Article de méthode

Une méthode robuste pour la production à grande échelle de sphéroïdes pour les applications de criblage et d’analyse à haute teneur

DOI :

10.3791/63436

⸱

28 décembre 2021

 ,  , 
1Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille une méthode pour la production de trois types différents de sphéroïdes d’une manière qui les rend adaptés au criblage et à l’analyse à grande échelle à haute teneur. En outre, des exemples sont présentés montrant comment ils peuvent être analysés au niveau des sphéroïdes et des cellules individuelles.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le criblage à haute teneur (HCS) et l’analyse à haute teneur (HCA) sont des technologies qui permettent aux chercheurs d’extraire des mesures phénotypiques quantitatives à grande échelle des cellules. Cette approche s’est avérée puissante pour approfondir notre compréhension d’un large éventail d’événements fondamentaux et appliqués en biologie cellulaire. À ce jour, la majorité des applications de cette technologie reposent sur l’utilisation de cellules cultivées en monocouches, bien qu’il soit de plus en plus réalisé que de tels modèles ne récapitulent pas bon nombre des interactions et des processus qui se produisent dans les tissus. En tant que tel, il y a eu une émergence dans le développement et l’utilisation d’assemblages cellulaires en 3 dimensions (3D), tels que les sphéroïdes et les organoïdes. Bien que ces modèles 3D soient particulièrement puissants dans le contexte de la biologie du cancer et des études d’administration de médicaments, leur production et leur analyse d’une manière reproductible adaptée au HCS et au HCA présentent un certain nombre de défis. Le protocole détaillé ici décrit une méthode de génération de sphéroïdes tumoraux multicellulaires (MCTS) et démontre qu’il peut être appliqué à trois lignées cellulaires différentes d’une manière compatible avec HCS et HCA. La méthode facilite la production de plusieurs centaines de sphéroïdes par puits, offrant l’avantage spécifique que lorsqu’elles sont utilisées dans un régime de criblage, les données peuvent être obtenues à partir de plusieurs centaines de structures par puits, toutes traitées de manière identique. Des exemples sont également fournis, qui détaillent comment traiter les sphéroïdes pour l’imagerie par fluorescence à haute résolution et comment HCA peut extraire des caractéristiques quantitatives à la fois au niveau des sphéroïdes ainsi qu’à partir de cellules individuelles dans chaque sphéroïde. Ce protocole pourrait facilement être appliqué pour répondre à un large éventail de questions importantes en biologie cellulaire.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionnellement, les essais cellulaires ont été effectués dans des monocouches se développant sur un substrat solide, qui peut effectivement être considéré comme un environnement bidimensionnel (2D). Cependant, il est de plus en plus reconnu que les modèles de culture cellulaire 2D manquent de pertinence physiologique dans certains contextes et ne peuvent pas reproduire bon nombre des interactions complexes qui se produisent entre les cellules1. Les méthodes de culture cellulaire tridimensionnelle (3D) deviennent rapidement populaires parmi les chercheurs, et les modèles cellulaires 3D montrent un potentiel élevé pour mieux imiter les conditions physiologiques rencontrées par les cellules dans l’environnement tissulaire2. Il existe plusieurs types différents d’assemblages de cellules 3D qui ont été utilisés, mais les deux types les plus courants sont les sphéroïdes et les organoïdes. Les sphéroïdes peuvent être cultivés à partir de nombreuses lignées cellulaires différentes, et ils peuvent adopter différentes formes et tailles en fonction du type de cellule utilisé et de leur méthode d’assemblage3. De plus, les sphéroïdes peuvent également être appelés sphéroïdes tumoraux multicellulaires (SCTM) lorsqu’ils sont cultivés à partir de lignées cellulaires cancéreuses, et ces modèles ont trouvé une utilisation particulière pour l’administration préclinique de médicaments in vitro et les études de toxicité4,5. Les organoïdes, d’autre part, visent à mieux imiter les tissus et les organes de notre corps et peuvent adopter des arrangements morphologiques plus complexes. La production d’organoïdes implique l’utilisation de cellules souches adultes ou de cellules souches pluripotentes, qui peuvent être reprogrammées dans les cellules appropriées pour ressembler au tissu ou à l’organe d’intérêt. Ils sont principalement utilisés pour étudier le développement des organes et modéliser les maladies et les interactions hôte-pathogène6.

Il existe une gamme de méthodes différentes utilisées pour générer des assemblages de cellules 3D. Les méthodes basées sur l’échafaudage fournissent un substrat ou un support auquel les cellules peuvent s’attacher ou se développer à l’intérieur. Ces échafaudages peuvent avoir différentes formes et peuvent être fabriqués à partir d’une variété de matériaux différents. Les plus courants sont les composants de la matrice extracellulaire (ECM) et les hydrogels, et ils sont conçus pour ressembler à l’environnement extracellulaire naturel des cellules et faciliter ainsi les interactions physiologiques4,7. Le matériau du sous-sol ECM a été extrait de la tumeur du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm et il a été démontré qu’il contenait un riche mélange de composants ECM, y compris la laminine, le collagène de type IV et le perlécan8. Cependant, malgré sa composition avantageuse, son utilisation présente deux défis principaux, à savoir sa variabilité d’un lot à l’autre et le fait qu’il présente deux états agrégés différents inférieurs et supérieurs à 10 °C8,9. En revanche, les hydrogels ont l’avantage d’être flexibles en ce qui concerne leurs composants et leur rigidité, et ils peuvent être personnalisés pour s’adapter à l’assemblage de cellules 3D spécifique souhaité7,10. Les méthodes basées sur l’échafaudage sont essentielles pour la croissance organoïde, mais sont également largement utilisées pour les sphéroïdes. Les méthodes sans échafaudage, qui fonctionnent en empêchant les cellules de se fixer à la surface sur laquelle elles poussent, ne sont généralement compatibles qu’avec l’assemblage sphéroïde. Les exemples incluent des plaques à fixation ultra-faible (ULA), avec un fond plat ou un fond en U, qui permettent l’agrégation des cellules en sphéroïdes, ou l’utilisation d’une agitation continue des cellules dans des flacons de rotation10.

L’utilisation d’assemblages de cellules 3D pour étudier une grande variété d’événements biologiques gagne rapidement en popularité; toutefois, il est essentiel que la méthode choisie pour leur culture soit appropriée et compatible avec les plans d’analyse en aval. Par exemple, l’utilisation de plaques ULA génère des sphéroïdes de haute consistance; cependant, cette méthode est limitée à la production d’un seul sphéroïde par puits, limitant ainsi le débit. Une attention particulière est nécessaire lors de la planification de l’imagerie par fluorescence de la structure 3D. Le substrat ou la plaque sur lequel l’assemblage est cultivé doit être optiquement compatible et il faut veiller à minimiser les effets de la diffusion de la lumière causés par les échafaudages qui ont pu être utilisés11. Ce problème particulier devient plus aigu à mesure que l’ouverture numérique des lentilles de l’objectif du microscope augmente.

On peut soutenir que l’une des principales raisons de choisir de travailler avec un modèle de cellule 3D est d’extraire des données d’imagerie volumétrique non seulement sur l’ensemble de l’assemblage, mais aussi sur les cellules individuelles qu’il contient. Les modèles MCTS, en particulier, commencent à s’avérer très puissants pour approfondir notre compréhension de la façon dont les thérapies transitent de l’extérieur vers les cellules centrales (comme elles en auraient besoin dans une tumeur)12, et il est donc essentiel d’acquérir des connaissances à partir de cellules individuelles à différentes couches. La technologie d’imagerie qui extrait des informations quantitatives de cellules individuelles est appelée analyse à haute teneur (HCA) et constitue une approche puissante dans le contexte du dépistage13. À ce jour, le HCA a été presque exclusivement appliqué aux cultures monocouches, mais on se rend de plus en plus compte que cette approche a le pouvoir d’être appliquée aux cultures 3D permettant d’étudier un large éventail de fonctions et de processus cellulaires14. Il aurait l’avantage évident qu’un grand nombre d’assemblages 3D pourraient être analysés, fournissant potentiellement des données au niveau de la cellule de chaque structure. Cependant, les défis associés à l’imagerie d’assemblages de cellules potentiellement épaisses, ainsi qu’aux grands ensembles de données générés, doivent être surmontés.

Dans cet article, une méthode robuste basée sur un échafaudage pour la production à grande échelle de MCTS dans un format de 96 puits est présentée. La méthode facilite la production de plusieurs centaines d’assemblages de cellules 3D dans chaque puits. Des exemples sont présentés pour trois types de cellules différents, représentant des modèles de tumeurs solides du foie, du poumon et du côlon. Les sphéroïdes qui se forment peuvent être de différentes tailles, et donc HCA est utilisé pour sélectionner des structures d’une taille et / ou d’une morphologie particulière. Cette caractéristique offre l’avantage supplémentaire que tous les phénotypes observés peuvent être comparés entre des sphéroïdes de tailles différentes, mais tous traités de la même manière dans le même puits. Cette approche est compatible avec l’imagerie à haute résolution, fournissant de manière importante des données quantitatives au niveau cellulaire et subcellulaire provenant des mêmes assemblages cellulaires. Cette méthode de production de sphéroïdes présente l’avantage supplémentaire par rapport aux méthodes qui génèrent un seul sphéroïde par puits, que le grand nombre de sphéroïdes produits dans chaque puits fournit potentiellement suffisamment de biomasse pour d’autres analyses en aval, telles que le transcriptome et le profilage du protéome.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Culture cellulaire

  1. Préparer les médias
    1. Préparer des milieux de culture cellulaire spécifiques en fonction du type de lignée cellulaire. S’assurer que tous les milieux pour l’entretien cellulaire contiennent 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
      REMARQUE: Différentes lignées cellulaires utilisent différents médias. Les cellules de carcinome du côlon HT-29 (ATCC HTB-38) sont cultivées dans McCoys 5A + 10% FBS. Les cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2 (ATCC HB-8065) sont cultivées dans un milieu essentiel minimum + 1% de L-glutamine + 10% fbS. Les cellules du carcinome broncho-alvéolaire H358 (ATCC CRL-5807) sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 + 1% L-glutamine + 10% FBS. Tous les milieux contenant de la L-glutamine et du FBS sont appelés milieux complets. Lors du placage de cellules pour qu’elles se développent sous forme de sphéroïdes, un milieu sans rouge phénol avec 10% de FBS est nécessaire pour éviter la coloration du matériau du sous-sol ECM, ce qui peut à son tour provoquer des artefacts pendant le processus d’imagerie.
  2. Cellules de sous-culture
    1. Lorsque les cellules sont confluentes à environ 80 %, laver brièvement avec 2 mL de trypsine-EDTA (0,25 % (p/v) de trypsine/0,53 mM d’EDTA). Aspirer la trypsine-EDTA, ajouter 3 mL de trypsine-EDTA fraîche et incuber pendant 3-5 min à 37 °C.
    2. Lorsque les cellules sont détachées de la boîte de culture cellulaire, ajouter 7 mL de milieu frais complet.
    3. Pipeter 1 mL de suspension cellulaire dans un nouveau plat de culture cellulaire de 10 cm et ajouter 9 mL de milieu frais complet pour obtenir une dilution de 1:10 des cellules.
    4. Cultiver les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.
    5. Sous-cultiver les cellules tous les 3-5 jours, selon la lignée cellulaire.

2. Génération de sphéroïdes

  1. Enduire les plaques de 96 puits avec un matériau de sous-sol ECM
    1. Décongelez le matériau du sous-sol ECM sur la glace pendant la nuit.
    2. Diluer le matériau de sous-sol ECM dans un milieu sans sérum sans phénol froid à l’aide d’embouts pré-réfrigérés maintenus à -20 ° C.
      REMARQUE: La concentration finale de matériau de sous-sol ECM dépend de la lignée cellulaire utilisée. Pour les cellules HT-29 et H358, utilisez 4 mg·mL-1 de matériau de sous-sol ECM. Pour les cellules HepG2, utilisez 4 mg·mL-1 de matériau de sous-sol ECM à facteur de croissance réduit.
    3. Pipette 15 μL de la solution matériau/milieu du sous-sol ECM dans une plaque d’imagerie de 96 puits.
      REMARQUE: Pour la production de sphéroïdes à grande échelle, cette étape peut être effectuée à la fois avec une pipette à 8 canaux et une tête de pipetage à 96 canaux, à condition que les extrémités et le réservoir contenant le matériau du sous-sol ECM soient refroidis.
    4. Centrifuger la plaque pendant 20 min à 91 x g à 4 °C.
    5. Incuber la plaque pendant 30 min au maximum à 37 °C.
  2. Sous-culture et cellules de comptage
    1. Pendant la période d’incubation de la plaque, incuber les cellules avec de la trypsine-EDTA et les remettre en suspension dans un milieu complet contenant 10% de FBS.
    2. Pipette 10 μL de la suspension cellulaire dans une chambre de comptage hémocytométrique. Comptez le nombre de cellules dans 4 quadrants de la chambre.
    3. Calculez le nombre de cellules dans la suspension cellulaire en déterminant le nombre moyen de cellules dans les 4 quadrants.
      REMARQUE: Les cellules peuvent également être comptées à l’aide de dispositifs automatisés de comptage de cellules.
    4. Centrifuger les cellules à 135 x g pendant 4 min à température ambiante (RT).
    5. Une fois les cellules granulées, aspirez le surnageant et ressuspendez les cellules dans un milieu complet sans phénol rouge pour obtenir une concentration de 1 x 106 cellules par mL.
  3. Ensemencez des cellules dans des plaques revêtues de matériau de sous-sol ECM
    1. Diluer les cellules dans un milieu complet sans rouge de phénol.
      REMARQUE: La densité des cellules ensemencées dépend de la lignée cellulaire utilisée. Pour les cellules HT-29 et HepG2, 3 x 104 cellules sont ensemencées par puits; pour les cellules H358, 4 x 104 cellules sont ensemencées par puits.
    2. Ensemencez les cellules dans un volume total de 35 μL par puits. Assurez-vous de les ajouter goutte à goutte dans un mouvement circulaire.
      REMARQUE: Pour la production de sphéroïdes à grande échelle, cette étape peut être effectuée avec une pipette à 8 canaux, à condition que le mouvement circulaire de pipetage puisse être réalisé.
    3. Incuber les cellules pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.
    4. Préparez une solution de matériau de sous-sol ECM dans un milieu complet sans phénol rouge, ce qui donne une concentration finale de 2% de matériau de sous-sol ECM dans le puits. Pour ce faire, ajoutez 1,2 μL de matériau de sous-sol ECM à 23,8 μL de milieu complet sans phénol sans rouge par puits, ce qui donne un volume final de 60 μL par puits.
    5. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2.
    6. Le lendemain, remplacer le milieu par 100 μL de milieu complet sans phénol frais.
    7. Remplacez le milieu tous les deux jours par 100 μL de milieu complet sans phénol frais.

3. Coloration par immunofluorescence des sphéroïdes

NOTE: Ce protocole est adapté de Nürnberg et al., 202015. Ces adaptations sont principalement basées sur le fait que les sphéroïdes décrits dans ce protocole sont plus petits que ceux utilisés dans les travaux de Nürnberg et al.15 et, en tant que tels, facilitent des temps d’incubation plus courts. Par exemple, les temps de blocage sont réduits de 2 h à 1 h. De plus, comme le protocole est conçu pour la production à haut débit de sphéroïdes, toutes les étapes de traitement sont effectuées dans le puits dans lequel les sphéroïdes sont cultivés, ce qui signifie que le transfert de sphéroïdes individuels dans des tubes n’est pas nécessaire.

  1. Préparer toutes les solutions et tampons nécessaires à la fixation et à la coloration
    1. Préparez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en ajoutant 1 comprimé de PBS par 200 mL d’eau. Autoclavez le PBS.
    2. Préparer le paraformaldéhyde (PFA) en suivant les étapes 3.1.3-3.1.4.
    3. Utilisez un agitateur chauffé pour chauffer 400 mL de PBS à 60-70 °C dans une hotte. Ajouter 15 g de PFA en remuant. Une fois le PFA dissous, ajouter 50 μL de 1 M CaCl2 et 50 μL de 1 M MgCl2.
    4. Ajouter 100 mL de PBS pour obtenir un volume final de 500 mL. Utilisez naOH pour équilibrer le PFA à un pH de 7,4. Filtrer le PFA à travers des filtres à vide stériles (taille des pores 0,22 μm), aliquote et conserver à -20 °C.
    5. Préparer une solution mère de glycine de 1 M en ajoutant 3,75 g de glycine à 50 mL de PBS. Conserver à 4 °C.
    6. Préparer 5 mL de tampon de perméabilisation en ajoutant 100 μL de Triton X-100, 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 1,5 mL de glycine 1 M à 2,4 mL de PBS. Conserver à 4 °C pendant 2 semaines au maximum.
    7. Préparer 5 mL de tampon bloquant en ajoutant 100 μL de Triton X-100, 0,5 mL de DMSO et 0,05 g d’albumine sérique bovine (BSA) à 4,9 mL de PBS. Aliquoter le tampon bloquant dans des tubes de 1,5 mL et le stocker à -20 °C.
    8. Préparer 5 mL de tampon d’incubation d’anticorps en ajoutant 10 μL de polysorbate 20, 0,05 g de BSA et 250 μL de DMSO à 4,74 mL de PBS. Aliquoter le tampon d’incubation des anticorps dans des tubes de 1,5 mL et le stocker à -20 °C.
      REMARQUE: Dans le protocole décrit ici, les sphéroïdes ne sont assemblés que dans les 60 puits intérieurs d’une plaque de 96 puits, bien qu’ils puissent être préparés dans les 96 puits de la plaque. La raison pour laquelle on ne prépare que des sphéroïdes dans les 60 puits intérieurs est que certains objectifs à haute ouverture numérique ne sont pas capables d’imager physiquement l’ensemble du puits des puits extérieurs en raison de la « jupe » sur certains types de plaques. Les volumes ci-dessus sont suffisants pour la préparation de 60 puits contenant des sphéroïdes.
  2. Fixer et perméabiliser les sphéroïdes
    1. Retirez soigneusement le milieu des sphéroïdes, en veillant à ce que la couche de matériau du sous-sol ECM ne soit pas perturbée.
    2. Lavez les sphéroïdes deux fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
    3. Fixer les sphéroïdes avec 70 μL de PFA à 3 % pendant 1 h à 37 °C.
    4. Lavez les sphéroïdes deux fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
    5. Tremper avec 70 μL de solution de glycine 0,5 M pendant 30 min à 37 °C.
    6. Perméabiliser les sphéroïdes à l’aide de 70 μL du tampon de perméabilisation pendant 30 min à TA.
    7. Lavez les sphéroïdes deux fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
    8. Incuber les sphéroïdes dans 70 μL de tampon bloquant pendant 1 h à 37 °C.
      REMARQUE: Une fois les sphéroïdes fixés, toutes les étapes de traitement ultérieures peuvent être effectuées à l’aide d’une pipette à 8 canaux ou d’une tête de pipetage à 96 puits, si disponible. Cela augmente la vitesse de préparation des sphéroïdes avant l’imagerie.
  3. Sphéroïdes immunotachés utilisant des anticorps primaires et secondaires
    1. Diluer l’anticorps primaire à une dilution appropriée dans le tampon d’incubation de l’anticorps et ajouter 70 μL à chaque puits. Incuber les sphéroïdes avec l’anticorps primaire pendant la nuit.
      REMARQUE: La dilution dépend de l’anticorps spécifique utilisé. Dans l’exemple présenté ici, les lysosomes sont immunocolorés avec des anticorps anti-LAMP1 de souris en utilisant une dilution de 1:500.
    2. Le lendemain, lavez les sphéroïdes 5 fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
    3. Diluer l’anticorps secondaire à une dilution de 1:500, la phalloïdine conjuguée par fluorescence à 1:500, et Hoechst 33342 (à partir d’un stock de 1 mg mL-1 ) à 1:5000 dans le tampon d’incubation des anticorps et ajouter 70 μL à chaque puits. Incuber pendant la nuit.
      REMARQUE: La dilution de l’anticorps dépend de l’anticorps spécifique utilisé. Des anticorps secondaires hautement adsorbés par croisement qui présentent une photostabilité élevée et une luminosité élevée sont recommandés.
    4. Le lendemain, lavez les sphéroïdes 5 fois avec 70 μL de PBS pendant 3 min à chaque fois.
      REMARQUE: Les plaques peuvent être stockées jusqu’à deux semaines à RT avant l’imagerie, tant que les sphéroïdes restent recouverts de PBS.

4. Acquisition d’images et analyse de sphéroïdes

  1. Acquisition d’images
    1. Insérez la plaque de 96 puits contenant des sphéroïdes dans un microscope confocal à haute teneur.
    2. Sélectionnez les lasers appropriés pour exciter les fluorophores utilisés.
    3. Acquérez les canaux séquentiellement pour éviter les diaphonies.
    4. Imagez les sphéroïdes en utilisant des objectifs appropriés.
      REMARQUE : L’utilisation d’objectifs d’immersion dans l’eau est recommandée si disponible. Par exemple, un objectif NA 20x/1.0 peut imager un puits entier dans environ 77 champs de vision. Un objectif 63x/1.15 NA peut imager un puits entier dans environ 826 champs de vision.
    5. Image ~ 30-40 tranches, en fonction de la profondeur du sphéroïde, avec chaque tranche prise à un intervalle de 1,5 μm de la précédente.
  2. Analyse d’images
    1. Pour l’analyse morphologique des sphéroïdes, suivez les étapes 4.2.2-4.2.6.
    2. Segmentez les sphéroïdes en fonction de la coloration à la phalloïdine conjuguée par fluorescence.
    3. Segmentez les noyaux en fonction de la coloration Hoechst 33342.
    4. Segmenter le cytoplasme de chaque cellule par la coloration résiduelle de Hoechst 33342 présente dans le cytoplasme cellulaire.
    5. Calculez différentes propriétés morphologiques des sphéroïdes, y compris le volume, la surface, la sphéricité et le nombre de noyaux par sphéroïde.
      REMARQUE: Ces informations sont extraites à l’aide de divers algorithmes intégrés au logiciel d’analyse d’images de votre choix.
    6. Traitez davantage les images pour éliminer les sphéroïdes de moins de 75 000 μm3 et de plus de 900 000 μm3.
      REMARQUE: Ces valeurs sont des suggestions pour permettre l’élimination des assemblages de très petites cellules et des grands assemblages qui peuvent avoir surgi à la suite de la fusion de plusieurs sphéroïdes. Les sphéroïdes peuvent également être classés en différentes classes de taille à cette étape.
    7. Pour analyser des cellules individuelles dans les sphéroïdes, suivez les étapes 4.2.8-4.2.12.
    8. Segmentez les sphéroïdes en fonction de la coloration à la phalloïdine conjuguée par fluorescence.
    9. Segmentez les noyaux en fonction de la coloration Hoechst 33342.
    10. Segmenter le cytoplasme de chaque cellule par la coloration résiduelle de Hoechst 33342 présente dans le cytoplasme cellulaire.
    11. Segmenter les lysosomes en fonction de la coloration secondaire des anticorps.
    12. Calculez différentes propriétés morphologiques des cellules dans chaque sphéroïde, y compris le nombre de lysosomes par cellule, le volume cellulaire et la surface cellulaire.
      REMARQUE: Ces informations sont extraites à l’aide de divers algorithmes intégrés au logiciel d’analyse d’images de votre choix.

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Résultats

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Dans ce protocole, une méthode robuste pour produire des assemblages de culture cellulaire 3D sous forme de sphéroïdes, en utilisant différents types de cellules pour représenter divers tissus tumoraux, est détaillée. Cette méthode permet de générer des centaines de sphéroïdes par puits, ce qui permet d’effectuer des essais cellulaires à haute teneur (Figure 1). Cette approche a déjà été utilisée pour étudier l’absorption de nanoparticules dans les sphéroïdes HT-2916 ...

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Discussion

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L’approche décrite ici détaille une plate-forme permettant de générer plusieurs centaines de sphéroïdes par puits d’une manière adaptée aux HCS et HCA. Par rapport à d’autres méthodes populaires, telles que l’utilisation de plaques ULA à fond plat et à fond rond, qui permettent la formation d’un seul sphéroïde par puits18,19, cette méthode offre la possibilité d’extraire des informations à haute résolution d’un grand nombre de sphéroïdes dans un format de criblag...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts concurrents associés à cette œuvre.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs reconnaissent le soutien d’une subvention de recherche sur les infrastructures de la Science Foundation Ireland (SFI) (16/RI/3745) à JCS. Les travaux du laboratoire de dépistage cellulaire de l’UCD sont soutenus par le Collège des sciences de l’UCD. ASC est financé par une bourse d’études supérieures du gouvernement irlandais de la recherche (IRC) (GOIPG / 2019/68). Les auteurs remercient également tous les membres du laboratoire pour leur contribution et leurs discussions utiles. L’illustration de la figure 1 a été générée dans BioRender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % Trypsine-EDTA (1x), rouge de phénolGibco25300054
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma AldrichA6003
Chlorure de calciumFisher Scientific10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplaques, traitées par culture tissulaire, noires, 96 puits avec couverclePerkin Elmer6055302Ces plaques ont été renommées Phenoplates
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma AldrichD2650
Sérum fœtal bovin (FBS), qualifié, approuvé par l’UE, origine Amérique du Sud, inactivé thermiquementGibco10500064
GlycineFisher ScientificBP381-1
Chèvre anti-Souris IgG (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11029
L-Glutamine solution, 200 mMGibco25030024
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Chlorure de magnésiumFisher Scientific10647032
Matrigel Membrane Matrix, sans rouge de phénol, sans LDEV, 10 mLCorning356237Cette formulation de Matrigel peut également être trouvée avec le même numéro de catalogue chez BD Biosciences
Matrigel Facteur de croissance réduit MatrigelBD Biosciences356231Cette formulation de Matrigel peut également être trouvée avec le même numéro de catalogue chez Corning
McCoy’s 5A mediumGibco26600023
McCoy’s 5A medium avec L glutamine et bicarbonate de sodium, sans phénol redHyclone10358633
Minimum Essential Medium (MEM)Gibco21090022
Milieu essentiel minimum (MEM), sans glutamine, sans rouge de phénolGibco51200046
Anticorps monoclonal anti-LAMP1 de souris (concentré)Etudes développementales Hybridoma BankH4A3-a
Chambre de comptage NeubauerHirschmann8100203
Nunclon avec couvercle, polystyrène, 92 mm x 17 mmThermoFisher Scientific150350
Système Opera Phenix HCS et logiciel Harmony HCAPerkin ElmerHCSHH14000000
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma AldrichP6148
Phalloidin Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma AldrichP4417
Polysorbate 20Sigma AldrichP5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementGibco61870010
RPMI 1640 Medium, sans glutamine, sans rouge de phénolGibco11835063
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Stericup unités de filtration stériles sous videMilliporeSCGVU05RE

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
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