Établissement d’un arrêt circulatoire hypothermique profond chez le rat

L’arrêt circulatoire hypothermique profond (DHCA) est utilisé en chirurgie cardiaque depuis 1953¹_. La DHCA consiste à réduire la température centrale du patient à des niveaux profondément hypothermiques (15-22 °C) avant d’interrompre globalement le flux sanguin vers le corps². L’arrêt circulatoire peut fournir un champ opératoire relativement sans effusion de sang. L’hypothermie profonde diminue le métabolisme, en particulier dans le cerveau et le myocarde, ce qui est une méthode efficace de protection contre l’ischémie³. Le DHCA est couramment appliqué lors de chirurgies pour les cardiopathies congénitales complexes, les maladies de l’arc aortique et même les tumeurs rénales ou surrénales avec un thrombus de veine cave ^4,5. Par conséquent, l’établissement de modèles animaux DHCA fournit une référence importante pour le raffinement de la procédure et la prévention des complications en milieu clinique.

Bien que des modèles puissent être établis avec des chiens⁶, des lapins⁷ et d’autres animaux, il est préférable d’utiliser des rats en raison de leur opérabilité et de leur faible coût. Le modèle de rat DHCA a été décrit pour la première fois en 2006 par Jungwirth et ^al.8. Il a été constaté que la durée de l’arrêt circulatoire avait un impact sur les résultats neurologiques. Depuis lors, les modèles de rats DHCA ont été largement étudiés. Il a été précisé que le DHCA pourrait provoquer un syndrome de réponse inflammatoire systémique (SIRS)⁹. Dans des études ultérieures, les pharmacologues ont constaté que la neuroinflammation liée au DHCA induite par SIRS pouvait être atténuée par le resvératrol¹⁰ et le triptolide¹¹. Notre équipe a également constaté que la neuroinflammation liée au DHCA pouvait être atténuée en inhibant la protéine de liaison à l’ARN inductible par le froid¹². Dans le système cardiovasculaire, la superoxyde dismutase a un effet cardioprotecteur sur les lésions d’ischémie / reperfusion (I / R) pendant DHCA¹³. Ces résultats ont élargi la compréhension des processus physiopathologiques liés à la DHCA et ont offert de nouvelles orientations pour améliorer les résultats de la DHCA. Cependant, les résultats concernant l’endotoxémie, le stress oxydatif et l’autophagie après DHCA ne sont pas concluants. DHCA utilise la même technologie opérationnelle que le bypass cardiopulmonaire (CPB)¹⁴, mais sa stratégie de gestion est différente et les étapes pour générer DHCA diffèrent selon les différentes équipes 8,9,10,11. La présente étude vise à fournir une méthode pour établir la procédure DHCA chez le rat.

Les protocoles ont fait l’objet d’un examen institutionnel et ont reçu l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux, Hôpital Fuwai, Académie chinoise des sciences médicales (FW-2021-0005). Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health.

REMARQUE : Les rats Sprague-Dawley mâles (poids : 500-600 g, âge : 12-14 semaines) ont été gardés dans des conditions de laboratoire standard avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les rats ont été répartis au hasard en deux groupes (n = 6, chaque groupe): le groupe DHCA et le groupe CPB à température normale (groupe NtCPB).

1. Travaux préparatoires

1. Stériliser les instruments chirurgicaux (pinces, ciseaux, micro-pinces, électrocoagulateur, rasoir, etc.) avant l’expérience (Figure 1).
2. Assurez-vous de la disponibilité des consommables, qui comprennent de la soie 2-0, une canule de 16 G (cathéter endotrachéal), une canule de 22 G, une canule maison de 16 G (cathéter intraveineux à orifices multiples), des seringues d’injection, de la gaze et du ruban adhésif.
   NOTE: Pour la canule maison de 16 G, utilisez un scalpel pour couper deux ou trois orifices de 2 mm de diamètre à l’extrémité de la canule, ce qui aidera à rendre le drainage veineux plus lisse.
3. Assurer la disponibilité du sévoflurane, de la lidocaïne à 2 %, de la solution saline, de l’héparine (5 UI/mL, 250 UI/mL), de l’épinéphrine (40 μg/mL), de la noradrénaline (20 μg/mL), de l’hydroxyéthylamidon et du bicarbonate.
4. Assurez-vous que les circuits DHCA contiennent un réservoir (modifié à partir du compte-gouttes de Murphy), une pompe à rouleaux, un échangeur de chaleur, un oxygénateur à membrane, des tubes de raccordement et un réservoir d’eau (Figure 2). Connectez le circuit et mélangez 12 mL d’hydroxyéthylamidon avec 1 mL d’héparine sodique (250 UI) et 1 mL de solution saline. Amorcez le circuit avec 14 mL de solution d’amorçage avec la pompe à rouleaux tournant doucement (10-40 mL/min).
   REMARQUE: Le réservoir est remoulé à partir d’un dispositif de transfusion sanguine avec le compte-gouttes de Murphy. La partie veineuse entrante du compte-gouttes reste à 10-15 cm et la partie de sortie veineuse reste à 10 cm.

2. Anesthésie et canulation

1. Anesthésiez les rats avec 2% à 3% de sévoflurane, puis testez l’absence de réflexe conjonctival et de relaxation musculaire après que le rat ait perdu conscience.
   REMARQUE: Le réflexe conjonctival fait référence à la fermeture instantanée de la paupière chaque fois que la cornée est touchée. Utilisez un coton-tige pour toucher légèrement la cornée. Lorsque la profondeur de l’anesthésie est suffisante, les paupières ne se ferment pas.
2. Effectuer une intubation endotrachéale avec une canule de 16 G après la disparition du réflexe conjonctival et l’absence de résistance musculaire. Connectez le tube à un ventilateur et réglez les paramètres en cliquant sur les boutons du ventilateur (volume courant : 1,0-1,2 mL/100 g, fréquence cardiaque : 80 battements par minute [bpm], I:E = 1:1, fraction d’oxygène inspirée : 60 %).
3. Mettez une couverture chauffante électrique sous le rat et fixez le rat avec du ruban adhésif. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Rasez les poils de la région inguinale gauche, de la région cervicale droite et de la queue avec un rasoir. Ensuite, désinfectez la peau trois fois avec de l’iode et de l’alcool.
4. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie avant de passer aux étapes suivantes. Si la fréquence respiratoire est supérieure à celle fixée par le ventilateur (80 bpm), ou s’il y a rigidité musculaire, augmentez la concentration de sortie de sévoflurane.
   REMARQUE: Lorsque la profondeur de l’anesthésie est adéquate, le rythme respiratoire doit être synchronisé avec le ventilateur et les muscles doivent être complètement détendus sans tension. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie toutes les 30 minutes pour vous assurer que le rat ne connaît aucun retour de conscience tout au long de la procédure.
5. Utilisez un scalpel pour couper la peau au niveau de la région inguinale gauche (environ 1 cm) et disséquez doucement le muscle et le tissu pour exposer la veine fémorale gauche et l’artère. Séparez soigneusement l’artère.
6. Canuler un cathéter intraveineux de 22 G dans l’artère fémorale gauche. Liférer l’artère et le cathéter avec une soie 2-0 (à la région de la canulation). Utilisez de l’héparine contenant une solution saline (5 UI/mL) pour rincer la canule afin d’éviter la coagulation. Connectez le cathéter au capteur de pression pour surveiller la pression artérielle.
7. Coupez la peau de la queue (environ 1,5 cm), puis utilisez un scalpel pour couper le fascia superficiel de l’artère de la queue afin d’exposer l’artère de la queue, qui se trouve au milieu du champ chirurgical.
8. Canuler l’artère de la queue avec un cathéter intraveineux de 22 G. Liférer l’artère et le cathéter avec une soie 2-0 (à la région de la canulation). Utilisez de l’héparine contenant une solution saline (5 UI/mL) pour rincer le cathéter afin d’éviter la coagulation.
   REMARQUE: Lors de la canulation du cathéter intraveineux, la main gauche tient l’artère / veine avec une pince, et la main droite perce l’artère / veine avec l’aiguille à l’intérieur du cathéter, puis insère la canule dans l’artère.
9. Coupez la peau sur la veine jugulaire droite (environ 2 cm), puis séparez le muscle et le tissu pour exposer la veine. Insérez un cathéter intraveineux multi-orifice maison de 16 G dans la veine jugulaire externe droite et placez-le soigneusement dans la veine cave inférieure droite ou dans l’oreillette droite.
   REMARQUE: La veine fémorale gauche et l’artère sont sous la surface de la région inguinale gauche. La veine est plus épaisse que l’artère et la couleur du sang des artères est rouge vif. La veine jugulaire droite se trouve au milieu de la région cervicale droite; Lorsque la peau est coupée et que les muscles sont séparés, la veine peut être vue (environ 0,3-0,4 cm de large). Lorsque l’extrémité du cathéter touche l’oreillette droite, la vague de pression artérielle fluctue. Ensuite, après avoir tiré un peu le cathéter vers l’arrière, l’extrémité du cathéter sera dans la veine cave supérieure.
10. Administrer de l’héparine sodique (500 UI/kg) par la veine externe droite. Couvrir chaque région canulée avec de la gaze humide pour éviter toute contamination.
    REMARQUE: Placez une boîte sous la table d’opération pour l’élever d’environ 40 cm.

3. Initiation de la DHCA

1. Connectez d’abord le circuit DHCA au cathéter dans l’artère de la queue et maintenez le débit de la pompe à 1-2 ml / min. Ensuite, connectez le réservoir avec le cathéter dans la veine jugulaire externe droite. Assurez-vous qu’il y a toujours un taux sanguin d’environ 1 cm dans le réservoir.
2. Allumez le réservoir d’eau et réglez d’abord la température de l’eau à 37 °C.
3. Une fois que la pression artérielle est stable, augmentez doucement le débit de la pompe jusqu’à 80-100 ml / kg / min pour pomper le sang.

4. Refroidissement

1. Réglez la température ambiante à environ 20 °C. Mettez des glaçons dans des gants jetables, puis placez-les sur la tête et les côtés du rat. Ajustez la température du réservoir en temps réel en fonction de la température rectale des rats.
2. Prélever 0,1 mL de sang dans l’artère fémorale gauche et le placer sur l’appareil à gaz sanguin pour l’analyse des gaz du sang. Modifier les paramètres pertinents du ventilateur de manière appropriée en fonction des résultats de l’analyse des gaz du sang (p. ex., PaCO₂).
   REMARQUE: La fréquence cardiaque et la pression artérielle peuvent changer, et le débit de la pompe doit être ajusté en conséquence. Le gradient de température entre le réservoir d’eau et le rat doit être inférieur à 10 °C. Assurez-vous que la température peut être réduite à 15-20 ° C en 30 minutes. La plage normale de PaCO₂ est de 35-45 mmHg. Si les résultats des gaz du sang montrent un PaCO₂ inférieur, on peut diminuer le volume courant et vice versa.

5. Arrêt circulatoire hypothermique profond

1. Lorsque la température rectale descend à 15-20 °C, changez les gants jetables (contenant de la glace) pour assurer le maintien d’une hypothermie profonde pendant l’arrêt circulatoire.
2. Arrêtez la pompe à rouleaux, maintenez le réservoir en contact avec l’environnement et drainez lentement le sang de la veine jugulaire externe vers le réservoir.
3. Faites attention à la forme d’onde de pression artérielle. Lorsque la pression artérielle et le rythme cardiaque sont de 0, arrêtez le drainage et maintenez le réservoir fermé. Éteignez le ventilateur.
   NOTE: La durée de l’arrêt circulatoire varie selon le but de l’expérience.

6. Échauffement et reperfusion

1. Retirez tous les gants jetables et augmentez la température ambiante à 25 °C. Rétablir la ventilation de l’oxygénateur à membrane tout en maintenant la coupure du tube de drainage veineux. Allumez la pompe à rouleaux pour vous assurer que le sang dans le réservoir retourne lentement dans le corps du rat.
2. Allumez le ventilateur. Une fois que le taux sanguin dans le réservoir reste à 1 cm, desserrez le tube de drainage et drainez lentement le sang de l’oreillette droite vers le réservoir.
3. Allumez la lampe chauffante, le coussin chauffant et le réservoir d’eau. Réglez d’abord la température du réservoir d’eau à 25 °C, puis ajustez sa température de sortie en temps opportun en fonction de la température rectale du rat.
   REMARQUE: La lampe chauffante doit être dirigée vers les gros vaisseaux sanguins de la cavité thoracique du rat et doit être maintenue à une certaine distance pour éviter de brûler les tissus. Faites attention à la différence de température entre la température de sortie et la température rectale du rat (<10 °C). Si nécessaire, testez les gaz du sang, puis ajustez les paramètres du ventilateur en conséquence, et administrez du bicarbonate, des électrolytes, etc.
4. Retirez la lampe chauffante lorsque la température rectale revient à 34 °C.
   REMARQUE: Cette étape, en tant que continuation du processus de réchauffement rapide, devrait être lente. À ce stade, les paramètres d’équipement du vaporisateur de sévoflurane, du ventilateur mécanique et de la pompe à rouleaux peuvent être rétablis aux niveaux au début du CPB.

7. Sevrage de la CPB

1. Réduisez lentement et graduellement le débit de la pompe à rouleaux et ajustez la vitesse de drainage veineux jusqu’à ce que le débit soit réduit à 1 mL/min.
   NOTE: Chaque réglage du débit doit être observé pendant 3-5 min.
2. Gardez le réservoir en contact avec l’environnement (en enlevant le bouchon du réservoir). Injecter le sang restant dans le circuit avec un débit de 1 mL/min.
3. Arrêtez l’oxygénation de la membrane et la pompe à rouleaux.
4. Euthanasier le rat après une période de ventilation mécanique sous anesthésie profonde.
   Remarque : Il s’agit d’une procédure terminale. La durée entre le sevrage de la CPB et l’euthanasie varie selon les différents protocoles d’étude. N’oubliez pas de désinfecter les plaies avec de l’iode et de l’alcool, puis de couvrir chaque région canulée avec de la gaze humide pour éviter la contamination avant l’euthanasie. Augmenter la concentration de sortie de sévoflurane pour augmenter la profondeur de l’anesthésie.

En tant que groupe témoin, les rats CPB (NtCPB) à température normale sans arrêt circulatoire ont montré une pression artérielle moyenne (MAP) et une température corporelle stables pendant toute la procédure, tandis que la MAP des rats DHCA a diminué pendant l’arrêt cardiaque (p < 0,01, Figure 3A). La température des rats DHCA a chuté rapidement pendant la phase de refroidissement et s’est rétablie progressivement pendant la phase de réchauffement. Lors du sevrage des rats des circuits DHCA, la température des rats DHCA est revenue à la normale (figure 3B).

L’effet du procédé DHCA sur les rats a été étudié par analyse des gaz du sang. Après le contact du sang total avec la solution d’amorçage, la concentration d’hémoglobine (Hb) était supérieure à 6 g/dL dans les deux groupes (Figure 4A). Lors du sevrage des rats du circuit DHCA, la concentration a augmenté à 9 g / dL en raison de la perfusion du sang restant dans le circuit CPB dans le rat. L’hématocrite (HCT) a montré une tendance similaire à l’Hb (Figure 4B). Au début de la procédure CPB, les différences entre Hb et HCT peuvent être dues aux poids différents des rats. Le poids moyen des rats DHCA était de 571,1 g ± 7,254 g, tandis que le poids moyen des rats du groupe NtCPB était de 535,0 g ± 8,317 g (p = 0,075). Bien que les différences dans la concentration d’Hb entraîneraient des différences dans la capacité du sang à transporter l’oxygène, les tendances de changement des deux groupes étaient les mêmes, ce qui indique que le DHCA n’a pas également influencé la concentration d’Hb. Après DHCA et reperfusion, le niveau d’acide lactique a augmenté rapidement, et cela était plus prononcé dans le groupe DHCA (Figure 4C). Le pH a diminué après la procédure DHCA, ce qui était très probablement le résultat de l’accumulation d’acide lactique (Figure 4D). Pendant toute l’expérience, les concentrations de Na+, Cl−, K+ et de glucose n’ont montré aucune différence significative à aucun moment (Figure 5). Ces résultats suggèrent que le DHCA n’a provoqué qu’une augmentation de l’acide lactique, mais n’a pas influencé le pH sanguin et la concentration d’hémoglobine, d’hématocrite, de Na+, de Cl−, de K+ et de glucose.

L’autophagie est un processus dans lequel les cellules eucaryotes utilisent des lysosomes pour dégrader leurs protéines cytoplasmiques et leurs organites endommagés15. Dans les conditions physiologiques et certaines pathologiques, un léger niveau d’autophagie est essentiel pour le maintien de l’homéostasie cellulaire. Cependant, une autophagie excessive peut entraîner un stress métabolique, la dégradation des composants cellulaires et même la mort cellulaire16. Afin d’évaluer l’impact de la DHCA sur l’autophagie neuronale, nous avons utilisé la microscopie électronique à transmission et, étonnamment, trouvé un nombre accru d’autophagosomes dans l’hippocampe des rats DHCA (Figure 6). Sur la base des fonctions bidirectionnelles des autophagosomes, la question de savoir si les autophagosomes accrus jouent un rôle neuroprotecteur et compensatoire ou pathologique au cours de la DHCA nécessite encore des recherches supplémentaires.

Figure 1 : Instruments chirurgicaux utilisés dans le modèle DHCA. a) iode, b) seringues d’injection, c) ruban adhésif, d) gaze humide, e) pinces, f) ciseaux, g, h) micro-pinces, i) électrocoagulateur, j) rasoir et k) soie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Circuit de dérivation cardiopulmonaire du modèle DHCA chez le rat. (A) a: oxygénateur à membrane; b: Échangeur de chaleur; c: Réservoir; d1: Le tube de fixation de la pompe à rouleaux (diamètre extérieur [OD), 6 mm; diamètre intérieur [ID], 4 mm; longueur, 15 cm); d2: Le tube reliant l’échangeur de chaleur et l’oxygénateur à membrane (OD, 6 mm; ID 4 mm; longueur, 8 cm); d3: Ligne de sortie de l’artère (OD, 2,5 mm; ID, 1,5 mm; longueur, 20 cm). b) a: réservoir; b: Oxygénateur à membrane; c: Échangeur de chaleur; d: Pompe à rouleaux. La flèche jaune indique la direction du flux sanguin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Signes vitaux des rats DHCA et des rats CPB à température normale. (A) La pression artérielle moyenne et (B) la température rectale ont été surveillées en permanence tout au long de la procédure. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± d’erreur-type de la moyenne (MEB), n = 6 par groupe. DHCA = 30 min. Les différences entre les deux groupes à chaque point temporel ont été comparées à l’aide d’un test t de Student non apparié. Abréviations : DHCA = arrêt circulatoire hypothermique profond; NtCPB = pontage cardiopulmonaire à température normale; MAP = pression artérielle moyenne. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; p > 0,05 non représenté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Le pH et les concentrations d’hémoglobine, d’hématocrite et d’acide lactique chez le rat. Des échantillons de sang d’artère pour l’analyse de (A) l’hémoglobine, (B) l’hématocrite, (C) l’acide lactique, (D) et le pH ont été prélevés via l’artère fémorale à trois moments : l’initiation de la CPB, avant la DHCA, et le sevrage de la CPB. DHCA = 30 min. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM, n = 6 par groupe. La différence entre les deux groupes à chaque point temporel a été comparée à l’aide d’un test t de Student non apparié. Abréviations : DHCA = arrêt circulatoire hypothermique profond; NtCPB = pontage cardiopulmonaire à température normale; Hb = hémoglobine; Hct = hématocrite; Lac = acide lactique. * p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Concentration de Na+, Cl−, K+ et de glucose chez le rat. Des échantillons de sang d’artère pour l’analyse du glucose (A) Na+, (B) Cl−, (C) K+ et (D) ont été prélevés via l’artère fémorale à trois moments : l’initiation du CPB, avant le DHCA, et le sevrage du CPB. DHCA = 30 min. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM, n = 6 par groupe. Les différences entre les deux groupes à chaque point temporel ont été comparées à l’aide d’un test t de Student non apparié. Abréviations : DHCA = arrêt circulatoire hypothermique profond; NtCPB = pontage cardiopulmonaire à température normale; Glu = glucose. p > 0,05 non représenté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Autophagosomes dans l’hippocampe de rats. Les rats ont été euthanasiés 30 minutes après le sevrage du circuit CPB, et les hippocampes ont été récoltés immédiatement. Ensuite, les hippocampes ont été fixés dans du glutaraldéhyde pour une microscopie électronique à transmission ultérieure afin d’étudier l’expression des autophagosomes dans l’hippocampe de (A) rats NtCPB et (B) rats DHCA. DHCA = 30 min. Barres d’échelle : 1 μm et 250 nm. Les flèches pointent vers des autophagosomes. Abréviations : DHCA = arrêt circulatoire hypothermique profond; NtCPB = pontage cardiopulmonaire à température normale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.