation est indiqué à la figure 6A. La ligne noire montre la moyenne de tous les sujets, et chaque ligne colorée affiche les données d’un rat. Tous les rats ont atteint le huitième niveau en 14 à 22 séances (figure 6B). La figure 6C montre la performance moyenne des sujets par niveau d’entraînement et pour tous les jours de formation dans l’appareil 5-CSRTT. La ligne noire pointillée représente le pourcentage de précision et la ligne noire droite représente le pourcentage d’omission. L’exactitude a été calculée comme le rapport entre le nombre de réponses correctes et le nombre total de réponses. Les omissions ont été calculées comme le rapport entre le nombre d’omissions et le nombre total d’essais (c.-à-d. la somme des réponses correctes, des réponses incorrectes et des omissions). La ligne grise indique le nombre total moyen de réponses correctes pour tous les essais de chaque niveau. La figure 6D montre la précision finale obtenue par chaque sujet au huitième et dernier niveau d’entraînement.
En moyenne, les rats ont passé 5,9 (±1,03 SEM) pour terminer le niveau 1, entre 1,5 (±0,17) et 3,5 (±0,5) sessions pour terminer le niveau 2 à 6, et 1,7 (±0,16) sessions pour terminer le niveau 7 avant d’atteindre le niveau final 8. Comme le montre la figure 6A, la variance entre les sujets était la plus significative dans les niveaux initiaux (ET = 3,25 au niveau 1, 1,58 au niveau 2) et a diminué dans les niveaux ultérieurs (0,47 et 0,48 dans les niveaux 6 et 7, respectivement). Au niveau 4, lorsque la durée du stimulus a été encore réduite, le nombre moyen de séances passées (2,6 ± 0,52) et la variance entre les rats (1,64) ont augmenté, deux rats prenant 5 et 6 jours pour conclure le niveau.

Figure 6 : Résultats de l’expérience comportementale avec la boîte à outils 5-CSRTT. (A) Le nombre de séances effectuées à chaque niveau de formation. La ligne noire représente le nombre moyen de sessions de tous les sujets pour chaque niveau (moyenne ± SEM), et les lignes colorées représentent les données de chaque sujet. B) Le nombre absolu de sessions nécessaires pour atteindre le niveau final, par matière. (C) Mesures de performance moyennes tout au long de la formation (moyenne ± SEM). La ligne noire pointillée représente la précision de tous les sujets dans toutes les réponses données dans toutes les sessions par niveau de formation, et la ligne noire indique le pourcentage d’omission correspondant. La ligne grise représente le nombre absolu moyen de réponses correctes de toutes les matières à chaque niveau de formation. (D) Précision par matière au cours du huitième et dernier niveau de formation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 2 : Données recueillies auprès d’un exemple de rat au cours d’une séance d’entraînement. La colonne A affiche le nombre d’essais au cours de la session en ce qui concerne le niveau de formation actuel, comme indiqué dans la colonne B. La colonne C affiche la durée de l’ITI et la colonne D affiche l’heure de début de l’essai. Les colonnes E à I montrent le niveau de luminosité du stimulus LED dans les ouvertures 1 à 5, respectivement. Un niveau de luminosité de 0 signifie que le stimulus était désactivé, et un niveau de luminosité de 0,2 signifie que le stimulus a été activé avec 20% de son intensité maximale. Les colonnes J et K indiquent l’heure exacte à laquelle le stimulus a été activé et désactivé, respectivement. La colonne L affiche le résultat de l’essai : 0 signifie « omission », 1 signifie « réponse correcte », 3 signifie « réponse incorrecte » (piqué du nez dans l’ouverture non ciblée) et 4 signifie « prématuré ». La colonne M indique quelle ouverture a été piquée pendant l’essai, tandis que la colonne N représente l’heure exacte du piqué du nez. Les colonnes O, P et Q indiquent l’heure à laquelle le moteur du distributeur de granulés a été allumé, le numéro de moteur correspondant et le moment où le rat a ouvert le distributeur de granulés pour obtenir sa récompense, respectivement. La colonne R affiche l’heure de fin de la période d’évaluation. Les colonnes S, T, U, V et W indiquent le nombre total de réponses prématurées, de délais d’expiration, de poussées de panneau pendant un ITI, le nombre total de réponses persévératives et la durée d’exécution totale de la session en minutes, respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Fichier supplémentaire 1: Script pour le contrôle matériel du logiciel IDE (code Arduino). Cela inclut toutes les commandes pour contrôler le matériel et les composants électrotechniques de la boîte à outils. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2: Script pour la fonction « Utilisateur » dans le logiciel de contrôle de l’expérience. Cela inclut tous les paramètres qui définissent l’expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 3: Script pour la fonction « Escalier » dans le logiciel de contrôle de l’expérience. Cela surveille les performances du sujet et les compare aux critères précédemment définis. Les paramètres souhaités sont automatiquement mis à jour si les performances de l’animal répondent à ces critères. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 4: Script pour la fonction « DataProc » dans le logiciel de contrôle de l’expérience. Cela traite toutes les données recueillies et génère des graphiques simples pour une analyse rapide. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 5 : Script pour la fonction « Code ». Cela comprend une description détaillée d’un seul essai et de tous les résultats possibles, qui est réitérée tout au long de l’expérience. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Le présent protocole décrit le développement d’une boîte à outils open source à 5 choix de temps de réaction en série pour les modèles animaux de rongeurs, en utilisant Arduino et le matériel associé et une boîte à outils Matlab polyvalente, y compris un script facultatif pour l’entraînement comportemental automatisé. Les scripts sont personnalisables et facilitent la mise en œuvre de différents modèles d’essai et de test.
Ce travail est soutenu par DFG WE 5469/3-1.
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