Profilage spatial numérique pour la caractérisation du microenvironnement dans le gliome à infiltration diffuse de type adulte

Résumé

La dysrégulation protéomique joue un rôle important dans la propagation des gliomes infiltrant de manière diffuse, mais plusieurs protéines pertinentes restent non identifiées. Le traitement spatial numérique (DSP) offre une approche efficace et à haut débit pour caractériser l’expression différentielle des protéines candidates qui peuvent contribuer à l’invasion et à la migration des gliomes infiltrants.

Résumé

Les gliomes infiltrant de manière diffuse sont associés à une morbidité et une mortalité élevées en raison de la nature infiltrante de la propagation tumorale. Ce sont des tumeurs morphologiquement complexes, avec un degré élevé de variabilité protéomique à la fois dans la tumeur elle-même et dans son microenvironnement hétérogène. Le potentiel malin de ces tumeurs est renforcé par la dérégulation des protéines impliquées dans plusieurs voies clés, y compris les processus qui maintiennent la stabilité cellulaire et préservent l’intégrité structurelle du microenvironnement. Bien qu’il y ait eu de nombreuses analyses de gliome en vrac et unicellulaire, il y a une relative rareté de stratification spatiale de ces données protéomiques. Comprendre les différences dans la distribution spatiale des facteurs tumorigènes et des populations de cellules immunitaires entre la tumeur intrinsèque, la bordure invasive et le microenvironnement offre des informations précieuses sur les mécanismes sous-jacents à la prolifération et à la propagation des tumeurs. Le profilage spatial numérique (DSP) représente une technologie puissante qui peut constituer la base de ces importantes analyses multicouches.

DSP est une méthode qui quantifie efficacement l’expression des protéines dans les régions spatiales spécifiées par l’utilisateur dans un échantillon de tissu. DSP est idéal pour étudier l’expression différentielle de plusieurs protéines dans et entre les régions de distinction, permettant plusieurs niveaux d’analyse quantitative et qualitative. Le protocole DSP est systématique et convivial, permettant une analyse spatiale personnalisée des données protéomiques. Dans cette expérience, des puces à ADN tissulaires sont construites à partir de biopsies de forage de glioblastome archivées. Ensuite, un panel d’anticorps est sélectionné, ciblant les protéines d’intérêt dans l’échantillon. Les anticorps, qui sont préconjugués aux oligonucléotides d’ADN photoclivables par UV, sont ensuite incubés avec l’échantillon de tissu pendant une nuit. Dans le cadre de la visualisation par microscopie à fluorescence des anticorps, les régions d’intérêt (ROI) dans lesquelles quantifier l’expression des protéines sont définies avec les échantillons. La lumière UV est ensuite dirigée vers chaque ROI, clivant les oligonucléotides d’ADN. Les oligonucléotides sont microaspirés et comptés dans chaque ROI, quantifiant la protéine correspondante sur une base spatiale.

Introduction

Les gliomes infiltrant de manière diffuse sont le type le plus courant de tumeur cérébrale maligne chez l’adulte et sont invariablement mortels. La propension des cellules de gliome à migrer largement dans le cerveau est un défi thérapeutique majeur. Le mécanisme par lequel ils se propagent implique une migration dirigée et une invasion incontrôlée. Il a été démontré que les cellules de gliome invasives présentent un tropisme et une migration le long des faisceaux de substance blanche¹, des recherches récentes impliquant la démyélinisation de ces voies comme une caractéristique protumorigène active². L’invasion est médié....

Protocole

Le protocole décrit ci-dessous suit les lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche sur les êtres humains de Dartmouth-Hitchcock. Le consentement éclairé a été obtenu des patients dont les échantillons de tissus ont été inclus dans cette étude. Voir la section Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des diapositives¹⁷

1. Récupérer ou préparer du tissu fixé au formol et incorporé dans la paraffine de gliomes de type adulte humain infiltrant de manière diffuse.
   ....

Résultats

La figure 4 montre les résultats représentatifs d’une expérience DSP réalisée sur des échantillons de glioblastome. Une carte thermique est présentée, illustrant l’une des méthodes permettant de capturer visuellement des données à l’aide du logiciel DSP. Les lignes représentent les cibles protéiques, et chaque colonne correspond à une région d’intérêt. Une gamme de couleurs de bleu à rouge indique une expression faible à élevée, respectivement. La variabilité de la couleur au sein d’une rang.......

Discussion

Compte tenu de la diversité des protéines qui pourraient potentiellement influencer l’agressivité des gliomes et de l’idée que plusieurs de ces protéines restent non découvertes, une méthode de quantification des protéines à haut débit est une approche technologique idéale. De plus, étant donné que les données spatiales dans les échantillons oncologiques sont souvent corrélées avec l’expression différentielle¹⁸, l’intégration du profilage spatial dans l’approche de quantification des protéines per.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BOND Research Detection System	Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne	DS9455	Système de détection ouvert contenant des récipients ouverts dans un plateau de réactifs
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne	AR950 Solution	tampon concentrée 10X pour le lavage des tissus fixes
Buffer W	NanoString, Seattle, WA
	Abcam, Cambridge, Royaume-Uni	AB188287	Cy3 Kit de conjugaison d’anticorps fluorescents
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, W
		100471
AGeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Contrôles pour l’exécution d’expériences GeoMX DSP
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA		121300101 Module de protéines avec cibles pour les cellules immunitaires humaines et les cibles immuno-oncologiques
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Module protéique avec des cibles pour plusieurs types de tumeurs humaines et pour les marqueurs de transition épithéliale-mésenchymateuse
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	réactifs de préparation d’échantillons pour l’analyse des protéines GeoMX DSP
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Allemagne	Contacter la société	Colorer IHC entièrement automatisé
Master Kit--12 réactions	NanoString, Seattle, WA	100052	Matériaux et réactifs à utiliser avec le système d’analyse nCounter
Système d’analyse nCounter	NanoString, Seattle, WA	Entreprise de contact	Système automatisé de quantification de l’expression cible multiplex (à utiliser avec GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hongrie		Pour créer le bloc de microréseaux de tissus