Ce protocole décrit l’analyse de la morphologie organoïde rectale (ROMA), un nouveau test diagnostique de la fibrose kystique (FK). Les caractéristiques morphologiques, à savoir la rondeur (indice de circularité, IC) et la présence d’une lumière (rapport d’intensité, IR), sont une mesure de la fonction CFTR. L’analyse de 189 sujets a montré une discrimination parfaite entre les FK et les non-FC.
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Article de méthode
Analyse de la morphologie organoïde rectale (ROMA): un test diagnostique dans la fibrose kystique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le diagnostic de la fibrose kystique (FK) n’est pas toujours simple, en particulier lorsque la concentration de chlorure dans la sueur est intermédiaire et/ou que moins de deux mutations du CFTR causant la maladie peuvent être identifiées. Des tests physiologiques CFTR (différence de potentiel nasal, mesure du courant intestinal) ont été inclus dans l’algorithme diagnostique, mais ne sont pas toujours facilement disponibles ou réalisables (p. ex. chez les nourrissons). Les organoïdes rectaux sont des structures 3D qui se développent à partir de cellules souches isolées des cryptes d’une biopsie rectale lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions spécifiques. Les organoïdes de sujets non atteints de fibrose kystique ont une forme ronde et une lumière remplie de liquide, car le transport du chlorure médié par CFTR conduit l’eau dans la lumière. Les organoïdes dont la fonction CFTR est défectueuse ne gonflent pas, conservant une forme irrégulière et n’ayant pas de lumière visible. Les différences de morphologie entre les organoïdes FK et non FK sont quantifiées dans l’analyse de la morphologie des organoïdes rectaux (ROMA) en tant que nouveau test physiologique CFTR. Pour le test ROMA, les organoïdes sont plaqués dans des plaques à 96 puits, colorés avec de la calcéine et imagés au microscope confocal. Les différences morphologiques sont quantifiées à l’aide de deux indices : l’indice de circularité (IC) quantifie la rondeur des organoïdes, et le rapport d’intensité (IR) est une mesure de la présence d’une lumière centrale. Les organoïdes non-FK ont un IC élevé et un IR faible par rapport aux organoïdes de la FK. Les index ROMA ont parfaitement discriminé 167 sujets atteints de mucoviscidose de 22 sujets sans mucoviscidose, ce qui fait de la ROMA un test physiologique CFTR attrayant pour aider au diagnostic de la mucoviscidose. Les biopsies rectales peuvent être effectuées systématiquement à tous les âges dans la plupart des hôpitaux et les tissus peuvent être envoyés à un laboratoire central pour la culture organoïde et la ROMA. À l’avenir, la ROMA pourrait également être appliquée pour tester l’efficacité des modulateurs CFTR in vitro. L’objectif du présent rapport est d’expliquer en détail les méthodes utilisées pour ROMA, afin de permettre la reproduction dans d’autres laboratoires.
Introduction
La fibrose kystique (FK) est une maladie autosomique récessive causée par des mutations du gène régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR). La protéine CFTR est un canal chlorure et bicarbonate, assurant l’hydratation de plusieurs épithéliums1. La FK est une maladie multisystémique à charge de morbidité élevée, qui raccourcit la vie, qui se manifeste principalement par une maladie respiratoire, mais qui affecte également le tractus gastro-intestinal, le pancréas, le foie et l’appareil reproducteur2.
Les mutations du CFTR causant la maladie entraînent une ....
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Protocole
Pour toutes les procédures impliquant des tissus humains, l’approbation du comité d’éthique de la recherche UZ/KU Leuven (recherche CE) a été obtenue. Toutes les recherches ont été effectuées avec le consentement éclairé et/ou l’assentiment des parents, des représentants et/ou des patients.
REMARQUE : Toutes les procédures impliquant des biopsies rectales et des organoïdes doivent être effectuées dans un flux laminaire afin de protéger le chercheur contre tout danger biologique et de minimiser le risque de contamination des cultures. Comme pour toute procédure de laboratoire, les chercheurs devraient en tout temps porter des blouses de labo....
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Résultats
Des organoïdes de 212 sujets ont été prélevés lors de visites cliniques de routine. Aucun événement indésirable n’est survenu pendant ou après la biopsie rectale. Les organoïdes ont été imagés par un chercheur aveugle aux caractéristiques du sujet telles que le génotype et les informations cliniques. En raison d’images de faible qualité, 23 sujets ont été exclus. Des exemples de cultures organoïdes réussies et ratées et d’acquisition d’images peuvent être vus à la figure 2.
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Discussion
Nous fournissons un protocole détaillé pour l’analyse de la morphologie organoïde rectale (ROMA). Les deux indices calculés avec ROMA, IR et CI ont distingué les organoïdes des sujets atteints de mucoviscidose de ceux sans mucoviscidose avec une précision parfaite. ROMA pourrait donc fonctionner comme un nouveau test physiologique CFTR complémentaire au CSC et à d’autres tests actuellement disponibles13,14,15.
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Déclarations de divulgation
Cette étude a été financée par l’association belge des patients atteints de mucoviscidose « Mucovereniging/Association Muco », la bourse de recherche de la Société belge de pédiatrie BVK-SBP 2019 et une subvention du Fonds UZ Leuven pour la recherche biomédicale translationnelle. Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions les patients et les parents qui ont participé à cette étude. Nous remercions Abida Bibi pour tout le travail de culture avec les organoïdes. Nous remercions Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz et Bernard Wenderickx pour leur soutien logistique. Nous remercions également le Mucovereniging/Association Muco, et en particulier Stefan....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL | Sorenson | 17040 | |
| Tubes coniques de 15 mL | VWR | 525-0605 | |
| Plaques à 24 puits | Corning | 3526 | |
| Plaques à 96 puits Microscope | Greiner | 655101 | |
| Microscope à fond clair | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | 5702 | |
| Incubateur CO2 | Binder | CB160 | |
| Ordinateur | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Microscope confocal ; | Zeiss | LSM 800 | |
| Hotte à flux laminaire | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Matériau pour la culture organoïde tel que détaillé dans le protocole précédent10Micropipettes | |||
| (20, 200 et 1000 µ ; L) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Tableur |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software ; | Nikon | v.5.02.00 | Logiciel d’imagerie |
| Pointes de pipette (20, 200 et 1000 & micro ; L) | Greiner | 774288, 775353 750288 | |
| logiciel Zeiss Zen Blue ; | Logiciel d’imagerie Zeiss | v2.6 |
Références
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal....
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Réimpressions et autorisations
