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L’utilisation de matières radioactives (RAM) nécessite l’approbation préalable d’un comité de sûreté désigné dans chaque établissement. Les RAM utilisés dans ce protocole ont été approuvés par Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) de l’Université de Pennsylvanie. L’utilisation d’animaux nécessite l’approbation préalable du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement d’origine. L’étude suivante a été approuvée par l’IACUC à l’hôpital pour enfants de Philadelphie.
1. Préparation de solutions mères pour 14substrats marqués C
- Préparer une solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) de 4 mM en mélangeant 11 g de BSA et 33,1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et en la agitant doucement à température ambiante pendant environ 3 h jusqu’à ce que la BSA soit complètement dissoute. Réchauffer la solution mère BSA dans un bain-marie à 70 °C avant utilisation.
- Sécher à l’air libre 50 μCi 14C-oléate (50 μCi/μmol dans l’éthanol) dans le flacon avec le couvercle fermé pendant 8 h dans une hotte de travail RAM désignée. Ajouter 312,5 μL deH2O puis 3,5 mg (11,5 μmol) d’oléate de sodium. Mélanger.
- Réchauffer la solution obtenue à 70 °C au bain-marie. Ajouter 0,9375 mL de la solution mère de BSA préavertie pour obtenir une solution mère d’oléate chaud de 10 mM (contenant un rapport de 1:11,5 de 14anéate C par rapport à l’oléate non marqué). Aliquotez la solution mère et conservez-la à -20 °C pour une utilisation à long terme.
- Utilisez 14C-glucose et 14C-glutamine directement après la décongélation.
2. Préparation d’un milieu contenant 14substrats marqués C
REMARQUE: Pour assurer des concentrations fiables de substrats énergétiques dans les milieux, les milieux sur mesure doivent être utilisés avec des substrats frais ajoutés peu de temps avant utilisation. Ici, un milieu essentiel minimum (MEMα) sur mesure sans glucose, pyruvate, glutamine, rouge de phénol ou bicarbonate de sodium est utilisé. Cependant, un milieu optimal doit être déterminé pour chaque type de cellule.
- Reconstituer 8,67 g de la poudre moyenne dans 1 L d’eau purifiée. Ajouter 2,2 g de bicarbonate de sodium pour obtenir un pH de 7,4 et filtrer la solution à l’aide d’une filtration sous vide de 0,22 μm.
- Ajouter des ingrédients frais pour obtenir le milieu complet (cMEMα) avec des concentrations finales de 5,5 mM de glucose, 2 mM de glutamine, 1 mM de pyruvate et 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Complétez en outre cMEMα avec 100 mM de L-carnitine et 10 μM d’HEPES pour faciliter l’oxydation des acides gras.
- Immédiatement avant utilisation, ajouter 14substrats marqués C au cMEMα fraîchement préparé pour obtenir un milieu chaud. Pour rendre le milieu oléate chaud, ajouter la solution mère d’oléate chaud de 10 mM à cMEMα pour une concentration finale de 100 μM d’oléate (dilution 1:100, radioactivité finale 0,4 μCi/mL).
REMARQUE : Le stock d’oléate chaud de 10 mM contenant un rapport de 1:11,5 d’oléate chaud/froid (voir l’étape 1.3) est utilisé pour atteindre un niveau physiologique de 100 μM d’oléate total dans le milieu tout en minimisant la quantité de matière radioactive.
- Préparer 10 mM d’oléate non marqué en ajoutant 24,36 mg d’oléate de sodium à 2 mL deH2O au bain-marie à 70 °C pendant environ 20 min jusqu’à dissolution complète avant de mélanger rapidement avec 6 mL de la solution mère de BSA de 4 mM préavertilée à 70 °C. Transférer dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Aliquote et conserver à -20 °C pour une utilisation à long terme.
- Pour rendre le glucose chaud, ajouter 14C-glucose à une concentration finale de 1,333 μM (dilution 1:4 125, radioactivité finale 0,4 μCi/mL). Pour rendre la glutamine en milieu chaud, ajouter 14C-glutamine à la concentration finale de 2 μM (dilution 1:1 000, radioactivité finale 0,4 μCi/mL).
- Compléter le milieu chaud de glucose et de glutamine avec une solution mère de 10 mM d’oléate non marqué de l’étape 2.4 pour atteindre la concentration finale de 100 μM d’oléate, la même que celle du milieu chaud oléate.
3. Préparation des cellules
REMARQUE: Les préostéoblastes calvariaires et les macrophages de la moelle osseuse sont utilisés comme exemples ici. Les utilisateurs doivent préparer le type de cellule de leur choix selon les protocoles appropriés. Optimiser la concentration de collagénase II à utiliser pour la digestion dans des expériences pilotes, car l’activité enzymatique peut varier d’un lot à l’autre.
- Isolement et culture des préostéoblastes calvariaires
- Sacrifiez les chiots du jour postnatal 3-5 (P3-5) par décapitation et transférez-les dans un DPBS glacé contenant de la pénicilline-streptomycine (P / S).
- Exposez le calvaire en enlevant la peau et les tissus mous. Prélever la région médiane en coupant les tissus environnants de l’arrière vers l’avant dans le DPBS (Figure 1A). Grattez doucement les surfaces interne et externe de la calvarie à l’aide d’une pince à épiler pour aider à libérer les cellules lors de la digestion ultérieure.
- Préparer une solution de 2 mg/mL et une solution de 4 mg/mL de collagénase de type II dans du DPBS et filtrer chaque solution avec un filtre frais de 0,22 μm. Digérer d’abord la calvaire nettoyée avec la solution de collagénase de 2 mg/mL pendant 15 min et jeter la solution de digestion. Digérer les échantillons nettoyés dans une solution de collagénase de 4 mg/mL 3 fois pendant 15 min à chaque fois, en regroupant et en sauvegardant la solution de digestion.
- Filtrer la solution de digestion à travers des tamis cellulaires de 70 μm et centrifuger le filtrat à 300 × g pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille de cellule en cMEMα (voir étape 2.2) contenant 10 % de FBS et de P/S.
- Compter et ensemencer les cellules à 4 × 104 cellules/cm2 dans des plaques de 10 cm. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 3 jours.
- Dissocier les cellules à 37 °C avec 0,25 % de trypsine-EDTA. Compter et ensemencer les cellules dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits avec cMEMα contenant 10% de FBS et P/S à 7,5 × 105/cm2. Ensemencez au moins 4 puits par type de cellule et par substrat et au moins trois puits supplémentaires pour chaque type de cellule pour le comptage cellulaire avant le test.
- Cultiver les cellules à 37 °C pendant la nuit avant les essais d’oxydation du substrat.
- Isolement et culture des BMM
REMARQUE: La culture des MMO nécessite un facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), qui peut être acheté commercialement en tant que protéine recombinante. Le milieu conditionné de la lignée cellulaire CMG14-12 conçu pour exprimer le M-CSF est une alternative économique utilisée ici13.
- Recueillir les fémurs et les tibias de souris de 8 semaines après avoir enlevé le muscle et les tissus conjonctifs. Coupez et jetez les deux extrémités des os avec des ciseaux tranchants.
- Débusquez la moelle osseuse d’un fémur et d’un tibia dans une boîte de Petri de 10 cm avec une seringue équipée d’une aiguille de 23 G contenant 15 mL de cMEMα avec 10% de FBS, P / S et 10% de milieu conditionné CMG14-12 (milieu BMM). Cultiver les cellules dans la boîte de Pétri dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2.
- Après 3 jours, jeter le milieu de culture et rincer avec du DPBS. Dissocier les cellules attachées à 37 °C avec 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 5 min. Centrifuger et remettre en suspension la pastille de cellule dans le milieu BMM.
- Compter et ensemencer les cellules dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits à 7,5 × 105/cm2 de la même manière que celle décrite au point 3.1.6. Culture à 37 °C pendant la nuit dans le milieu BMM avant de commencer les essais.
4. Dosage d’oxydation du substrat avec piège à CO2
REMARQUE: Une densité d’ensemencement appropriée doit être déterminée pour chaque type de cellule afin d’atteindre une confluence de 80 à 90% avant le début de l’essai. Notez que la densité cellulaire peut affecter l’état métabolique des cellules.
- Lavez les cellules dans les puits supplémentaires deux fois avec DPBS. Dissocier les cellules avec 0,25 % de trypsine-EDTA et mélanger des cellules de 20 μL remises en suspension dans du DPBS avec 20 μL de solution de colorant commercial prêt à l’emploi d’acridine orange/iodure de propidium (AO/PI). Déterminez le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre pour les calculs finaux.
- Lavez les cellules dans les puits d’essai deux fois avec DPBS. Ajouter 500 μL de milieu chaud à chaque puits d’essai dans la hotte de culture tissulaire désignée ram. Scellez les plaques avec un parafilm et incubez les cellules dans un incubateur désigné RAM à 37 °C pendant 4 h.
- Pendant l’incubation, coupez le papier filtre en morceaux circulaires légèrement plus grands que la zone à l’intérieur du capuchon des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et insérez le papier bien dans le capuchon (Figure 1B). Ajouter 200 μL d’acide perchlorique 1 M dans chaque tube et 20 μL d’hydroxyde de sodium sur le papier filtre inséré à l’intérieur du bouchon.
- Après l’incubation des cellules, transférer 400 μL de milieu de culture de chaque puits vers les tubes préparés et fermer immédiatement les bouchons. Laisser les tubes dans un porte-tubes à température ambiante pendant 1 h.
- Pendant l’incubation, installez un flacon de scintillation pour chaque tube et remplissez-le de 4 mL de liquide de scintillation. Transférer chaque morceau de papier filtre dans un flacon de scintillation et incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Effectuez des tests d’essuyage sur la hotte de culture tissulaire, le bain-marie (utilisé pour la préparation de 14C-oléate), le réfrigérateur, l’incubateur, l’évier, le sol et toute autre zone de travail pour une contamination potentielle par la RAM. Mettez les lingettes en papier dans des flacons de scintillation contenant du liquide de scintillation.
- Mesurez la radioactivité de 14C dans les flacons de scintillation avec un compteur de scintillation. Enregistrez les résultats de lecture. Décontaminer l’environnement de travail selon les directives de radioprotection si nécessaire.
5. Analyse des données
REMARQUE: En supposant que chaque substrat est complètement oxydé pour libérer du CO2, le taux d’oxydation du substrat peut être calculé à partir de la radioactivité du CO2 piégé.
- Calculez le taux d’oxydation du substrat à l’aide de Eq (1) et des valeurs X, Y et Z indiquées dans le tableau 1 pour différents substrats.
Taux d’oxydation du substrat (μmol/cellule/h) = 
(1)
- Calculer les désintégrations totales par min (DPM) pour chaque puits de réaction. Pour X, utilisez la valeur DPM (lecture du compteur de scintillation) à partir de 0,4 mL du milieu réactionnel utilisé pour le piégeage du CO2 sur 0,5 mL du milieu réactionnel total. Par conséquent, le DPM total de chaque puits de réaction est de X × 1,25.
- Divisez le DPM total par un facteur de 2 220 000 pour convertir en μCi.
- Convertir la radioactivité en μCi en nombre de 14molécules marquées C. Divisez la valeur μCi par l’activité spécifique (Y) de chaque substrat marqué. Utilisez les valeurs Y suivantes (tableau 1) : 14C-glucose : 300 mCi/mmol ; 14 C-glutamine : 200 mCi/mmol ; 14 C-oléate : 50 mCi/mmol.
- Calculer le nombre total de molécules oxydées à partir des 14molécules oxydées marquées C en multipliant ces dernières par le facteur de dilution chaud à total (Z). Utilisez les valeurs Z suivantes (tableau 1) : Glucose : 4 125; glutamine : 1 000; oléate: 12,5.
- Divisez le produit résultant par nombre de cellules (cellule#) et 4 (pour un temps de réaction de 4 h) pour déterminer le taux d’oxydation du substrat par cellule. Utilisez la cellule# déterminée dans les puits parallèles au début de l’essai.