Essais in vitro standardisés pour visualiser et quantifier les interactions entre les neutrophiles humains et les biofilms de Staphylococcus aureus

Un biofilm est une communauté de microbes associés à la surface ou d’agrégats non attachés enfermés dans une substance polymère extracellulaire (EPS)^1,2. Ces communautés protègent les micro-organismes enfermés des facteurs de stress environnementaux, y compris la tolérance aux agents antimicrobiens et au système immunitaire³. Plusieurs espèces microbiennes pathogènes forment des biofilms qui ont été associés à des infections chroniques⁴. Le développement de biofilms est un processus complexe impliquant la fixation aux surfaces, la production d’EPS, la prolifération cellulaire, la structuration du biofilm et le détachement cellulaire⁵. Une fois que les cellules se dispersent pour former un biofilm, elles restent planctoniques ou se transloquent vers un nouveau substrat et relancent le développement du biofilm⁶.

Staphylococcus aureus, un pathogène opportuniste, suit un schéma général de développement du biofilm, y compris la fixation, la prolifération, la maturation et la dispersion⁷. Le processus de fixation dans les biofilms de S. aureus est dicté par les interactions hydrophobes, les acides teichoïques et les composants de surface microbiens reconnaissant les molécules de matrice adhésive (MSCRAMM)^8,9. Alors que la prolifération de S. aureus commence, l’EPS, qui se compose principalement de polysaccharides, de protéines, d’ADN extracellulaire et d’acides teichoïques, est produit⁵. Au fur et à mesure que les composants EPS sont produits, diverses exoenzymes et petites molécules sont également produites, contribuant à la structure 3 dimensions du biofilm et aidant au détachement⁵. S. aureus profite de ce mode de vie hautement coordonné pour établir diverses infections chroniques, y compris des infections dues à l’habitation de dispositifs médicaux¹⁰.

Le S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) est l’une des principales causes d’infections liées aux dispositifs médicaux à demeure, tels que les cathéters veineux et urinaires centraux, les prothèses articulaires, les stimulateurs cardiaques, les valves cardiaques mécaniques et les dispositifs intra-utérins¹¹. Au cours de telles infections, les neutrophiles sont les premières cellules immunitaires hôtes recrutées sur le site d’infection pour combattre les agents pathogènes via de multiples stratégies¹². Il s’agit notamment de la phagocytose, de la dégranulation, de la production d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (ROS/RNS) ou de la libération de pièges extracellulaires à neutrophiles (TNE) pour éliminer les agents pathogènes¹³.

La génération de ROS lors de la phagocytose des microbes est l’une des principales réponses antimicrobiennes présentées par les neutrophiles¹⁴. La phagocytose est améliorée si les microbes sont enrobés d’opsonines, en particulier d’immunoglobulines et de composants du complément présents dans le sérum¹⁵. Les microbes opsonisés sont ensuite reconnus par les récepteurs de surface cellulaire sur les neutrophiles et engloutis, formant un compartiment appelé phagosome¹⁵. Les neutrophiles génèrent et libèrent des ROS dans le phagosome via la NADPH-oxydase¹⁶ associée à la membrane. Ce complexe enzymatique multi-composants génère des anions superoxydes en transférant des électrons à l’oxygène moléculaire¹⁶. De plus, les neutrophiles génèrent également du RNS par l’expression de l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS)¹⁷. Ces radicaux riches en superoxyde et en oxyde nitrique dans le phagosome ont de vastes activités antimicrobiennes. Ils peuvent interagir avec les centres métalliques dans les enzymes et endommager les acides nucléiques, les protéines et les membranes cellulaires de l’agent pathogène 18,19,20,21. De nombreux microbes adoptent un mode de vie de biofilm et emploient différentes stratégies pour échapper à la mise à mort par ROS^22,23. Ainsi, les tests standardisés qui couplent les biofilms avec les neutrophiles pour quantifier les ROS sont bénéfiques pour des résultats cohérents.

Alors que les essais, tels que la quantification de la production de ROS de neutrophiles, fournissent des informations sur les réponses des neutrophiles aux biofilms, la capacité de visualiser les interactions des neutrophiles dans un biofilm peut également servir d’outil puissant. L’utilisation de colorants fluorescents pour la microscopie nécessite souvent une optimisation pour obtenir des images de haute qualité pouvant être utilisées pour l’analyse d’imagerie microscopique. La flexibilité pour optimiser certaines conditions est limitée car les neutrophiles peuvent subir la mort cellulaire après l’isolement. De plus, les biofilms sont généralement lavés pour éliminer la population planctonique de la configuration expérimentale avant l’ajout de neutrophiles. Pendant le lavage, une variabilité entre les biofilms répliqués peut survenir en raison de la perte de biomasse partielle si les biofilms adhèrent faiblement à la surface.

De manière générale, les méthodes actuelles dans le domaine pour analyser les interactions entre les neutrophiles et les biofilms comprennent principalement la microscopie, la cytométrie en flux et le dénombrement des unités formant des colonies (UFC)^24,25,26,27. La microscopie implique l’utilisation de colorants qui colorent directement les neutrophiles et les biofilms, ou ciblent diverses réponses des neutrophiles contre les microbes telles que la formation de TNE, la dégranulation et la mort cellulaire^25,28. Un sous-ensemble de ces réponses, telles que la mort et la dégranulation des cellules neutrophiles, peut également être analysé par cytométrie en flux, mais nécessite que les neutrophiles soient préférentiellement non associés à de grands agrégats de microbes dans un biofilm^28,29. La cytométrie de flux permet également de quantifier certains paramètres du biofilm, tels que la viabilité cellulaire²⁷. Ces processus, cependant, nécessitent une perturbation de la biomasse du biofilm et ne seraient pas utiles pour visualiser d’autres interactions importantes telles que la distribution spatiale des neutrophiles et de leurs composants dans un biofilm^27,29,30.

Le présent protocole se concentre sur l’adaptation de certaines des méthodes traditionnellement utilisées pour étudier les interactions neutrophiles-biofilm sur des biofilms qui ont été optimisées pour fournir une variabilité minimale pendant la manipulation. Ce protocole fournit donc des méthodes standardisées pour cultiver et quantifier des biofilms, isoler les neutrophiles humains primaires du sang périphérique, quantifier la production de ROS et visualiser les interactions biofilm-neutrophiles par microscopie. Ce protocole peut être adapté à différents systèmes pour comprendre les interactions biofilm-neutrophiles tout en tenant compte de l’hétérogénéité entre les bassins de donneurs.

Toutes les procédures ont été approuvées par l’Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les donneurs pour le prélèvement de sang périphérique afin d’isoler les neutrophiles humains primaires. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)³¹ a été utilisé comme organisme modèle pour effectuer les expériences. Les expériences ont été réalisées avec un équipement de protection individuelle (EPI) approprié en raison d’une exposition potentielle à un agent pathogène transmissible par le sang.

1. Préparation du biofilm in vitro

1. Obtenir des colonies isolées de S. aureus à partir d’un stock cryoconservé 31 en utilisant une technique de plaque de stries^32,33 sur une plaque de gélose riche en nutriments^, comme la gélose de soja tryptique (voir le tableau des matériaux).
2. Enduire les puits individuels d’une plaque de 96 puits avec 100 μL de poly-L-lysine (PLL) à 0,001 % (v/v) diluée dans du_H2Ostérile et incuber à température ambiante pendant 30 min. Aseptiquement, aspirer la solution PLL à l’aide d’un piège d’aspiration assisté par le vide. Laissez les puits sécher pendant la nuit à température ambiante.
   REMARQUE: Toutes les étapes d’aspiration du protocole sont effectuées à l’aide d’un piège à aspiration assisté par le vide, sauf indication contraire.
3. Préparer une culture de nuit en inoculant une colonie de S. aureus dans un milieu alpha essentiel minimal (MEMα) supplémenté en glucose à 2% et incuber à 37 °C, en agitant à 200 rpm pendant 16-18 h.
4. Diluer la culture pendant la nuit en transférant 50 μL à 5 mL de MEMα frais additionné de glucose à 2 % et incuber à 37 °C, en agitant à 200 tr/min, jusqu’à la phase logarithmique moyenne, généralement entre une densité optique de 600 (DO_{600 nm}) de 0,5 à 0,8. Utilisez MEMα pour normaliser la culture logarithmique moyenne à une OD de_{600 nm de} 0,1.
5. Transférer 150 μL de culture normalisée dans chaque puits de la plaque de 96 puits traitée par la LPL. Incuber statiquement pendant 18-20 h dans une chambre humidifiée à 37 °C.
   REMARQUE: Les biofilms peuvent également être cultivés dans d’autres formats tels que les lames à μ canaux (voir le tableau des matériaux).
6. Aspirer le surnageant pour éliminer les cellules planctoniques. Lavez délicatement la biomasse restante avec 150 μL de solution saline équilibrée (HBSS) de Hanks pour éliminer les cellules non attachées. Ajoutez HBSS goutte à goutte pour éviter de perturber le biofilm.
   REMARQUE: Lors de l’aspiration du surnageant et du HBSS pendant les lavages, laissez juste assez de liquide (surnageant ou HBSS) dans les puits contenant le biofilm de sorte que le biofilm soit encore immergé. Cela empêche la perturbation de la structure du biofilm lorsque HBSS est ajouté goutte à goutte pour laver le biofilm.
7. Répétez l’étape 1.6 au moins deux fois de plus pour retirer toutes les cellules planctoniques. À ce stade, les biofilms sont prêts pour des expériences immédiates en aval.
   REMARQUE: Si les biofilms ne sont pas utilisés pour les expériences sur les neutrophiles, HBSS peut être remplacé par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). L’HBSS est préféré au PBS car l’HBSS contient des composants, y compris le glucose, qui fournissent des conditions optimales pour l’activation des neutrophiles³⁴.

2. Quantification de la biomasse du biofilm

1. Préparer un stock de solution de violet cristallin (CV) à 0,1 % (p/v) (voir le tableau des matières) en le dissolvant dans de l’éthanol à 20 % (v/v) et dans du H 2O à 80 % (v/v). Assurez-vous que le CV est complètement dissous dans de l’éthanol avant d’ajouter H₂O. Stériliser la solution par filtre.
2. Ajouter 150 μL de solution CV à 0,1% au biofilm lavé et incuber pendant 20 min à température ambiante. Utiliser au moins trois puits vides comme contrôles multimédias seulement.
3. Aspirer la solution CV à 0,1% des biofilms et laver les biofilms colorés avec 200 μL de 1x PBS. Répétez ce processus pendant un total de trois lavages pour éliminer tout excès de CV des puits.
4. Ajouter 150 μL d’acide acétique glacial à 33 % (v/v) dilué avec_H2O. Incuber à température ambiante sur une bascule à 50 rpm pendant 30 min pour permettre au CV lié à la biomasse de se dissoudre complètement.
   ATTENTION : Effectuez cette étape dans une hotte à flux laminaire avec EPI approprié car l’acide acétique glacial est un produit chimique corrosif.
5. En attendant, configurez le lecteur de microplaques (voir le tableau des matériaux) pour lire les valeurs de coloration CV. Après le traitement à l’acide acétique glacial, lire la plaque à une longueur d’onde de 595 nm.
   REMARQUE: La longueur d’onde utilisée pour mesurer la DO de CV peut aller de 500 à 600 nm³⁵.

3. Isolement des neutrophiles

NOTE: Les neutrophiles ont été isolés selon une méthode publiée précédemment avec des modifications mineures³⁶. Ce protocole d’isolement combine d’abord la centrifugation par gradient de densité, suivie d’une sédimentation de 3% de dextrane. Cette section ne couvre que le protocole global d’isolement des neutrophiles, en se concentrant sur les modifications apportées au protocole publié. De plus, le protocole décrit ci-dessous est l’une des nombreuses méthodes qui peuvent isoler les neutrophiles et peuvent être substituées au besoin. D’autres méthodes d’isolement des neutrophiles comprennent l’utilisation de milieux de séparation cellulaire ou de séparation cellulaire d’anticorps magnétiques³⁷.

1. Prélever du sang d’un donneur adulte par ponction veineuse, conformément au protocole décrit dans la CISR de l’établissement. Avant la prise de sang, assurez-vous que la seringue contient suffisamment d’héparine sans agent de conservation, de sorte que la concentration finale d’héparine soit de 20 U/mL.
2. Diluer le sang hépariné avec les 3/4 du volume de NaCl à 0,9 % exempt d’endotoxines (voir tableau des matières) dans_H2Oà température ambiante.
3. Pour chaque tranche de 20 mL de l’échantillon de sang dilué, aliquote de 14 mL d’un milieu de gradient de densité disponible dans le commerce (voir le tableau des matières) dans un tube conique frais de 50 mL. Déposer soigneusement l’échantillon de sang dilué sur le milieu de gradient de densité.
4. Centrifuger l’échantillon de sang stratifié à 400 x g pendant 40 min à température ambiante. Assurez-vous que la centrifugeuse a une rupture lente pour éviter de perturber la couche une fois la centrifugation terminée.
   REMARQUE: L’échantillon de sang aura cinq couches contenant un mélange de solution saline et de plasma, une couche cellulaire mononucléaire, un milieu de gradient de densité, des neutrophiles et des érythrocytes.
5. À l’aide d’une pipette sérologique, aspirer toutes les couches au-dessus des neutrophiles et de la pastille érythrocytes, suivie d’une remise en suspension douce de la pastille dans du NaCl froid exempt d’endotoxines à 0,9% dans_H2O. Pour chaque pastille produite à partir d’un échantillon de sang de 20 mL, remettre la pastille en suspension à 20 mL de volume total. Ajouter 1:1 volume de 3 % de dextrane (voir le tableau des matières). Incuber le tube à la verticale pendant 18-20 min sur la glace.
   NOTE: Assurez-vous que le dextrane à 3% est fabriqué avec 0,9% de NaCl sans endotoxines dans H₂O.
6. Retirer 20 mL de la couche supérieure contenant les neutrophiles et certains érythrocytes sur un nouveau tube conique de 50 mL et centrifuger à 355 x g pendant 10 min à 4 °C. Versez le surnageant en laissant derrière lui une pastille rouge.
7. Remettez doucement la pastille en suspension dans 10 mL de_H2Ofroid et stérile pendant 30 s pour lyser les érythrocytes restants. Ajouter immédiatement 10 mL de solution saline froide à 0,9 % sans endotoxines au mélange pour rétablir la tonicité. Centrifuger la solution à 233 x g pendant 3 min à 4 °C.
8. Verser le surnageant et remettre en suspension la pastille contenant 95 % à 97 % de neutrophiles dans 1 mL de HBSS froid par 20 mL d’échantillon de sang.
9. Transférer 10 μL des neutrophiles en suspension dans 90 μL de colorant d’exclusion bleu trypan à 0,4 % et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Les cellules non viables sont colorées en bleu car le colorant d’exclusion bleu trypan est imperméable dans les cellules viables. Ce protocole assure >99% de viabilité cellulaire^37,38.
10. Ajouter du HBSS supplémentaire de telle sorte que la concentration finale de neutrophiles soit de 4 x 10⁶ cellules/mL.
    REMARQUE : Dans les cas où la viabilité cellulaire est de <99 %, la concentration finale de 4 x 10⁶ cellules/mL peut encore être atteinte; cependant, le volume total de solution contenant 4 x 10⁶ cellules/mL obtenu diminuera. La concentration finale des neutrophiles peut être ajustée en fonction des besoins expérimentaux de l’utilisateur. Les neutrophiles ont été remis en suspension à une concentration finale de 4 x 10⁶ cellules/mL pour toutes les expériences décrites ci-dessous. Pour tenir compte de la variabilité d’un donneur à l’autre, il est fortement recommandé que toutes les expériences impliquant des neutrophiles soient effectuées avec au moins trois donneurs différents.

4. Mesure des ROS produites par les neutrophiles

1. Ajouter 100 μL de sérum humain normal à 20 % (dilué dans HBSS) goutte à goutte au biofilm lavé (étape 1.6) et incuber à 37 °C en condition statique pendant 30 min pour opsoniser le biofilm.
2. Aspirer la solution de sérum à 20% et laver les biofilms goutte à goutte avec 150 μL de HBSS une fois. Aspirer le HBSS, laissant derrière lui des puits avec des biofilms opsonisés.
   NOTE: Pour l’interprétation de l’expérience, un minimum de quatre groupes est recommandé: (A) Neutrophiles + Biofilm, (B) Neutrophiles + PMA (témoin positif, voir Tableau des matériaux), (C) Neutrophiles seulement, et (D) Biofilm seulement.
3. Ajouter du luminol (voir le tableau des matières) aux neutrophiles remis en suspension dans le HBSS à une concentration de 4 x 10⁶ cellules/mL de telle sorte que la concentration finale de luminol soit de 50 μM. Cette solution est prête à l’emploi pour les groupes (A) et (C). Ajouter 4 x 10⁵ neutrophiles mélangés avec du luminol dans les puits avec des biofilms opsonisés.
4. Dans un tube séparé, préparer une solution de luminol 50 μM dans HBSS sans aucun neutrophile et l’ajouter au biofilm contenant bien (groupe D).
5. Aliquote 350 μL de neutrophiles mélangés avec du luminol et ajouter du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) à une concentration finale de 500 ng / mL au mélange. Pour le groupe (B), ajouter 4 x 10⁵ neutrophiles de ce mélange dans des puits sans biofilm. Cela sert de contrôle positif.
   NOTE: La concentration de PMA indiquée dans cette étape est relativement élevée pour assurer une réponse robuste en rafale car les neutrophiles stimulés par la PMA sont un témoin positif. La PMA peut être utilisée à une concentration plus faible pour activer les neutrophiles, selon l’expérience.
6. Centrifuger la plaque à 270 x g pendant 30 s à 4 °C.
7. Assurez-vous que le lecteur de plaques est réglé à 37 °C avec le réglage de la luminescence et de la lecture cinétique pendant 60 minutes à intervalles de 3 minutes. Placer la plaque dans le lecteur de plaques pour mesurer la production de ROS par les neutrophiles pendant 60 min.
   NOTE: Pour ce test, les biofilms ont été cultivés dans des plaques blanches utilisées pour les essais de luminescence. La PMA est un agoniste connu de la réponse oxydative en rafale³⁹. Lorsque vous effectuez des études impliquant de la PMA, assurez-vous que la PMA est ajoutée à l’étape finale pendant que la solution contenant les neutrophiles est froide, car la PMA déclenche immédiatement la réponse en rafale.

5. Imagerie des interactions biofilm-neutrophiles

1. Configurez un biofilm en suivant les étapes 1.2 à 1.6. Pour faciliter l’imagerie du biofilm, utilisez une souche fluorescente de S. aureus, telle que USA300 exprimant la protéine fluorescente verte (GFP)^40,41, pour faciliter l’imagerie microscopique.
   REMARQUE : Une lame à 6 canaux μ canaux (voir le tableau des matériaux) a été utilisée au lieu d’une plaque de 96 puits pour démontrer le modèle de biofilm in vitro (étape 1).
2. Incuber 4 x 10⁶ cellules/mL de neutrophiles avec 100 μM de colorant CMAC bleu (7-amino-4-chlorométhylcoumarine) (BCD, voir le tableau des matériaux) pendant 30 min dans une bascule à 37 °C et 5% CO₂. Assurez-vous que les échantillons sont incubés dans l’obscurité et limitez l’exposition à la lumière pour les étapes restantes.
3. Pour laver l’excès de BCD, centrifuger les neutrophiles à 270 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant. Remettez les neutrophiles en suspension dans du HBSS frais. À ce stade, ajouter de l’homodimère-1 d’éthidium (voir le tableau des matériaux) aux neutrophiles colorés au BCD à une concentration finale de 4 μM pour surveiller la mort des neutrophiles et des bactéries.
4. Ajouter 150 μL de neutrophiles au biofilm de S. aureus qui a été cultivé en lames μ, de sorte que le rapport neutrophiles / bactéries soit de 1:30 (neutrophiles: bactéries). Incuber les lames μ dans une chambre humidifiée pendant 30 min. Le nombre de cellules bactériennes est basé sur le nombre de cellules obtenues en plaquant un biofilm de 18 h.
5. Imagez l’interaction neutrophiles-biofilm à l’aide de canaux fluorescents correspondant aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission des colorants/protéines fluorescents.
   REMARQUE : Pour la présente étude, la BCD est de 353/466 nm, l’homodimère-1 d’éthidium est de 528/617 nm et la GFP est de 395/509 nm. Limiter l’exposition de l’échantillon au laser ou à la lumière pour éviter le photoblanchiment des échantillons.
6. Analysez les images à l’aide de logiciels ou de programmes d’analyse d’images de microscopie tels que FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ et BAIT, parmi beaucoup^{d’autres 42,43,44,45}.
   REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec des taches, il est important de tenir compte de la spécificité des colorants utilisés. Certaines colorations agissent sur les cellules procaryotes et eucaryotes, tandis que d’autres ne fonctionnent que sur une seule. Si les neutrophiles et les biofilms sont colorés séparément à l’aide de colorants qui peuvent colorer les deux types de cellules, assurez-vous de laver tout colorant restant avant de combiner les neutrophiles et les biofilms pour éviter la coloration croisée.

Les milieux utilisés pour cultiver des biofilms bactériens influencent la survie des neutrophiles. Différents milieux ont été testés pour réduire l’effet des milieux seuls sur la viabilité des neutrophiles pour l’étude des interactions neutrophiles-biofilm (Figure 1). Les milieux de croissance bactériens tels que le bouillon de soja tryptique minimisent la viabilité des neutrophiles, de sorte que ~60% des neutrophiles sont vivants après une période d’incubation de 30 minutes à 37 ° C avec 5% de CO2. Les milieux de culture de cellules de mammifères, tels que MEMα, n’affectent pas la viabilité des neutrophiles et favorisent la croissance des biofilms de S. aureus. En fait, un milieu minimal favorise une croissance robuste des biofilms dans d’autres bactéries46,47.

Pour évaluer l’effet des milieux sur la croissance et la variabilité du biofilm dans la quantification de la biomasse du biofilm après lavage de la biomasse pour éliminer les cellules planctoniques, un biofilm de S. aureus de 18 h a été cultivé dans une plaque de 96 puits, avec des puits traités ou non traités avec de la poly-L-lysine. Un milieu riche en nutriments (bouillon de soja tryptique (BST)) et minimal (MEMα) a été utilisé tel quel ou complété par du glucose à 2%. La biomasse du biofilm colorée avec CV a révélé que le biofilm de S. aureus cultivé dans MEMα complété par 2% de glucose produisait le biofilm le plus robuste parmi tous les milieux testés (Figure 2A). De plus, les biofilms cultivés dans des puits prétraités par PLL contenant MEMα + 2% de glucose ont montré moins de variabilité que les biofilms dans des puits non traités PLL contenant MEMα + 2% de glucose. Ces biofilms ont montré moins de variabilité dans la quantification via le test CV35 et le CFU/mL lorsqu’ils ont été plaqués après avoir manipulé avec précision les biofilms pour la quantification de la biomasse. Ces biofilms contenaient, en moyenne, 1 x 108 UFC/mL, comme démontré par le placage des biofilms en 3 jours distincts (Figure 2B). Ce nombre est utile pour déterminer le nombre de neutrophiles à ajouter aux biofilms pour les tests de fonctionnalité des neutrophiles.

Pour mesurer la production de ROS par les neutrophiles en réponse aux biofilms, les biofilms de S. aureus ont été cultivés statiquement pendant 18 à 20 heures dans une plaque de 96 puits. Des biofilms ont ensuite été opsonisés et des neutrophiles ont été ajoutés. La production de ROS a ensuite été mesurée pendant 60 min (figure 3A). L’aire sous la courbe est calculée à partir de la courbe cinétique pour quantifier la production totale de ROS par les neutrophiles. Les neutrophiles traités avec un agoniste, tel que la PMA, utilisée comme témoin, montrent une production accrue de ROS. En l’absence de biofilms, les neutrophiles traités avec du PMA ont montré une production robuste de ROS. En présence de biofilm de S. aureus , la production globale de ROS par les neutrophiles traités avec PMA a diminué. En l’absence de PMA, les neutrophiles dépendent uniquement de leur interaction avec le biofilm, ce qui réduit encore la quantité de ROS produite (Figure 3B).

Pour visualiser les interactions neutrophiles-biofilm à l’aide de la microscopie à fluorescence, une souche exprimant la GFP de S. aureus, colorant CMAC bleu et homodimère-1 d’éthidium, qui colore respectivement le cytoplasme des cellules vivantes et l’ADN des cellules mortes. Le biofilm de S. aureus a été cultivé pendant 18 heures dans une lame de 6 μ canaux. Des neutrophiles marqués au colorant CMAC bleu ont été ajoutés avec de l’homodimère-1 d’éthidium aux biofilms lavés et incubés pendant 30 minutes à 37 °C avec 5% de CO2 avant l’imagerie. La microscopie fluorescente à grand champ a révélé que de nombreux neutrophiles étaient localisés à la surface des biofilms de S. aureus, tandis que quelques-uns se trouvent dans le biofilm (figure 4A). L’interaction entre les cellules de S. aureus dans les neutrophiles était également apparente (Figure 4C). La plupart des cellules de S. aureus interagissant avec les neutrophiles (cyan) étaient mortes (magenta), tandis que quelques-unes sont restées vivantes (jaune) comme déterminé par la coloration de mort vivante (Figure 4C). À titre de comparaison, les biofilms de S. aureus exprimant la GFP ont été colorés avec de l’homodimère-1 d’éthidium, ce qui a révélé une fraction de la population morte de S. aureus dans le biofilm (figure 4B). Les neutrophiles non viables qui étaient positifs pour l’homodimère-1 d’éthidium ont été quantifiés à l’aide d’un logiciel d’analyse (voir le tableau des matériaux) après incubation avec des biofilms de S. aureus. Environ 48% des neutrophiles étaient déjà morts dans les 30 minutes suivant l’incubation avec le biofilm de S. aureus. Lors de l’optimisation du protocole de microscopie, l’effet du lavage du biofilm et des neutrophiles après 30 min d’incubation pour éliminer les neutrophiles non adhérents a également été évalué, révélant environ 33% des neutrophiles morts encore attachés au biofilm (Figure 4D).

Figure 1 : Le test LIVE-DEAD compare la survie des neutrophiles entre les milieux de croissance bactériens et mammifères. Les neutrophiles ont été isolés et incubés dans HBSS, MEMα, TSB ou SDS à 0,1% pendant 30 min. La coloration LIVE-DEAD a été réalisée en utilisant Calcein AM (vivant) et ethidium homodimer-1 (mort). Le pourcentage de neutrophiles vivants a été déterminé, où les neutrophiles incubés par HBSS ont été traités comme des neutrophiles vivants à 100%. Les résultats représentent en moyenne deux expériences indépendantes réalisées en triplicate, avec des neutrophiles obtenus à partir de deux donneurs différents. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET (*p < 0,05, ****p < 0,0001. ANOVA à sens unique). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Quantification de la biomasse du biofilm dans différentes conditions et comptage de viabilité bactérienne des biofilms cultivés dans les conditions optimisées. (A) S. aureus a été ensemencé dans une plaque de 96 puits, enduite ou non de poly-L-lysine (PLL). Les biofilms ont été cultivés dans le BST, le MEMα ou l’un ou l’autre des milieux supplémentés avec du glucose à 2 % dans des conditions statiques pendant 18 heures. La coloration au cristal violet (CV) a été effectuée pour colorer la biomasse du biofilm. La coloration CV éluée a été diluée à 1:10 et lue dans un lecteur de microplaques. Les résultats représentent en moyenne trois expériences indépendantes réalisées en triplicate. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. L’écart-type de chaque groupe est indiqué en bas pour démontrer la variabilité des différentes conditions de croissance du biofilm. (B) Le nombre d’UFC bactériennes a été obtenu à partir de biofilms cultivés dans un milieu optimisé (MEMα + 2% de glucose). Les biofilms statiques de 18 h ont été soumis au même nombre de lavages suivis d’une sonication de 10 minutes pour desserrer la biomasse du biofilm et ont traversé une aiguille 22G pour perturber les agrégats avant le placage. Les résultats représentent trois répétitions réalisées en trois exemplaires. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ET (ns = non significatif. ANOVA à sens unique). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Quantification de la production de ROS par les neutrophiles par dosage par chimiluminescence. (A) Les neutrophiles (PMN) ont été incubés avec des biofilms de S. aureus lavés par HBSS, soit en présence (triangle gris fermé) ou en absence (triangle gris inversé ouvert) de PMA pour mesurer la production de ROS par les neutrophiles. Le luminol a été utilisé pour détecter les ROS toutes les 3 minutes pendant 60 minutes dans un lecteur de microplaques. Alors que les neutrophiles traités avec PMA en l’absence d’un biofilm (cercle noir fermé) ont servi de contrôle positif, les groupes neutrophiles seuls (cercle noir ouvert) et biofilm seulement (triangle gris ouvert) ont servi de témoins négatifs. Les données représentent en moyenne deux expériences indépendantes réalisées en triple exemplaire avec des neutrophiles obtenus à partir de deux donneurs différents. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. (B) L’aire sous la courbe de (A) a été calculée pour quantifier les MDO totaux générés par les neutrophiles. Les données sont représentées sous forme de moyenne ± écart-type. (***p < 0,0001. ANOVA à sens unique). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Visualisation de l’interaction entre le biofilm de S. aureus et les neutrophiles par microscopie à fluorescence à grand champ. Les neutrophiles marqués au colorant CMAC bleu (cyan) ont été complétés par de l’homodimère-1 d’éthidium (magenta; mort) avant d’être incubés avec un biofilm de S. aureus de 18 h (jaune). Les interactions biofilm-neutrophiles ont été imagées à l’aide de microscopie fluorescente à grand champ et les images traitées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Des expériences ont été réalisées avec trois donneurs différents. Des images représentatives sont présentées comme (A) vue 3D du biofilm de S. aureus avec des neutrophiles vivants (cyan) et morts (magenta; quelques-uns indiqués par des flèches blanches), (B) vue 3D d’un biofilm de S. aureus en l’absence de neutrophiles avec S. aureus vivant exprimant GFP (jaune) ou S. aureus mort coloré avec de l’ethidium homodimer-1 (magenta), (C) une vue orthogonale de S. aureus et l’interaction des neutrophiles telle que décrite par les plans xy, yz et xz, et (D) la quantification de la viabilité des neutrophiles en présence de biofilm de S. aureus après 30 minutes, soit immédiatement (non lavé), soit après trois cycles de lavage avec HBSS pour éliminer les neutrophiles non adhérents (lavés). La mort cellulaire des neutrophiles est présentée comme une moyenne ± SD (test t de Student). La barre d’échelle indique 50 μm en (A) et (B) et 10 μm en (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.