Au niveau des synapses excitatrices dans le cerveau des mammifères, le glutamate libéré présynaptiquement active les récepteurs intégrés dans la membrane postsynaptique 1,2. La force de ces connexions synaptiques subit une plasticité dépendante de l’expérience, une propriété qui permet diverses formes d’apprentissage et de mémoire 3,4,5,6,7,8,9. Des modifications pathologiques du nombre de synapses et de leurs propriétés de signalisation entraînent une altération de l’activité des circuits et du traitement de l’information dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques 10,11,12. En tant que tel, il est essentiel de comprendre les mécanismes sous-jacents qui régissent la connectivité neuronale et la force des connexions synaptiques.
Les synapses excitatrices se forment sur les épines dendritiques, de minuscules protubérances postsynaptiques contenant des protéines d’échafaudage, des récepteurs, des facteurs de signalisation, des protéines cytosquelettiques et des organites de trafic 1,2,13,14,15,16. Ces compartiments de signalisation de la taille d’un micron permettent de contrôler la force synaptique synapse par synapse 13,16. La morphologie de l’épine dendritique varie le long de la longueur des dendrites neuronales, les formes d’épines étant généralement décrites comme minces, filopodiales, trapues, champignon ou ramifiées13. Il est important de noter que la forme de la colonne vertébrale est corrélée à la fonction synaptique et à la stabilité. Par exemple, des épines plus grandes ont un nombre accru de récepteurs et une plus grande force synaptique 16,17,18. Contrairement aux épines minces, les épines plus grandes peuvent persister pendant des mois in vivo, une propriété qui peut permettre des connexions synaptiques stables et un stockage de mémoire à long terme19,20.
La morphologie et la densité de la colonne vertébrale le long d’une dendrite sont couramment suivies pour sonder le degré de connectivité neuronale et les propriétés des synapses excitatrices dans une région particulière du cerveau, dans les états normaux et pathologiques13. Diverses méthodes ont été mises au point pour visualiser la morphologie de la colonne vertébrale dans différentes préparations de tissus et systèmes modèles à l’aide de la microscopie optique standard et de la microscopie à fluorescence, ainsi que de la super-résolution et de la microscopie électronique (EM)21. Ces puissantes techniques d’imagerie ont fourni un aperçu considérable de notre compréhension actuelle de l’organisation, du fonctionnement et de la maladie du cerveau. Cette collection de méthodes comprend d’importantes techniques d’imagerie pour surveiller la complexité morphologique des dendrites et des épines, ainsi que des outils optogénétiques pour activer et mesurer l’activité neuronale dans les dendrites et les épines simples.
Pekarek et al.22 présentent un protocole relativement rapide et à haut débit pour imager et quantifier la structure des dendrites neuronales profondes dans le tissu nerveux intact. Les auteurs effectuent Clear Lipid-exchanged Acrylamide Rigid Imaging/immunomaring/in situ hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY), une technique de nettoyage tissulaire qui élimine les lipides du tissu cérébral et aide à minimiser la diffusion de la lumière lors de l’imagerie ultérieure23. Après élimination, des empilements Z de neurones exprimant des protéines fluorescentes ont été collectés par microscopie confocale ou à deux photons. L’analyse d’images et la quantification automatisée ont permis de mesurer avec précision la densité et la forme de la colonne vertébrale, ainsi que la complexité de l’arbre dendritique. Ce protocole permet l’imagerie simultanée de structures allant des épines simples aux arbres dendritiques et supprime l’étape chronophage et potentiellement dommageable de la coupe en lames minces. Cette technique sera très utile aux chercheurs qui cherchent à quantifier les changements dans la morphologie de la colonne vertébrale et la complexité dendritique dans les tissus cérébraux intacts à la suite de l’introduction ou de l’élimination d’un ou plusieurs gènes d’intérêt.
Développée il y a plus de 100 ans24, la coloration de Golgi reste un outil puissant pour visualiser l’organisation du système nerveux et la morphologie neuronale. Dans cette méthode, des populations clairsemées de neurones sont colorées par microcristallisation du chromate d’argent, ce qui permet de visualiser les axones, les arbres dendritiques et les épines25. Frankfurt et Bowman26 détaillent un protocole d’imprégnation rapide de Golgi pour visualiser les neurones et les épines dendritiques dans l’hippocampe et le cortex préfrontal médian du rat. Les auteurs montrent comment préparer, colorer et imager les tissus pour la microscopie optique ultérieure, ainsi que quantifier la densité de la colonne vertébrale le long des arbres dendritiques. Le protocole décrit ici permet une imprégnation cohérente et fiable des neurones et réduit l’exposition aux produits chimiques toxiques.
Alors que la microscopie optique et la microscopie à fluorescence sont bien adaptées à l’imagerie des dendrites et des épines, l’EM permet de visualiser à résolution nanométrique les structures pré- et postsynaptiques21. Les approches EM sont généralement utilisées pour mesurer les propriétés ultrastructurales des synapses, y compris les dimensions de la densité postsynaptique, ainsi que le nombre et la taille des vésicules synaptiques21. Dans cette collection, Śliwińska et al.27 fournissent un protocole permettant d’acquérir des images EM tridimensionnelles (3D) par balayage du visage Serial Block-Slectron Microscopie (SBEM) dans le tissu de souris hippocampique28,29. Plus précisément, ils décrivent comment préparer des échantillons, intégrer des tissus dans de la résine, monter et découper des échantillons, effectuer des SBEM et analyser des images pour générer des reconstructions 3D. Ce protocole génère des images à contraste élevé avec des membranes bien définies et peut être adapté à une variété de types de tissus.
Au cours du développement du système nerveux, les neurones subissent des changements morphologiques spectaculaires à mesure que les connexions synaptiques se forment et s’affinent par l’activité neuronale30,31. Pour suivre la maturation neuronale dans le cervelet en développement, Chan et al.32 fournissent un protocole pour l’électroporation postnatale in vivo des neurones granulaires en développement. Ici, les chercheurs ont injecté et électroporé de l’ADN dans le cerveau postérieur de bébés souris postnatals pour transfecter une population clairsemée de neurones avec des protéines fluorescentes. La microscopie confocale à haute résolution et l’imagerie 3D ont permis aux chercheurs de caractériser la morphologie des dendrites et des griffes dendritiques à plusieurs stades du développement postnatal. Il est important de noter que cette approche pourrait permettre l’insertion ou la suppression de gènes susceptibles d’avoir un impact sur la maturation et la fonction des cellules granulaires et sera d’un grand intérêt pour les chercheurs qui étudient le développement cérébelleux et la maturation des neurones granulaires.
Enfin, les protocoles de Cuentas-Condori et Miller33 utilisent l’imagerie à super-résolution34, l’optogénétique35 et l’imagerie de cellules vivantes de la dynamique calcique36 pour étudier l’activité des neurones GABAergiques chez le nématode C. elegans. À l’aide d’un microscope confocal équipé pour l’imagerie à super-résolution37, les auteurs expriment des protéines fluorescentes dans les dendrites pour mesurer la fréquence de différentes formes de épines. De plus, les auteurs évaluent la fonction neuronale par l’expression d’une protéine optogénétique présynaptique et d’un indicateur calcique postsynaptique. Après l’activation lumineuse des terminaisons, des transitoires calciques ont été observés dans les épines dendritiques individuelles. Ces protocoles, ainsi que les découvertes récentes38, mettent en évidence l’utilisation passionnante de C. elegans en tant que système modèle puissant pour suivre la morphologie de la colonne vertébrale et l’activité synaptique.
Pris ensemble, les protocoles décrits dans cette collection de méthodes s’ajouteront à la boîte à outils déjà riche disponible pour visualiser la structure et la fonction neuronales21. La mise en œuvre de ces méthodes dans de futures études fournira probablement des informations supplémentaires sur les processus qui régissent la plasticité synaptique liée à l’apprentissage et les mécanismes cellulaires qui sous-tendent les états pathologiques.