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Article de méthode

Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau

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DOI :

10.3791/63816

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28 avril 2022

 ,  , 
1Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Cette méthode de purification biochimique avec analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse facilite la caractérisation robuste des noyaux de fibrilles amyloïdes, ce qui peut accélérer l’identification de cibles pour la prévention de la maladie d’Alzheimer.

Résumé

Les inclusions fibrillaires protéiques sont des caractéristiques pathologiques clés de multiples maladies neurodégénératives. Dans les premiers stades de la maladie d’Alzheimer (MA), les peptides bêta-amyloïdes forment des protofibrilles dans l’espace extracellulaire, qui agissent comme des graines qui se développent progressivement et mûrissent en grandes plaques amyloïdes. Malgré cette compréhension de base, les connaissances actuelles sur la structure, la composition et les modèles de dépôt des fibrilles amyloïdes dans le cerveau sont limitées. Une barrière majeure a été l’incapacité d’isoler les fibrilles amyloïdes hautement purifiées des extraits de cerveau. Des approches basées sur la purification par affinité et la capture laser par microdissection ont déjà été utilisées pour isoler les amyloïdes, mais sont limitées par la petite quantité de matériau qui peut être récupérée. Ce nouveau protocole robuste décrit la purification biochimique des noyaux de plaque amyloïde à l’aide de la solubilisation au dodécylsulfate de sodium (SDS) avec ultracentrifugation et ultrasons du gradient de densité de saccharose et donne des fibrilles très pures de patients atteints de MA et de tissus cérébraux modèles de DA. L’analyse protéomique ascendante basée sur la spectrométrie de masse (SEP) du matériau purifié représente une stratégie robuste pour identifier presque tous les composants protéiques primaires des fibrilles amyloïdes. Des études protéomiques antérieures sur les protéines de la couronne amyloïde ont révélé une collection de protéines étonnamment grande et fonctionnellement diversifiée. Notamment, après avoir affiné la stratégie de purification, le nombre de protéines co-purifiantes a été réduit de plus de 10 fois, ce qui indique la grande pureté du matériau insoluble isolé SDS. La coloration négative et la microscopie électronique immuno-or ont permis de confirmer la pureté de ces préparations. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les attributs spatiaux et biologiques qui contribuent au dépôt de ces protéines dans les inclusions amyloïdes. Dans l’ensemble, cette stratégie analytique est bien positionnée pour améliorer la compréhension de la biologie amyloïde.

Introduction

L’amyloïde est un arrangement supramoléculaire extrêmement stable que l’on trouve dans un panel diversifié de protéines, dont certaines conduisent à des changements pathologiques1. L’accumulation d’agrégats amyloïdes intra- ou extracellulaires est observée dans plusieurs maladies neurodégénératives2. Les agrégats amyloïdes sont hétérogènes et sont enrichis d’un grand nombre de protéines et de lipides3. Au cours des dernières années, l’intérêt pour le protéome amyloïde a suscité un intérêt considérable parmi les neuroscientifiques de base et translationnels. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour extraire et purifier les agrégats amyloïdes des tissus cérébraux humains de souris et post-mortem. La microdissection par capture laser, l’immunoprécipitation, la décellularisation et l’isolement biochimique des agrégats amyloïdes sont des méthodes largement utilisées pour extraire et purifier les plaques amyloïdes, les fibrilles et les oligomères 4,5,6,7. Beaucoup de ces études se sont concentrées sur la détermination de la composition protéique de ces dépôts fibrillaires étroitement emballés à l’aide de la SEP semi-quantitative. Cependant, les résultats disponibles sont incohérents et le nombre étonnamment élevé de protéines co-purifiantes précédemment rapportées est difficile à interpréter.

La principale limite de la littérature existante décrivant le protéome du noyau amyloïde dans les cerveaux modèles murins AD et AD est que le matériel purifié contient un nombre ingérable de protéines co-purifiantes. L’objectif global de cette méthode est de surmonter cette limitation et de développer une purification biochimique robuste pour isoler les noyaux de fibrilles amyloïdes. Cette stratégie utilise une méthode biochimique basée sur l’ultracentrifugation du gradient de densité de saccharose décrite précédemment pour isoler les fractions amyloïdes enrichies insolubles dans le SDS à partir de tissus cérébraux humains et murins post-mortemAD 8,9. Cette méthode s’appuie sur la littérature existante, mais va plus loin avec les ultrasons et les lavages SDS pour éliminer la plupart des protéines associées à l’amyloïde faiblement liées, conduisant à l’isolement des fibrilles amyloïdes hautement purifiées (Figure 1). Les fibrilles purifiées par ce protocole surmontent plusieurs défis existants fréquemment rencontrés dans les études structurelles de fibrilles amyloïdes isolées à partir d’extraits cérébraux. La visualisation de ces fibrilles par microscopie électronique à transmission (TEM) confirme l’intégrité et la pureté du matériau purifié (Figure 2). Dans cette étude, les fibrilles isolées sont solubilisées et digérées en peptides avec de la trypsine, et l’analyse de la SEP sans étiquette peut facilement révéler l’identité des protéines formant le noyau de la fibrilure. Notamment, certaines de ces protéines ont une tendance inhérente à former des assemblages supramoléculaires dans des organites non liés à la membrane. En outre, de nombreuses protéines identifiées dans l’analyse des fibrilles bêta-amyloïdes (Aβ) sont également associées à d’autres maladies neurodégénératives, ce qui suggère que ces protéines peuvent jouer un rôle clé dans de multiples protéinopathies.

Il est peu probable que cette méthode de FDS/ultrasons modifie ou perturbe la structure des noyaux de fibrilles. Le matériau purifié convient également à un large éventail d’approches d’analyse protéomique descendante et ascendante et à d’autres stratégies d’analyse structurelle basées sur la SEP, telles que la réticulation chimique ou l’échange hydrogène-deutérium. La récupération globale à l’aide de cette méthode est relativement élevée et convient donc aux études structurelles détaillées, qui nécessitent des microgrammes à des milligrammes du matériau purifié. Le matériau purifié convient également aux études structurelles utilisant cryoEM et la microscopie à force atomique. Ce protocole, combiné au marquage isotopique stable des mammifères, peut faciliter les études par résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide de la structure amyloïde10.

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Protocole

Ce protocole implique l’utilisation de tissus cérébraux humains ou vertébrés. Toutes les recherches ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles approuvées par l’Université Northwestern. Le flux de travail actuel est normalisé à l’aide d’extraits corticaux du cerveau de souris et de la région cérébrale de l’hippocampe APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F)11. Ce protocole a été optimisé pour les extraits de cerveau de souris âgées de 6 à 9 mois, et il peut purifier efficacement les amyloïdes des animaux mâles et femelles.

REMARQUE : Pour une meilleure compréhension de la procédure expérimentale globale, reportez-vous à la Figure 1 pour obtenir un schéma du flux de travail.

1. Prélèvement de tissus et purification de l’amyloïde

REMARQUE: Idéalement, les fibrilles amyloïdes devraient être isolées des régions du cerveau fraîchement disséquées. Cependant, cette méthode fonctionne également bien avec les tissus cérébraux congelés instantanément ou instantanément. Vous trouverez ci-dessous un bref aperçu des tissus cérébraux à gel instantané pour les stocker en vue d’une utilisation ultérieure.

  1. Prélèvement et stockage des tissus cérébraux : Disséquez les cerveaux de souris et récoltez rapidement les régions chargées d’amyloïde (c.-à-d. cortex et hippocampe), puis par congélation instantanée dans de l’azote liquide ou un bain d’alcool de glace carbonique.
    REMARQUE: La congélation instantanée aide à préserver les attributs structurels des constituants du tissu. Les souris sont euthanasiées par isoflurane et luxation cervicale12,13. Il est conseillé d’éviter d’utiliser du CO2 car cela peut compromettre l’intégrité du protéome cérébral.
  2. Après la dissection, coupez et stockez les tissus frais dans de petits blocs (par exemple, 5 mm x 5 mm), car cela facilite une homogénéisation plus efficace avant l’extraction amyloïde. Transférez le tissu dans le flacon cryogénique stérile, serrez son capuchon et immergez-le rapidement.
  3. Gardez les tissus congelés dans des conditions ultrafroides (c.-à-d. -80 °C ou azote liquide). Si l’extraction doit être effectuée quelques jours plus tard, stockez les tissus à -20 °C et évitez les cycles de gel et de dégel. Décongeler les tissus congelés sur de la glace humide lorsqu’ils sont prêts pour l’extraction et la purification.
    REMARQUE: Le contact direct des tissus avec l’azote liquide peut causer des dommages aux tissus et aux protéines. Notez qu’un bain d’alcool peut supprimer les marqueurs permanents des étiquettes des tubes.

2. Enrichissement des matières insolubles dans les FDS

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes sur la glace et la centrifugeuse à 4 ° C, sauf indication contraire. Les détails de tous les tampons et solutions utilisés dans ce protocole sont fournis dans le fichier supplémentaire 1. Les fabricants et les numéros de catalogue des produits chimiques et des instruments sont fournis dans le tableau des matériaux.

  1. Commencez par des régions de tissu cérébral fraîchement disséquées ou congelées (décongelées sur de la glace) placées dans un tube de 2 mL contenant 6 à 8 perles de céramique et un tampon d’homogénéisation glacé fraîchement préparé (1 mL pour 0,25 à 1 g de masse tissulaire humide).
  2. Transférer les tubes dans l’homogénéisateur du broyeur à billes et broyer le contenu des tissus à 4000 tr / min, avec deux cycles de 30 s chacun et un intervalle de 30 s entre les deux.
    REMARQUE: Alternativement, des systèmes d’agitateur ou d’homogénéisateur motorisés peuvent être utilisés pour broyer et homogénéiser les tissus.
  3. Ajouter 9 mL de tampon d’homogénéisation glacé à 1 mL d’homogénéat de tissu entier du cerveau dans des tubes de 15 mL, sceller avec des bandes de film de cire de laboratoire et faire pivoter bout à bout pendant la nuit à 4 °C pour assurer une solubilisation robuste.
    REMARQUE: Pour éliminer les gros débris cellulaires et les lipides indésirables, le lendemain matin, faites tourner les tubes à 800 x g à 4 ° C pendant 10 minutes et recueillez le surnageant dans un tube frais. Remettre en suspension la pastille restante dans 2 mL de tampon d’homogénéisation glacé, bien mélanger, tourner à nouveau pendant 10 min à 4 °C et combiner les deux surnageants.
  4. Ajouter lentement le saccharose solide à la suspension d’extrait tissulaire jusqu’à une concentration finale de 1,2 M, bien mélanger et centrifuger à 250 000 x g pendant 45 min à 4 °C.
  5. Retirez et jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette. Remettre la pastille dans 2 mL de tampon d’homogénéisation contenant 1,9 M de saccharose par trituration, puis centrifugation à 125 000 x g pendant 45 min à 4 °C.
    REMARQUE: Le volume du tampon peut être ajusté en fonction de la quantité de matériau récupérée à l’étape précédente. En général, 10 volumes de tampon d’homogénéisation (V/V) sont idéaux pour cette étape.
  6. Recueillez la couche solide blanche supérieure à l’aide d’une pipette, transférez-la dans un tube frais et solubilisez dans 1 mL de tampon de lavage glacé en pipetant plusieurs fois, sans introduire de bulles d’air.
  7. Outre la couche supérieure, la pastille est également enrichie en fibrilles amyloïdes. Pour un rendement plus élevé, combinez les deux fractions et procédez. Retirez soigneusement la couche aqueuse moyenne à l’aide d’une pipette et jetez-la.
  8. Centrifuger les fractions combinées à 8000 x g pendant 20 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  9. Ajouter 1 mL de tampon de digestion glacé à la pastille lavée, remettre en suspension et incuber à température ambiante (RT) pendant 3 h.
  10. Centrifuger à 8000 x g pendant 20 min à 4 °C et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette.
  11. Remettre en suspension et laver (comme à l’étape 2.8.) la pastille digérée deux fois dans 1 mL de tampon Tris glacé.
  12. Remettre en suspension la pastille lavée dans 1 mL de tampon de solubilisation contenant 1 % de FDS et 1,3 M de saccharose en pipetant de haut en bas. Centrifuger rapidement à 200 000 x g pendant 60 min à 4 °C.
    REMARQUE: Bien que les fibrilles amyloïdes soient très résistantes aux détergents et aux dénaturants, de très longues expositions au détergent (1% de FDS) peuvent affecter l’intégrité des fibrilles ou éliminer les protéines étroitement liées, ce qui compromettra les analyses ultérieures. Par conséquent, immédiatement après la remise en suspension des granulés, procédez à la centrifugation.
  13. Économisez la pastille et augmentez le volume du surnageant restant en ajoutant 50 mM de tampon Tris (dans un rapport de 1:0,3) pour réduire la concentration de saccharose de 1,3 à 1 M et en centrifugeant une fois de plus à 200 000 x g pendant 45 min à 4 °C.
  14. Dissoudre les deux pastilles dans 100 μL de tampon Tris contenant 0,5% de FDS et pool pour la purification de l’amyloïde. Les granulés visibles sont petits et doivent apparaître opaques et blanc cassé (voir la figure 2A).

3. Purification amyloïde

REMARQUE: Mélanger les deux granulés, solubiliser par pipetage jusqu’à obtenir une solution uniforme et procéder aux étapes suivantes de purification amyloïde.

  1. Pour une solubilisation complète du matériau riche en amyloïde présent dans les granulés, soumettez le tube à un cisaillement mécanique produit par des ondes ultrasonores dans un dispositif de sonication de bain fonctionnant pendant 30 s ON et 30 s OFF à une fréquence moyenne pendant 20 cycles.
  2. Centrifugez immédiatement le matériau à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C et remettez la pastille dans 500 μL de tampon SDS Tris à 0,5 %.
  3. Répétez l’étape 3.1. et l’étape 3.2. quatre fois pour un total de cinq lavages. Le nombre de lavages peut être augmenté pour améliorer la pureté.
    REMARQUE: Les étapes de sonication et de lavage sont optimisées à 0,5% SDS car des concentrations plus élevées peuvent affecter la structure, l’intégrité ou la composition protéique des fibrilles. Il n’est pas recommandé d’augmenter la concentration de FDS à cette étape.
  4. Après la dernière étape de centrifugation, laver la pastille dans 200 μL d’eau ultra-pure et centrifuger à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer tout détergent restant. La pastille lavée contenant des fibrilles amyloïdes purifiées apparaît de couleur semi-transparente et est parfois difficile à voir.
  5. Dissoudre la pastille finale contenant des fibrilles amyloïdes purifiées dans 100 μL d’eau ultrapure. Passez immédiatement à l’étape suivante pour le traitement en aval ou conservez la suspension de fibrilles à -20 °C pour une analyse plus approfondie. S’il est gelé, décongeler sur la glace avant de commencer les précipitations.

4. Précipitation du chloroforme de méthanol

REMARQUE: Si l’objectif final est d’effectuer une analyse des protéines, il est recommandé de dessaler et d’éliminer les impuretés non protéiques supplémentaires.

  1. Ajouter 400 μL de méthanol aux 100 μL purifiés de fibrilles amyloïdes dans un tube de 1,5 mL et un puits vortex.
  2. Ajouter 100 μL de chloroforme au tube et bien vortex.
  3. Ajouter 300 μL d’eau ultrapure et bien le vortex. Cela rend le mélange trouble en raison de la précipitation des protéines.
  4. Centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min à RT.
  5. Retirez soigneusement la couche aqueuse (c.-à-d. en haut) sans perturber la couche d’interface contenant le flocon de protéines.
  6. Ajouter à nouveau le même volume de méthanol et centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min à TA.
  7. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et sécher la pastille à l’air libre à RT. Évitez de trop sécher; la fraction amyloïde est difficile à redissoudre si elle est trop séchée.

5. Digestion de la trypsine

  1. Dissoudre la pastille dans 50 μL de tampon de chlorhydrate de guanidine (GuHCl). Sonicate dans un bain d’eau glacée et chauffer à 95 °C pendant 5 min, si nécessaire.
  2. Vortex à fond à RT pendant 45 min à 1 h pour le dissoudre complètement. La pastille ne sera pas visible après cette étape et la solution semble claire en apparence.
  3. Ajouter le même volume de solution tensioactive à 0,2%. Solubiliser à RT avec vortex pendant 60 min. Cette étape améliore l’activité enzymatique de la trypsine.
  4. Ajouter 1 μL de tris-2-carboxyéthylphosphine (TCEP) à partir de la solution mère de 500 mM. Incuber pendant 60 min.
  5. Ajouter 2 μL de 500 mM d’iodoacétamide (IAA) et incuber dans l’obscurité pendant 20 min.
  6. Trempez l’IAA avec 5 μL de solution TCEP pendant 15 min.
  7. Ajouter le volume requis de solution de bicarbonate d’ammonium de 50 mM au tube pour réduire la concentration de guanidine à 1,5 M.
  8. Ajouter une solution de tensioactif à 1 % dans le tube (1 μL/50 μg de protéines).
  9. Ajouter la trypsine (1 μg/100 μg de protéines) et laisser le tube mélanger à 37 °C pendant la nuit.

6. Nettoyage des peptides

  1. Le lendemain matin, acidifiez la solution peptidique digérée en abaissant le pH à 2,0 en ajoutant de l’acide formique.
  2. Activez la colonne de spin C18 (n-octadécyle) dans un tube récepteur de 2 mL en ajoutant 200 μL de solution de méthanol à 50% et tournez à 1500 x g pendant 2 min à RT. Répétez l’étape d’activation.
  3. Équilibrez les lits de résine de colonne C18 en ajoutant 200 μL de tampon d’équilibrage et en filant pendant 2 min dans les mêmes conditions. Répétez cette étape.
  4. Chargez la solution peptidique acidifiée sur la colonne C18 et centrifugez à 1500 x g pendant 2 min à RT. Collectez le flux et rechargez-le une fois de plus. Jetez le deuxième flux.
  5. Lavez les peptides liés à la résine C18 avec le tampon de lavage 2x, comme fait à l’étape 6.3. Utilisez le même tampon d’équilibrage pour laver la colonne.
  6. Éluter les peptides en ajoutant 40 μL de tampon d’élution suivi d’une centrifugation à 1500 x g, pendant 2 min à RT. Répétez l’étape d’élution trois fois pour augmenter le rendement des peptides récupérés.
  7. Sécher les peptides dans un concentrateur à vide rapide en évaporant la solution aqueuse. Les granulés secs peuvent être conservés à -20 °C pendant quelques semaines avant l’analyse MS.

7. Mise en place d’un spectromètre de masse pour l’analyse peptidique

REMARQUE : Pour les paramètres MS, voir le fichier supplémentaire 1 (adapté d’une publication précédente du laboratoire)14.

  1. Avant de charger les échantillons de peptides pour l’analyse MS, dissoudre les pastilles de peptides secs dans 20 μL de tampon de chargement de l’échantillon et effectuer un micro BCA pour quantifier la concentration de peptides récupérés.
  2. Transférer les peptides dissous dans un flacon en verre et charger 3 μg (quantifiés à partir de micro BCA) de peptides dans l’échantillonneur automatique du système UPLC.
  3. Chargez les échantillons sur une colonne de piège ventilée (colonne HPLC C18, 0,075 mm x 20 mm) avec un débit de 250 nL/min.
  4. Disposer la colonne de piégeage en ligne avec une colonne analytique (0,075 μm x 500 mm) et assembler une pointe d’émetteur à la source d’ionisation par électropulvérisation (ESI) soumise à une tension de pulvérisation de 2000 V.
    REMARQUE: Dans cette étude, ESI est effectué, dans lequel la phase mobile est soumise à une ionisation haute tension dans la phase gazeuse. Le spray créé par cela est dirigé vers la chambre à vide du MS à travers un capillaire chauffé. Sous vide, la désolvation des gouttelettes et l’éjection des ions se produisent en présence de chaleur et de tension. Par la suite, les ions sont accélérés vers l’analyseur de masse en présence d’un environnement à haute tension.
  5. Analysez les échantillons avec des cycles d’acquisition de 2 h. Cette étude est réalisée à l’aide d’une acquisition dépendante des données avec le paradigme de sélection d’ions précurseurs le plus intense des 20 premiers.
    REMARQUE: Dans l’acquisition dépendante des données, un nombre limité de peptides précurseurs sont détectés dans le scan MS1 et soumis à la fragmentation pour l’analyse MS2. Cependant, l’exclusion dynamique est problématique ici car les peptides Aβ très abondants seront omis pour la fragmentation et entraîneront une sous-estimation de leur quantité.
  6. Pour la quantification absolue des peptides Aβ, exécutez les mêmes échantillons une fois de plus en utilisant la méthode MS/MS ciblée. Pour cette étude, une liste exhaustive de tous les rapports m/z pour divers peptides tryptiques Aβ possibles pour les modèles murins d’entraînement APP est préparée (voir tableau supplémentaire 1). D’autres groupes devraient préparer une liste similaire en fonction du modèle murin disponible et des peptides possibles générés à partir de la protéine d’intérêt (par exemple, Aβ pour AD).
    REMARQUE: Pour traiter l’exclusion des peptides très abondants, utilisez une approche ciblée en fournissant une liste de valeurs m/z sélectionnées correspondant aux peptides tryptiques Aβ. Cette approche aborde le problème de l’exclusion dépendante des données des peptides Aβ et peut quantifier les quantités absolues de différents monomères (Aβ38, 40 et 42 peptides) avec une haute résolution.
  7. Le spectromètre de masse génère des spectres MS des échantillons de peptides et enregistre les fichiers de données brutes dans le répertoire cible. Utilisez ce fichier pour effectuer une correspondance spectrale à l’aide d’outils statistiques et bioinformatiques bien établis. Plusieurs outils de recherche et d’analyse de bases de données en ligne et hors ligne sont disponibles.

8. Analyse des données sur la SEP

  1. Extrayez les fichiers MS1 et MS2 à l’aide de l’outil Rawconverter hors connexion (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
  2. Effectuer l’identification, la quantification et des analyses détaillées des données sur un moteur de recherche de données MS basé sur le Web. Dans cette étude, Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/) a été utilisé.
    REMARQUE: Plusieurs autres outils d’analyse de données MS en ligne et hors ligne sont disponibles et peuvent également être utilisés, tels que MaxQuant (https://www.maxquant.org/).
  3. Après avoir téléchargé les fichiers MS1 et MS2, sélectionnez une base de données de protéome de souris mise à jour. Ici, une base de données de souris mise à jour contenant des mutations supplémentaires spécifiques à App knock-in est sélectionnée pour l’identification des peptides à l’aide des algorithmes ProLuCId et SEQUEST11.
  4. Dans le système d’analyse IP2, sélectionnez les paramètres par défaut et modifiez-les en fonction des exigences expérimentales. Dans cette étude, une tolérance de masse peptidique de 50 ppm pour le précurseur et de 600 ppm pour les fragments est utilisée (voir le fichier supplémentaire 1 pour les autres paramètres utilisés dans IP2).
    REMARQUE : Les chercheurs peuvent modifier les paramètres de recherche en fonction des objectifs expérimentaux. Par exemple, pour identifier les modifications post-traductionnelles, ajouter des valeurs de modification différentielle pour divers PTM (p. ex., ubiquitination, SUMOylation, phosphorylation).

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Résultats

Ici, une méthode détaillée pour l’isolement et la purification des fibrilles amyloïdes à l’aide d’une méthode modifiée de purification par ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose est résumée (voir la figure 1). L’innovation dans cette méthode est l’inclusion d’étapes de lavage par ultrasons à l’aide d’un système de sonication au bain-marie suivi d’une solubilisation SDS, qui élimine de nombreuses protéines faiblement associées des fibrilles amyloïdes qui co-purifient avec l...

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Discussion

Développer une compréhension claire de la structure et de la composition amyloïdes est difficile pour les biologistes structuraux et les biochimistes en raison des complexités biologiques et des limites expérimentales dans l’extraction des fibrilles purifiées des tissus cérébraux de laMA 16,17. Les fibrilles amyloïdes sont polymorphes au niveau moléculaire, montrant une population hétérogène de longueurs et de complexités variables18,19

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention niH R01AG061865 à R.J.V. et J.N.S. Les auteurs remercient les membres du groupe de recherche Vassar et Savas de l’Université Northwestern pour leurs discussions réfléchies. Nous remercions également sincèrement dr(s). Ansgar Seimer et Ralf Langen de l’Université de Californie du Sud pour leur contribution cruciale. Nous remercions le Dr Farida Korabova pour la préparation des échantillons et l’imagerie par microscopie électronique à coloration négative au Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acclaim PepMap 100 C18 Colonne HPLC 0,075 mm x 20  ; mmThermo Scientific164535D’autres instruments, produits chimiques et anticorps d’autres fabricants peuvent être utilisés
Bicarbonate d’ammoniumSigma-Aldrich9830
Anticorps anti-amyloïde bêta (1-16) 6E10Biolegend803001
Bêta-amyloïde (17-24) Anticorps 4G8Biolegend800701
bêta-amyloïde (N terminus 82E1) anticorpsIBL America10323
anticorps LOC anti-fibrille amyloïde  ; EMD MilliporeAB2287
BCA kitThermo Fisher Scientific23225
Bioruptor Pico PlusDiagenodeB01020001
Chlorure de CalciumSigma-Aldrich  ; C1016
CollagénaseSigma-AldrichC0130
Complète  ; Cocktail d’inhibiteurs de protéaseSigma-Aldrich11697498001
Dnase IThermo Fisher ScientificEN0521
EDTASigma-AldrichEDS
Chlorhydrate de guanidineSigma-AldrichG4505
HyperSep C18 CartouchesThermo Fisher Scientific60108-302
Pipeline de protéomique intégrée - IP2  ;http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacétamide (IAA)Sigma-AldrichI1149
K54 Système d’homogénéisation tissulaire MotorCole ParmerGlas-Col 099C
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/
Micro BCA kitThermo Fisher Scientific23235
Nanoviper 75 &mu ; m x 50  ; cmThermo Scientific164942
Optima L-90K UltracentrifugeuseBeckman CoulterBR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridSpectromètre de masseThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin ColumnsThermo Fisher Scientific89870
Precellys 24 Homogénéisateur de tissusBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin EnhancerPromegaV2072
RawConverterhttp://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Azoture de sodiumVWR97064-646
Dodécylsulfate de sodium (SDS)Sigma-Aldrich74255
Sorvall Legend Micro 21R MicrocentrifugeuseThermo Fisher ScientificConcentrateur sous
vide 75002446 SpeedLabconco7315021
Tris-2-carboxyéthylphosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Tris-HClThermo Fisher Scientific15568025
Trypsin Gold-Mass spec gradePromegaV5280
UltiMate 3000 RSLCnano SystemThermo Scientific
ULTIM3000RSLCNANO

Références

  1. Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
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  7. Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
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