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Article de méthode

Un modèle murin de dysfonctionnement de la main lié à l’accès à l’hémodialyse

2K vues

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DOI :

10.3791/63892

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31 mai 2022

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1Department of Applied Physiology and Kinesiology, University of Florida, 2Division of Vascular Surgery and Endovascular Therapy, University of Florida, 3Center for Exercise Science, University of Florida, 4Malcom Randall Veteran Affairs Medical Center

Dans cet article

Résumé

Ce protocole détaille les étapes chirurgicales de la création de fistules artérioveineuses iliaques communes murines. Nous avons développé ce modèle pour étudier la physiopathologie des membres liée à l’accès à l’hémodialyse.

Résumé

L’insuffisance rénale chronique est un problème majeur de santé publique, et la prévalence de l’insuffisance rénale terminale (IRT) nécessitant des traitements de remplacement rénal chronique tels que l’hémodialyse continue d’augmenter. La mise en place de la fistule artérioveineuse autogène (FAV) reste une option d’accès vasculaire primaire pour les patients atteints d’IRT. Malheureusement, environ la moitié des patients hémodialysés souffrent d’un dysfonctionnement de la main lié à l’accès à la dialyse (ARHD), allant de la paresthésie subtile à la gangrène digitale. Notamment, les facteurs biologiques sous-jacents responsables de la MRSA sont mal compris, et il n’existe aucun modèle animal adéquat pour élucider les mécanismes et/ou développer de nouveaux traitements pour la prévention et le traitement de l’ARHD. Ici, nous décrivons un nouveau modèle murin dans lequel un AVF est créé entre l’artère iliaque commune gauche et la veine, facilitant ainsi l’évaluation de la physiopathologie des membres. La microchirurgie comprend l’isolement des vaisseaux, la veinotomie longitudinale, la création d’une anastomose artérioveineuse et la reconstruction veineuse. Les chirurgies fictives comprennent toutes les étapes critiques, à l’exception de la création d’AVF. La mise en place d’une FVA iliaque entraîne des altérations cliniquement pertinentes de l’hémodynamique centrale, de l’ischémie périphérique et des déficiences de la performance neuromotrice des membres postérieurs. Ce nouveau modèle préclinique AVF fournit une plate-forme utile qui récapitule les perturbations neuromotrices courantes signalées par les patients hémodialysés, permettant aux chercheurs d’étudier les mécanismes de la physiopathologie ARHD et de tester des thérapies potentielles.

Introduction

L’établissement et la préservation de l’accès vasculaire fonctionnel restent un objectif principal important pour les patients atteints d’insuffisance rénale terminale (IRT) recevant un traitement de remplacement rénal par hémodialyse1. Des traitements d’hémodialyse répétés sont nécessaires pour éliminer les déchets, normaliser les électrolytes et maintenir l’équilibre hydrique une fois que la fonction rénale devient inadéquate, et sont donc nécessaires à la survie à long terme2. Par conséquent, l’accès vasculaire représente une « bouée de sauvetage » pour les patients atteints d’IRT, et le placement de la fistule artérioveineuse autogène (FAV) reste une option d’accès privilégiée à la dialyse parmi cette cohorte3. Cependant, environ 30% à 60% des patients hémodialysés présentent un spectre de handicaps de la main, cliniquement définis comme un dysfonctionnement de la main lié à l’accès (ARHD). Les symptômes de l’ARHD peuvent aller de la faiblesse et de la discoordination à la monoplégie et à la gangrène digitale, qui peuvent survenir tôt après la création de l’AVF ou se développer progressivement avec la maturation de la fistule. De plus, la MRA complique le calendrier de traitement de l’IRT, qui est associé à une mauvaise qualité de vie, à un risque élevé de maladie cardiovasculaire et à une mortalité accrue 2,3,4.

Plusieurs modèles animaux ont été développés pour étudier le remodelage vasculaire induit par des altérations hémodynamiques suite à la création de FVA 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Les grands modèles animaux avec AVFiliaque ou fémorale 16,17,18,19,20 et les modèles de rongeurs utilisant soit l’anastomose de la veine carotide-jugulaire ou la formation de fistule de veine cave inférieure de l’aorte infrarénale sont bien établis pour examiner les aspects susmentionnés de la maturation et de la perméabilité de la FVA 21 . Par exemple, l’hypertension veineuse, un diamètre luminal plus important et une épaisseur accrue de la paroi veineuse sont des signes d’une maturation réussie de l’AVF, tandis qu’une fibrose importante du milieu et une hyperplasie intimale ou un développement de thrombus sans modification du débit caractérisent souvent les défaillances de la FVA 6,15. Cependant, les modèles de grands animaux n’ont pas la flexibilité expérimentale ou les capacités transgéniques des modèles murins, tandis que les modèles actuels de rongeurs ne facilitent pas facilement l’étude de la MRA en raison de l’emplacement anatomique et / ou de l’absence de pathologie associée aux membres. En effet, en raison de l’absence d’un modèle animal préclinique établi qui récapitule le phénotype clinique pertinent, les progrès de la recherche pour élucider les mécanismes pathobiologiques et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques sont restés stagnants, malgré une augmentation progressive du nombre de patients symptomatiques atteints de MRA. Par conséquent, l’objectif principal de cette étude est d’introduire un modèle murin unique d’ARHD, fournissant les étapes procédurales de la microchirurgie AVF et la caractérisation de la physiopathologie liée à l’AVF.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Floride et le Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.

REMARQUE : Les jeunes souris adultes (8 à 10 semaines) mâles C57BL/6J ont été achetées auprès du Jackson Laboratory et logées dans une installation contrôlée pour animaux contrôlée par la lumière (lumière de 12 h : 12 h par cycle d’obscurité), la température (22 °C ± 1 °C) et l’humidité (50 % ± 10 %). Cinq souris ont été autorisées à habiter par cage (L: 18 cm x L: 29 cm x H: 12,5 cm) avec des matériaux de nidification, de la nourriture et de l’eau mis à disposition ad libitum. Après 7 jours d’acclimatation de l’habitat avec le chow standard, les souris ont été changées pour un régime à base de caséine pendant 7 jours comme phase de transition alimentaire. Par la suite, des souris ont été nourries avec une supplémentation en adénine de 0,2% à 0,15% pendant 2 à 3 semaines pour induire un dysfonctionnement rénal (IRC) avant la chirurgie AVF comme décrit précédemment22,23,24. Les souris témoins ont reçu un régime alimentaire à base de caséine sans supplémentation en adénine (témoin). Les régimes de contrôle et de MRC ont été maintenus tout au long de la période de récupération postopératoire (POD).

1. Mesures préopératoires

  1. Évaluer les mesures des résultats de base/préopératoires, les diamètres des vaisseaux aortoilés et les paramètres d’écoulement hémodynamique à l’aide de l’imagerie échographique duplex et de la perfusion des membres postérieurs par Doppler laser, comme décrit précédemment25.
  2. Déterminer la force de préhension unilatérale des membres postérieurs et l’évaluation de la marche sur tapis roulant pour établir la fonction de base des membres postérieurs comme décrit précédemment25,26.
  3. Évaluer la fonction rénale en mesurant le débit de filtration glomérulaire (DFG) via la clairance de l’inuline FITC et/ou le taux sérique d’azote uréique (BUN) dans le sang, comme décrit précédemment22,24,27.

2. Préparation chirurgicale

  1. Préparez les outils et fournitures chirurgicaux suivants (tableau des matériaux) : stérilisateur de billes chaudes, lubrifiant pour les yeux, coupe-bordure, préparations à base d’alcool, lingettes à la chlorhexidine, pinces Graefe extra-fines, solution saline stérilisée à 0,9 %, seringues à aiguille de 29 G et 31 G, 2 x 2 éponges non tissées, moyennes rondes à une extrémité (SC-9) et petites tiges de coton dures, tranchantes et pointues (SC-4) à double extrémité, cautérisation à basse température, pinces Dumont droites, pinces Dumont inclinées à 45°, ciseaux à ressort Vannas droits, ciseaux à ressort Vannas incurvés, porte-aiguilles à manche rond, sutures de plusieurs tailles de sutures (soie 4-0, 5-0 PGA, soie 6-0 et sutures en nylon 10-0), héparine, éponge à gélatine résorbable, porte-aiguille droit et buprénorphine.
    REMARQUE: Les élastiques de fixation des extrémités et les rétracteurs pour l’abdomen et les jambes ont été fabriqués à la main.
  2. Stériliser les préparations chirurgicales à l’aide d’un autoclave avec stérilisation à la vapeur à 120-125 °C pendant 30 minutes, suivie d’un séchage pendant 30 minutes avant la chirurgie. Utilisez un nettoyage à l’éthanol à 70% suivi d’une stérilisation des billes chaudes (240-270 °C pendant 3 min) entre chaque chirurgie animale.
  3. Préparer une solution saline normale stérilisée à 0,9 %, une solution saline héparinée (100 UI/mL) et de la buprénorphine (0,01 mg/mL) à l’aide de seringues à aiguille de 29 à 31 G.

3. Anesthésie et positionnement

  1. Initier l’anesthésie de la souris dans la chambre d’induction (0,8 mL/min, 2,5 % d’isoflurane). Une fois que la souris est correctement anesthésiée, placez-la en décubitus dorsal sur la station chirurgicale recouverte d’un champ stérile. Réduire la concentration d’isoflurane à ~1,2% pendant les étapes de rasage et de positionnement.
  2. Appliquez le lubrifiant oculaire pour protéger les yeux du dessèchement pendant la chirurgie.
  3. À l’aide d’un coupe-bordures, rasez les poils abdominaux pour l’opération et les poils des jambes pour les mesures de perfusion postopératoires. Dégagez les cheveux du champ chirurgical.
  4. Fixez les membres supérieurs et inférieurs avec des élastiques et des pinces, vérifiez la profondeur de l’anesthésie en surveillant le réflexe de pincement des orteils et titrez l’anesthésie au besoin. Effectuez l’évaluation du schéma respiratoire toutes les 3-5 minutes tout au long de l’intervention chirurgicale pour calibrer le niveau d’anesthésie.

4. Exploration de la zone cible chirurgicale

  1. Nettoyez la zone de peau rasée plusieurs fois, en alternant entre la préparation à l’alcool et les lingettes à la chlorhexidine selon un schéma circulaire pour désinfecter le champ chirurgical.
  2. Faites une laparotomie médiane du bord inférieur de la marge sternale à la symphyse pubienne. Disséquez le coussinet adipeux du pubis pour obtenir un champ opératoire plus large.
  3. Ouvrez la céliotomie pour accéder au contenu péritonéal avec des écarteurs et éviscérez l’intestin grêle et le gros intestin à l’aide de cotons-tiges ronds moyens et unilatéraux. Couvrir les intestins avec une éponge non tissée imbibée de solution saline.
  4. Une fois que l’exposition adéquate du système vasculaire rétropéritonéal est obtenue, couvrir l’intestin, les reins et les uretères restants avec de petites éponges non tissées imbibées de solution saline. Évacuez une vessie distendue en pressant doucement le dôme de la vessie avec des cotons-tiges ronds moyens et unilatéraux au besoin.
  5. Disséquer soigneusement le fascia périvasculaire et le tissu adipeux d’environ 1 cm proximal à la bifurcation aortique s’étendant jusqu’au niveau de la bifurcation iliaque gauche à l’aide de pinces Dumont droites et de petits cotons-tiges durs, pointus et pointus à double extrémité.
    REMARQUE: L’artère iliaque gauche et la veine restent adhérentes l’une à l’autre tout en isolant les structures artérioveineuses en masse. Cette étape fournira une mobilisation suffisante des navires pour faciliter la création de l’AVF.
  6. Si de petites branches veineuses proviennent de la veine iliaque commune gauche ou convergent avec elle, ligaturez-les en utilisant une cautérisation à basse température avec ou sans suture de soie 6-0 au besoin.
  7. Passez l’extrémité de la pince inclinée sous le faisceau vasculaire iliaque commun gauche et écartez-la doucement plusieurs fois pour mobiliser les vaisseaux de la musculature rétropéritonéale sous-jacente (Figure 1A).

5. Création d’une anastomose de fistule artérioveineuse iliaque commune

  1. Placez deux sutures de soie 4-0 autour du faisceau artérioveineux iliaque commun gauche isolé et utilisez-les comme ligatures (p. ex. pinces croisées) du faisceau vasculaire. Créez un seul nœud avec chaque cravate en soie 4-0 et appliquez-les séquentiellement de proximal à distale.
  2. Assurez-vous que les pinces croisées en soie sont placées suffisamment loin l’une de l’autre pour isoler ~2 mm de longueur de vaisseau, et l’application séquentielle des ligatures de suture précipitera l’engorgement de la veine iliaque gauche.
  3. En utilisant les cordes de suture en soie 4-0 comme poignées, faites pivoter le faisceau vasculaire artérioveineux iliaque gauche dans le sens des aiguilles d’une montre et affinez la position pour localiser temporairement la veine antérieure à l’artère (Figure 1B).
  4. Faites une veinotomie longitudinale (~1 mm) avec des ciseaux à ressort Vannas droits et rincez doucement le sang résiduel de la lumière veineuse avec une solution saline à 0,9 % (figure 1C). Soyez prudent pendant cette étape, car un rinçage de solution saline à haute pression peut provoquer une perturbation veineuse.
    REMARQUE: La région de couleur rouge qui reste dans l’artère iliaque après le rinçage veineux fournit une fenêtre visuelle pour l’étape suivante.
  5. Placez une suture imbriquante en nylon 10-0 à travers la paroi postérieure de la veine.
    REMARQUE: Cette partie de la veine iliaque doit être en apposition immédiate à la paroi antérieure de l’artère iliaque, et les parois sont naturellement adhérentes. La suture doit traverser les deux parois et attacher la suture avec un seul nœud (Figure 1D). Notez qu’une petite quantité de saignement, qui provient du sang stagnant dans l’artère iliaque, apparaîtra une fois que l’aiguille passera à travers les deux parois. Si le saignement intra-luminal se poursuit au cours de cette étape, les pinces croisées de suture en soie peuvent être trop lâches et doivent être resserrées.
  6. Saisissez les extrémités de suture imbriquées et placez-les sous une légère tension pour déplacer la paroi antérieure de la paroi postérieure de l’artère iliaque. Faites une incision elliptique de ~1,0 mm x 0,3 mm à l’aide de ciseaux à ressort Vannas incurvés, en enlevant les parois adhérentes de l’artère iliaque et de la veine.
    REMARQUE: La fistule artérioveineuse est ainsi créée une fois ce canal commun établi. Il est possible de blesser les parois latérales de la veine au cours de cette étape car l’incision de la veine iliaque postérieure / paroi de l’artère iliaque antérieure est réalisée par exposition à la veinotomie. Des précautions doivent être prises pour éviter cette complication car cela peut réduire considérablement le diamètre de la fistule et conduire au développement de thrombus.
  7. Rincer doucement le sang résiduel de la lumière artérielle exposée avec une solution saline à 0,9 % et une solution saline héparinée (100 UI/mL)28 (figure 1E).
  8. Après la création de l’AVF, réparer la veinotomie initiale de la paroi antérieure à l’aide de deux ou trois sutures en nylon 10-0 de façon interrompue (figure 1F).
  9. Restaurez le faisceau vasculaire à son orientation anatomique d’origine et placez un petit morceau d’éponge de gélatine absorbable imbibée de solution saline à côté de la veinotomie réparée pour faciliter l’hémostase.
  10. Desserrez les ligatures de pince croisée à un nœud 4-0 séquentiellement de distale à proximale. Surveillez de près le site de veinotomie pour détecter tout saignement excessif tout en desserrant chaque suture.
  11. Si la réparation n’est pas suffisamment hémostatique, réappliquez les pinces croisées et placez une autre suture en nylon 10-0 sur le site du saignement. Si l’hémostase est assurée, retirez les sutures puis l’éponge de gélatine résorbable.
  12. Frottez doucement le faisceau vasculaire avec de petits cotons-tiges durs, pointus et à double extrémité, ce qui facilite davantage le rétablissement du flux sanguin. Confirmer le succès technique de l’opération en visualisant le sang oxygéné rouge vif pulsatile entrant dans la veine iliaque et se mélangeant au sang veineux foncé revenant du membre postérieur.
  13. Injecter une solution saline héparinée (0,2 UI/g)15 dans l’IVC pour l’anticoagulation systémique afin d’améliorer les résultats de perméabilité AVF.
    REMARQUE: Bien que cette étape se produise après la reconstruction vasculaire (par opposition à l’analogue humain où l’héparinisation se produit avant le serrage croisé des vaisseaux), une réduction des saignements peropératoires et une amélioration de la perméabilité AVF ont été observées lorsqu’elles sont effectuées à ce stade de la procédure. L’injection dans un site recouvert de fascia et/ou de graisse est préférable pour prévenir les saignements du site de ponction.
  14. Réinspecter le site chirurgical pour l’hémostase après l’injection de solution saline héparinisée. S’il n’y a pas de problèmes de saignement, fermez le fascia médian, puis l’incision cutanée avec des sutures résorbables 5-0 PGA en courant.
  15. Pour les opérations fictives, suivez toutes les étapes clés de la procédure, à l’exception de la formation AVF. Appliquez un seul nœud de la ligature de soie 4-0 à l’extrémité proximale du faisceau artérioveineux iliaque gauche et faites correspondre les temps de serrage aux chirurgies AVF (par exemple, ~ 20 min, selon les compétences du microchirurgien).

6. Soins postopératoires et mesure

  1. Après la fermeture de la laparotomie, mesurer la perfusion sanguine des muscles antérieurs bilatéraux du tibial et des pattes ventrales à l’aide de l’imagerie Doppler laser.
    NOTE: Les déficits de perfusion unilatéraux confirmeront le détournement du flux artériel de la fistule (« voler »).
  2. Administrer 0,1 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée et remettre la souris dans une cage à souris préchauffée avec une litière molle hautement absorbable avec nid.
  3. Laissez la souris récupérer dans la cage de souris préchauffée jusqu’à ce que l’anesthésie se dissipe, ce qui sera évident lorsque la souris est ambulatoire et interactive (~2 h). Pendant la récupération, donnez à la souris un accès facile à une alimentation hydratée et douce.
  4. Administrer de la buprénorphine et/ou une solution saline sous-cutanée toutes les 12 h jusqu’à 48 h et effectuer une surveillance quotidienne pendant 5 jours après l’opération. Euthanasier les animaux dont l’état se détériore ou dont la nécrose tissulaire est excessive, classés comme un score d’ischémie modifié ≥229.
  5. Utiliser des échographies duplex en série pour évaluer la perméabilité de la fistule après l’opération; les souris atteintes de thrombose de la fistule sont exclues des analyses ultérieures, sauf si le but des expériences est de caractériser l’échec de la maturation AVF.
  6. Déterminer d’autres mesures de résultats postopératoires telles que l’hémodynamique locale, la force de préhension et la performance de la marche pendant la période de récupération. Recueillir des fistules et des tissus musculaires pour évaluer l’histomorphologie à la fin de l’expérience pendant le sacrifice25,27.

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Résultats

Les animaux exposés à un régime adénine ont des taux de filtration glomérulaire réduits (contrôle : 441,3 ± 54,2 μL/min vs IRC : 165,1 ± 118,3 μL/min, p < 0,05) et une augmentation des taux sériques d’azote uréique dans le sang (témoin : 20,39 ± 4,2 μL/min vs IRC : 38,20 ± 10,65 μL/min, p < 0,05) par rapport aux animaux ayant reçu du chow à base de caséine, confirmant la présence d’une insuffisance rénale avant la chirurgie de la fistule artérioveineuse.

Valida...

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Discussion

La prévalence des patients hémodialysés atteints de MRA après la création de la FVA a continué d’augmenterde 30,31. En effet, les complications symptomatiques non résolues 4,32,33 telles que la douleur, la faiblesse, la paresthésie et/ou la réduction de l’amplitude des mouvements peuvent avoir un impact négatif sur le bien-être du patient 4,32,33,34,35,36 et menacer sa capacité à recevoir un traitement d’hémodialyse répétitive de haute qua...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions sincèrement le Dr Guanyi Lu de la Division de chirurgie vasculaire et de thérapie endovasculaire de l’Université de Floride pour le soutien technique sur le développement du modèle iliaque AVF, ainsi que la formation chirurgicale, et Ravi Kumar du Département de physiologie appliquée et de kinésiologie de l’Université de Floride pour le soutien technique pour obtenir les images microchirurgicales en direct.

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et du National Heart, Lung, and Blood, numéros d’institut R01-HL148697 (à S.T.S.), ainsi que par le numéro de subvention POST903198 de l’American Heart Association (à K.K.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,15 % Adénine régimeENVIGOTD.13089920 % caséine, 0,15 % adénine, 0,9 % P
0,2 % Adénine régimeENVIGOTD.13090020 % caséine, 0,2 % adénine, 0,9 % P
10-0 Suture nylonAD chirurgicalXXS-N1005T4
29 G Seringues à aiguillesExel International14-841-32
Seringues à aiguilles 31 GAdvocateU-100 seringue
4-0 suture en soieAD chirurgicaleS-S41813
Pince dumont coudée à 45 degrésOutils de science fine11253-25
5-0 Suture PGAAD chirurgicalePSGU-518R13
6-0 suture en soieAD chirurgicaleS-S618R13
Éponge en gélatine résorbableETHICON1975
Préparations à l’alcoolCovidien5110-cs400070 % alcool isopropylique
BuprénorphineNANA0,01 g/mL
C57BL6/J sourisJaxon Laboratory
Régime à la caséineENVIGOTD.13089820 % caséine, 0,9 % P
Cotons-tigesCONSTIXSC-9Coton-tige rond moyen à extrémité unique Cotons-tiges
CONSTIXSC-4Petit coton-tige dur, pointu, pointu à double extrémité
Éponges non tissées Curity (2x2)Covidien9022
Ciseaux à ressort Vannas incurvésOutils de science fine15001-08
Échographie DopplerVisualSonicsVevo 2100
Pince Graefe extra fineOutils de science fine11150-102 paires
Oeil lubrifiantCLCMEDICAOptixcare lubrifiant
Héparine (5000 U/mL)Liste nationale des codes de médicaments63739-953-25100 UI/mL
Stérilisateur à billes chaudesOutils de science fine18000-50
Cautère à basse températureBovieAA04
Coupe-plumeWahl5640-600
Gants chirurgicaux non poudrésAnsell7824PF
Porte-aiguilles à manche rondFine Science Tools12076-12
Serviette stérileDynarexDY440-MI
Stérilisé 0,9 % salineNational Drug Codes List46066-807-25
Pince Dumont droiteFine Science Tools11253-20
Porte-aiguille droitFine Science OutilsFST 12001-13
Ciseaux à ressort vannas droitsOutils scientifiques fins25001-08
TrizChLOR4Liste nationale des codes de médicaments17033-279-50
à insulinepour les yeux

Références

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