Traitement antirétroviral combiné oral chez des souris humanisées infectées par le VIH-1

L’espérance de vie des personnes infectées par le virus de l’immunodéficience humaine chronique (VIH) s’est considérablement améliorée grâce au traitement antirétroviral combiné (TARc)^1,2. cART réduit avec succès la réplication du VIH-1 et augmente le nombre de lymphocytes T CD4+ jusqu’à la normale chez la majorité des participants infectés de façon chronique par le VIH-1³, ce qui entraîne une amélioration de la santé globale et une réduction spectaculaire de la progression de la maladie⁴. Cependant, le réservoir latent du VIH-1 est établi même lorsque le TAR est initié pendant l’infection aiguë ^5,6,7. Les réservoirs persistent pendant des années pendant le TAR et le rebond viral rapide après l’interruption du TAR est bien documenté ^8,9. Les personnes vivant avec le VIH sous TAR sont également prédisposées à un risque plus élevé de comorbidités telles que les maladies cardiovasculaires, le cancer et les troubles neurologiques^10,11,12. Par conséquent, un remède fonctionnel contre le VIH est nécessaire. Les modèles animaux pour l’infection par le VIH-1 offrent des avantages évidents dans l’élaboration et la validation de nouvelles stratégies de guérison du VIH^13,14,15. Les souris humanisées, en tant que modèle de petit animal, peuvent fournir une reconstitution de cellules immunitaires humaines multilignées dans différents tissus, ce qui permet d’étudier de près l’infection par le VIH^16,17,18,19. Parmi les modèles humanisés, le modèle humanisé de la moelle osseuse, du foie et du thymus (BLT) récapitule avec succès l’infection chronique par le VIH-1 ainsi que les réponses immunitaires humaines fonctionnelles à l’infection par le VIH-1 20,21,22,23,24. Par conséquent, le modèle murin BLT humanisé a été largement utilisé pour étudier divers aspects dans le domaine de la recherche sur le VIH. Les souris BLT humanisées ne sont pas seulement des modèles bien établis pour la récapitulation de l’infection persistante par le VIH-1 et la pathogenèse, mais aussi des outils conséquents pour l’évaluation des stratégies d’intervention basées sur la thérapie cellulaire. Les auteurs actuels et d’autres ont démontré que le modèle humanisé des souris BLT récapitule l’infection persistante par le VIH-1 et la pathogenèse 25,26,27 et fournit des outils pour évaluer les stratégies d’intervention basées sur la thérapie cellulaire 28,29,30,31,32,33.

Les schémas thérapeutiques cART consistant en des combinaisons de médicaments antirétroviraux pris quotidiennement suppriment la réplication du VIH-1 au point que la charge virale chez les personnes traitées avec succès reste indétectable à long terme³⁴. Les résultats du traitement de souris humanisées infectées par le VIH avec des schémas thérapeutiques cART cliniquement pertinents ressemblent à ceux observés chez les personnes infectées par le VIH-1 traitées par TAR²² : Les taux de VIH-1 sont supprimés en dessous des limites de détection et l’interruption du TAR entraîne un rebond de la réplication du VIH à partir du réservoir latent³⁵. L’injection sous-cutanée (SC)27,36,37 ou intrapéritonéale (IP)^37,38,39 est la voie couramment utilisée pour le traitement antirétroviral chez les souris humanisées. Cependant, l’injection quotidienne intensive induit un stress chez les animaux par la contention physique⁴⁰. Il est également exigeant en main-d’œuvre et potentiellement dangereux pour les chercheurs en raison de l’exposition accrue au VIH lors de l’utilisation d’objets tranchants. L’administration orale est idéale pour imiter l’absorption, la distribution et l’excrétion des médicaments antirétroviraux pris par les personnes infectées par le VIH-1. L’administration orale implique généralement des procédures personnalisées et souvent laborieuses pour mettre les médicaments antirétroviraux dans des aliments stérilisés (nécessaires en raison de l’immunodéficience des souris) 24,37,41 ou de l’eau 42,43,44,45,46 , qui peut ou non être chimiquement compatible avec de nombreux médicaments antirétroviraux, ou entraîner quelque chose que les souris ne mangeraient pas ou ne boiraient pas facilement (ce qui affecterait la dose et les niveaux de médicament dans le corps). La nouvelle méthode d’administration perorale de cART proposée ici surpasse les tentatives d’administration précédentes en raison de sa compatibilité avec différents types de médicaments antirétroviraux, de son innocuité et de sa facilité de préparation et d’administration, ainsi que de la réduction du stress et de l’anxiété chez les animaux résultant de l’injection quotidienne.

Le fumarate de ténofovir disoproxil (TDF), l’elvitégravir (ELV) et le raltégravir (RAL) sont des médicaments peu solubles dans l’eau. Fait intéressant, une biodisponibilité accrue du TDF est observée avec les aliments gras, ce qui suggère que l’inhibition compétitive des lipases par les aliments gras peut fournir une certaine protection contre le TDF⁴⁷. Par conséquent, les gobelets DietGel Boost ont été choisis pour remplacer le chow de rongeur ordinaire comme méthode d’administration en fonction de leur teneur modeste en matières grasses (20,3 g pour 100 g) par rapport au chow de rongeur ordinaire (10 g pour 100 g) et à un régime alimentaire typique de souris riche en graisses (40-60 g pour 100 g)⁴⁸. Le poids total d’une tasse est de 75 g; Ainsi, chaque tasse contiendra la quantité de nourriture, et donc de médicament, suffisante pour cinq souris sur 3 jours.

Des tissus fœtaux humains anonymisés ont été acquis commercialement. La recherche sur les animaux a été menée conformément aux protocoles approuvés par l’Université de Californie à Los Angeles et le Comité de recherche animale (ARC) de l’UCLA, conformément à toutes les directives fédérales, étatiques et locales. Plus précisément, toutes les expériences ont été menées conformément aux recommandations et aux lignes directrices pour l’hébergement et les soins des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH) et de l’Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International en vertu du protocole UCLA ARC numéro 2010-038-02B. Toutes les chirurgies ont été effectuées sous anesthésie à la kétamine (100 mg / kg) / xylazine (5 mg / kg) et à l’isoflurane (2-3 vol%) et tous les efforts ont été faits pour minimiser la douleur et l’inconfort des animaux.

1. Souris humanisées infectées par le VIH-1

NOTE: Les souris humanisées ont été construites comme décrit précédemment dans^30,31,49. Le protocole est brièvement décrit ci-dessous.

1. Purifier les cellules progénitrices hématopoïétiques CD34+ du foie fœtal humain via des microbilles anti-CD34 selon le protocole du fabricant.
2. Anesthésier les souris mâles et femelles NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) âgées de 6 à 8 semaines et les irradier sublétalement (2,7 Gy) avant la chirurgie.
3. Implanter le thymus, dérivé du même donneur que le foie fœtal, sous la capsule rénale avec le foie.
4. Après l’implantation, injecter des souris de 0,5 million à un million de cellules CD34+, par voie intraveineuse.
5. Après 8-10 semaines, recueillir 100 μL de sang de souris par saignement rétro-orbital⁵⁰ dans des tubes de microcentrifugation contenant 5 μL d’EDTA et centrifuger à 350 x g pendant 3 min.
6. Conservez le plasma à -80 °C pour surveiller la charge virale après que la souris a été infectée par le VIH-1. Ajouter 2 mL de solution de NH4C à 83% et incuber pendant 5 minutes à température ambiante pour lyser les globules rouges.
7. Ajouter 10 mL de RPMI avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) pour arrêter la lyse. Faire tourner à 300 x g pendant 5 min.
8. Aspirer le surnageant. Colorer les cellules avec un panel d’anticorps (voir le tableau des matériaux) et analyser par cytométrie en flux pour vérifier la greffe de cellules immunitaires humaines.
9. Infecter des souris présentant plus de 50 % des cellules CD45+ circulantes par injection veineuse rétro-orbitaire^51,52 avec au moins 200 ng de p24 d’une souche VIH-1 (c.-à-d. NFNSXSL9 30,53,54) à l’aide d’une seringue à insuline. Prélever du sang toutes les deux semaines pour l’analyse de cytométrie en flux et pour mesurer la charge virale.

2. Préparation des médicaments antirétroviraux

1. Peser les médicaments individuels; par exemple, pour fabriquer 10 gobelets alimentaires contenant du TAR, utilisez des racleurs à cellules stériles pour peser 250 mg de FTC (emtricitabine), 375 mg de TDF et 500 mg de RAL ou d’ELV dans des tubes à centrifuger stériles individuels de 15 ml dans une enceinte de biosécurité.
2. Ajouter 1 mL de DMSO dans un tube de 250 mg FTC (concentration finale de 250 mg/mL), ajouter 1,5 mL de DMSO dans un tube de 375 mg TDF (concentration finale de 250 mg/mL) et ajouter 1 mL de DMSO dans un tube de 500 mg de RAL ou de VLE (concentration finale de 500 mg/mL). Remuer ou pipeter le mélange de médicaments jusqu’à dissolution complète et obtention d’une solution claire.
3. Utilisez un filtre à membrane en PVDF hydrophile de 0,22 μM pour stériliser les solutions avec une seringue stérile. Les solutions médicamenteuses individuelles peuvent être conservées à -20 °C pendant 12 semaines.
4. Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, décongeler fraîchement une partie aliquote de chaque solution médicamenteuse à 37 °C jusqu’à ce que la solution soit limpide. Bien mélanger à l’aide d’une pipette.
5. Combinez les médicaments et mélangez bien pour former le mélange principal : 1 mL de FTC dans le DMSO, 1,5 mL de TDF dans le DMSO et 1 mL de VLE ou RAL dans le DMSO.
   NOTE: Ce montant fera 10 gobelets de nourriture.
6. Ajouter 350 μL de solution de mélange principal cART dans une tasse pour obtenir une tasse DietGel Boost cART.
7. Ajouter 0,75 mL de triméthoprime-sulfaméthoxazole (concentration finale de 0,48 mg/mL) dans la tasse.
8. Bien mélanger à l’aide d’embouts de pipette stériles de 1 mL.
9. Aliquote la gobelette alimentaire contenant cART de la tasse d’origine avec une micro-spatule sur une boîte de Petri de 60 mm au besoin. Peser les aliments sur une balance pour calculer la quantité de gobelet contenant du TAR pour chaque cage en fonction du nombre de souris.

3. Administration de médicaments antirétroviraux à des souris infectées par le VIH-1

1. Retirez le chow ordinaire de la cage et remplacez-le par un gobelet contenant du cART.
   REMARQUE: En moyenne, une souris mangera jusqu’à 5 g de nourriture par jour. Environ une tasse alimentaire peut être administrée à cinq souris pendant 2 jours.
2. Rafraîchissez les aliments cART trois fois par semaine.
3. Peser les tasses usagées pour surveiller la consommation. Peser les souris chaque semaine pour confirmer la consommation.

4. Surveiller la charge virale par PCR en temps réel

1. Évaluer les cellules immunitaires humaines (taux de lymphocytes T CD4 et CD8) et la réplication du VIH-1 chez les souris BLT toutes les 2 semaines par saignement rétro-orbitaire. Récoltez le plasma en suivant les instructions des étapes 1.5 à 1.8.
2. Surveiller les charges virales plasmatiques des souris infectées par le VIH-1 avant et pendant l’administration orale de cART pendant 8 semaines. Extraire l’ARN viral plasmatique du plasma à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN viral et le quantifier par PCR en temps réel à l’aide des amorces et des sondes (voir le tableau des matériaux) comme décrit précédemment 27,30,31. Utilisez le protocole de cyclisme suivant : 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), puis 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) pendant 45 cycles.

5. Évaluer les rapports CD4/CD8 par cytométrie en flux

1. Préparer des suspensions unicellulaires de sang périphérique de saignements bihebdomadaires en suivant les étapes 1.5-1.8.
2. Colorer les cellules avec des marqueurs de surface et analyser par cytométrie de flux. Utilisez les anticorps marqueurs de surface 27,30,43,49 suivants en cytométrie de flux : CD45 (clone HI30), CD8 (clone SK1), CD3 (clone OKT3), CD4 (clone RPA-T4)^27,30,42,49.

En supposant qu’une souris pesant moyenne 25 g consomme 4 g de nourriture par jour, la dose quotidienne de médicament par voie orale correspond à 2,88 mg / kg de TFV, 83 mg / kg FTC et 768 mg / kg RAL. Pour vérifier si le régime alimentaire optimisé est toxique et influence la santé globale par rapport à l’injection quotidienne de cART, le poids des souris a été surveillé chaque semaine avant et pendant le TAR par injection orale ou sous-cutanée. Il n’y avait pas de différence de poids significative avant l’administration de cART dans chaque groupe (Figure 1). Cependant, le poids de la souris diminuait continuellement pendant l’injection quotidienne de cART SC. En revanche, FTC/TDF/ELV ou FTC/TDF/RAL dans DietGel a restauré le poids de la souris aux niveaux d’initiation pré-TAR après 5 semaines d’administration orale de cART. De plus, aucun changement de poids significatif n’a été observé entre les groupes raltégravir ou elvitégravir.

Pour vérifier si l’administration orale de cART supprime la charge virale aussi efficacement qu’une injection quotidienne, les charges virales plasmatiques bihebdomadaires ont été évaluées à l’aide de la RT-PCR. La figure 2 montre que le régime alimentaire FTC/TDF/ELV a supprimé efficacement à 100 % la réplication virale à des niveaux indétectables en 4 semaines; Le régime alimentaire FTC / TDF / RAL ART peut supprimer 80% des souris à des niveaux indétectables en 4 semaines, alors que seulement 70% des souris recevant une injection SC ont atteint des niveaux indétectables après 4 semaines de traitement. Les résultats ont démontré que l’administration orale supprime la réplication virale plus rapidement et plus efficacement que l’injection SC. De plus, le régime alimentaire cART a empêché la baisse supplémentaire des rapports CD4/CD8 dans le sang périphérique plus tôt que l’injection quotidienne de SC (Figure 3). Ces résultats suggèrent que le schéma thérapeutique cART oral proposé peut supprimer avec succès la virémie plasmatique en dessous du niveau de détection, restaurer rapidement les taux de lymphocytes T CD4 et améliorer la santé globale des animaux chez les souris humanisées infectées par le VIH-1.

Figure 1 : Changements de poids corporel de souris avant et pendant le traitement antirétroviral après l’infection par le VIH-1 dans différents groupes. Des souris humanisées ont été infectées parle VIH NFNSXSL9 après reconstitution immunitaire. Après 4 semaines d’infection par le VIH-1, les souris ont été traitées pendant 7,5 semaines supplémentaires avec un régime FTC/TDF/RAL par injection sous-cutanée (SC), soit par administration orale de FTC/TDF/RAL ou de FTC/TDF/ELV. Le poids corporel de la souris a été mesuré à partir de 1 semaine avant l’infection par le VIH. Toutes les comparaisons statistiques ont été effectuées à l’aide du test de Mann-Whitney, moyenne du groupe déclarant (± S.E.). Les astérisques verts montrent des différences statistiques entre le groupe FTC/TDF/ELV food oral et le groupe FTC/TDF/RAL SC injection. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n = 6-7 dans chaque groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : L’administration orale de cART alimentaire montre une suppression virale plus rapide. Comme décrit à la figure 1, les souris n’ont pas été traitées ou traitées avec un schéma FTC/TDF/RAL par injection sous-cutanée et par administration orale de gobelets alimentaires simulés, de régimes alimentaires FTC/TDF/RAL ou FTC/TDF/ELV pendant 7,5 semaines supplémentaires. (A) Charge virale plasmatique au fil du temps après l’infection par le VIH-1 dans différents groupes. (B) Résumé de la charge virale au fil du temps après l’infection par le VIH-1 dans différents groupes, moyenne géométrique du groupe déclarant avec intervalle de confiance (IC) à 95 %. Les flèches noires indiquent le moment de l’initiation du TAR pour les groupes traités par le TARc. (C) Analyse de la survie du temps écoulé après le traitement antirétroviral jusqu’à la charge virale indétectable pour chaque groupe. n = 6-7 dans chaque groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Les administrations orales de TRA montrent une restauration plus rapide du rapport CD4/CD8. Rapport CD4/CD8 dans le sang périphérique au fil du temps après l’infection par le VIH-1 pour chaque groupe. Toutes les comparaisons statistiques ont été effectuées à l’aide du test de Mann-Whitney, moyenne du groupe déclarant (± S.E.). Les astérisques rouges montrent des différences statistiques entre le groupe d’injection orale FTC/TDF/RAL et le groupe d’injection FTC/TDF/RAL SC. *P < 0,05. n = 6-7 dans chaque groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

SK est l’un des fondateurs de CDR3 Inc. Les autres auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.