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Article de méthode

FACS-isolement et culture de progéniteurs fibro-adipogènes et de cellules souches musculaires à partir de muscles squelettiques de souris non perturbés et blessés

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DOI :

10.3791/63983

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8 juin 2022

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1Laboratory of Muscle Stem Cells and Gene Regulation, National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health (NIH), 2Flow Cytometry Section, National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS), National Institutes of Health (NIH)

Dans cet article

Résumé

L’identification précise des cellules progénitrices fibro-adipogènes (PAF) et des cellules souches musculaires (MuSC) est essentielle pour étudier leur fonction biologique dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole fournit des lignes directrices pour l’isolement, la purification et la culture des PAF et des MuSC à partir de muscles de souris adultes.

Résumé

Les cellules progénitrices fibro-adipogènes (FAP) sont une population de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) résidentes du muscle squelettique capables de se différencier selon une lignée fibrogénique, adipogénique, ostéogénique ou chondromogène. Avec les cellules souches musculaires (MuSC), les FAP jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie, la réparation et la régénération musculaires, tout en maintenant et en remodelant activement la matrice extracellulaire (ECM). Dans des conditions pathologiques, telles que les dommages chroniques et les dystrophies musculaires, les FAP subissent une activation aberrante et se différencient en fibroblastes et adipocytes producteurs de collagène, entraînant une fibrose et une infiltration graisseuse intramusculaire. Ainsi, les FAP jouent un double rôle dans la régénération musculaire, soit en maintenant le renouvellement du MuSC et en favorisant la réparation des tissus, soit en contribuant à la formation de cicatrices fibrotiques et d’infiltrats de graisse ectopique, qui compromettent l’intégrité et la fonction du tissu musculaire squelettique. Une purification adéquate des FAP et des MuSC est une condition préalable à la compréhension du rôle biologique de ces cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous décrivons une méthode standardisée pour l’isolement simultané des FAP et des MuSC des muscles des membres de souris adultes en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le protocole décrit en détail la dissociation mécanique et enzymatique des cellules mononucléées des muscles entiers des membres et des muscles tibiaux antérieurs (TA) blessés. Les FAP et les MuSC sont ensuite isolés à l’aide d’un trieur de cellules semi-automatisé pour obtenir des populations de cellules pures. Nous décrivons en outre une méthode optimisée pour la culture de FAP et de MuSC quiescents et activés, seuls ou dans des conditions de coculture.

Introduction

Le muscle squelettique est le plus grand tissu du corps, représentant ~ 40% du poids humain adulte, et est responsable du maintien de la posture, de la génération de mouvement, de la régulation du métabolisme énergétique de base et de la température corporelle1. Le muscle squelettique est un tissu très dynamique et possède une capacité remarquable à s’adapter à une variété de stimuli, tels que le stress mécanique, les altérations métaboliques et les facteurs environnementaux quotidiens. En outre, le muscle squelettique se régénère en réponse à une blessure aiguë, conduisant à une restauration complète de sa morphologie et de ses fonctions2. La plasticité des muscles squelettiques repose principalement sur une population de cellules souches musculaires résidentes (MuSC), également appelées cellules satellites, situées entre la membrane plasmique myofibreuse et la lame basale 2,3. Dans des conditions normales, les MuSCs résident dans la niche musculaire dans un état de repos, avec seulement quelques divisions pour compenser le renouvellement cellulaire et reconstituer le pool de cellules souches4. En réponse à une blessure, les MuSCs entrent dans le cycle cellulaire, prolifèrent et contribuent à la formation de nouvelles fibres musculaires ou retournent dans la niche dans un processus d’auto-renouvellement 2,3. En plus des MuSC, le maintien homéostatique et la régénération du muscle squelettique reposent sur le soutien d’une population de cellules résidentes musculaires appelées progéniteurs fibro-adipogènes (PAF)5,6,7. Les FAP sont des cellules stromales mésenchymateuses intégrées dans le tissu conjonctif musculaire et capables de se différencier le long de la lignée fibrogénique, adipogénique, ostéogène ou chondrogène 5,8,9,10. Les FAP fournissent un soutien structurel aux MuSC car ils sont une source de protéines de la matrice extracellulaire dans la niche des cellules souches musculaires. Les PAF favorisent également le maintien à long terme du muscle squelettique en sécrétant des cytokines et des facteurs de croissance qui fournissent un soutien trophique à la myogenèse et à la croissance musculaire 6,11. Lors d’une lésion musculaire aiguë, les FAP prolifèrent rapidement pour produire une niche transitoire qui soutient l’intégrité structurelle du muscle régénérant et fournit un environnement favorable pour soutenir la prolifération et la différenciation des MuSC de manière paracrine5. Au fur et à mesure que la régénération progresse, les FAP sont éliminés du muscle régénératif par apoptose, et leur nombre revient progressivement au niveau basal12. Cependant, dans des conditions favorisant les lésions musculaires chroniques, les FAP remplacent la signalisation pro-apoptotique et s’accumulent dans la niche musculaire, où ils se différencient en fibroblastes et adipocytes producteurs de collagène, entraînant des infiltrats de graisse ectopique et la formation de cicatrices fibrotiques12,13.

En raison de leur multipotence et de leurs capacités de régénération, les FAP et les MuSC ont été identifiés comme des cibles potentielles en médecine régénérative pour le traitement des troubles des muscles squelettiques. Par conséquent, pour étudier leur fonction et leur potentiel thérapeutique, il est important d’établir des protocoles efficaces et reproductibles pour l’isolement et la culture des FAP et des MuSC.

Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) permet d’identifier différentes populations cellulaires en fonction de caractéristiques morphologiques telles que la taille et la granularité, et permet une isolation spécifique à la cellule basée sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre les marqueurs de surface cellulaire. Chez les souris adultes, les MuSC expriment la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire 1 (VCAM-1, également connue sous le nom de CD106)14,15 et α7-Integrin 15, tandis que les FAP expriment le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes α (PDGFRα) et l’antigène des cellules souches 1 (Sca1 ou Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . Dans le protocole décrit ici, les MuSC ont été identifiés comme CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, tandis que les FAP ont été identifiés comme CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativement, des souris PDGFRαEGFP ont été utilisées pour isoler les FAP en tant qu’événements CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-18,19. De plus, nous avons comparé le chevauchement entre le signal fluorescent des cellules PDGFRα-GFP+ et les cellules identifiées par le marqueur de surface Sca1. Notre analyse a montré que toutes les cellules exprimant la GFP étaient également positives pour Sca1, ce qui indique que l’une ou l’autre approche peut être utilisée pour l’identification et l’isolement des FAP. Enfin, la coloration avec des anticorps marqueurs spécifiques a confirmé la pureté de chaque population cellulaire.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux effectuées ont été menées conformément aux directives institutionnelles approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux (ACUC) de l’Institut national de l’arthrite, des maladies musculo-squelettiques et cutanées (NIAMS). Les enquêteurs qui exécutent ce protocole doivent respecter leurs lignes directrices locales en matière d’éthique animale.

REMARQUE: Ce protocole décrit en détail comment isoler les FAP et les MuSC des muscles antérieurs (TA) des membres postérieurs et des tibiaux antérieurs (TA) blessés de souris mâles et femelles adultes (3-6 mois) et fournit des lignes directrices pour la coculture des FAP et des MuSC. La figure 1 donne un aperçu de la procédure expérimentale. Toutes les étapes de ce protocole doivent être effectuées dans des conditions stériles et à température ambiante (RT), sauf indication contraire.

1. Configuration du réactif

  1. Milieu de lavage (WM): Préparez cette solution en ajoutant 10% (vol/vol) de sérum de cheval et 1x pénicilline/streptomycine au milieu cellulaire F-10 Nutrient Mix de Ham. WM peut être préparé à l’avance et stocké à 4 °C.
  2. Tampon de dissociation musculaire (MDB): Préparez ce tampon en dissolvant la collagénase II dans WM. Si vous collectez des muscles entiers des membres postérieurs, dissoudre 1000 U/mL de collagénase II dans 10 mL de WM pour chaque souris (à préparer dans un tube conique de 50 mL). Si vous recueillez des muscles TA, dissoudre 800 U/mL de collagénase II dans 7 mL de WM pour chaque souris (à préparer dans un tube conique de 15 mL). Pour les muscles TA, cela aidera à mieux visualiser les granulés cellulaires et à obtenir un rendement plus élevé en FAP et MuSC. Préparez MDB frais avant de recueillir les muscles et gardez-le sur la glace jusqu’à ce que nécessaire.
  3. Stock de solution de collagénase II: Préparer cette solution en dissolvant la collagénase II dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x stérile jusqu’à une concentration finale de 1000 U/mL. Filtrer la solution à travers un filtre à seringue de 0,45 μm et la déverser en bouillons de 1 mL. Conserver la solution à -20 °C.
  4. Stock de solution de dispase: préparer cette solution en dissolvant la dispase dans 1x PBS stérile jusqu’à une concentration finale de 11 U/mL. Filtrer la solution à travers un filtre à seringue de 0,45 μm et la déverser en bouillons de 1 mL. Conserver la solution à -20 °C.
  5. Préparer le milieu de culture du FAP en complétant le DMEM avec 10 % (vol/vol) de sérum fœtal bovin, 1x pénicilline/streptomycine et 2,5 ng/mL de FGF. Conserver le milieu à 4 °C.
  6. Préparer le milieu de culture de MuSC complétant F10 avec 10% (vol/vol) de sérum de cheval, 1x pénicilline/streptomycine et 2,5 ng/mL de FGF. Conserver le milieu à 4 °C.
  7. Préparer le milieu de coculture en complétant le DMEM avec 10% (vol/vol) de sérum fœtal bovin, 10% (vol/vol) de sérum de cheval, 1x pénicilline/streptomycine et 2,5 ng/mL de FGF. Conserver le milieu à 4 °C.

2. Prélèvement musculaire des membres postérieurs

  1. Ajouter 2-3 ml de WM dans un plat de 6 cm (un plat par souris) et le placer sur de la glace.
  2. Pratiquer l’euthanasie par asphyxie : placer la souris dans une chambre de CO 2 et introduire 100% CO2. Utilisez la luxation cervicale pour confirmer le décès.
  3. Placez la souris en décubitus dorsal sur un tampon de dissection et vaporisez-la d’éthanol à 70 % (vol/vol) pour éviter toute contamination.
  4. Utilisez une pince pour pincer le centre de la peau du ventre de la souris et couper une ouverture de ~1 cm horizontalement. Saisissez les bords de la plaie et le bureau de la souris en tirant l’ouverture dans des directions opposées pour découvrir les muscles en dessous. Exposez un côté du membre postérieur de la souris à ce moment-là.
  5. Avant de prélever des muscles, retirez la graisse intermusculaire entre les ischio-jambiers et l’extrémité proximale du quadriceps. Cela améliorera l’isolement des FAP et des MuSC.
  6. Sans endommager le tissu, utilisez des pinces tranchantes pour casser et décoller le fascia afin d’exposer les muscles TA et extensor digitorum longus (EDL) sous les muscles TA et extensor digitorum longus (EDL). Passez l’extrémité pointue de la pince sous les muscles TA / EDL pour détacher les muscles du tibia.
  7. Coupez les tendons attachant le TA/EDL à la cheville et, tout en le tenant avec une pince, coupez les muscles avec des ciseaux le long de la ligne longitudinale du TA/EDL. Coupez les tendons autour du genou pour détacher tous les muscles TA / EDL. Placez les muscles dans un plat de 6 cm maintenu sur de la glace.
  8. Procéder à l’isolement des muscles gastrocnémiens et soléaires en coupant tous les tendons à la cheville et en détachant les muscles du tibia et du péroné. Couper autour du genou et transférer les muscles dans le plat de 6 cm.
  9. Décollez le fascia autour du quadriceps et séparez-le du fémur en faisant passer l’extrémité pointue de la pince entre le muscle et l’os. Coupez les tendons autour du genou et, tout en tenant les quadriceps avec une pince à l’extrémité distale, coupez le reste du muscle en coupant le long du fémur. Placez les muscles dans le plat de 6 cm.
  10. Détachez les ischio-jambiers et les muscles restants autour du fémur et transférez-les dans le plat de 6 cm. Rassemblez les muscles des membres postérieurs dans un plat de 6 cm conservé sur de la glace.
    REMARQUE: Évitez d’endommager les vaisseaux sanguins, dans la mesure du possible, pour prévenir la formation d’amas sanguins qui pourraient interférer avec l’isolement en aval. En cas de saignement, éponger immédiatement le vaisseau excisé avec une gaze stérile pour absorber le sang.
  11. Recueillir les muscles TA, EDL, gastrocnémien, soléaire, quadricep et ischio-jambiers du membre controlatéral.
    REMARQUE: Lorsque vous isolez l’ensemble des muscles des membres postérieurs, ne mélangez pas deux souris ou plus. Si vous isolez les muscles TA, jusqu’à trois muscles TA peuvent être mis en commun.

3. Digestion musculaire mécanique et enzymatique

  1. Aspirer WM de la capsule de 6 cm et ajouter 1-2 mL de MDB pour garder les muscles humides.
  2. Hacher soigneusement les muscles jusqu’à obtenir une pâte de boue de tissu bien émincé. Pour ce faire, utilisez une pince pour maintenir une extrémité d’un morceau de muscle, puis utilisez un scalpel pour déchirer et trancher le muscle jusqu’à ce qu’il soit moins serré.
  3. À l’aide de ciseaux, continuez à couper le muscle en petits morceaux pendant 1-2 minutes. Répétez cette étape pour chaque groupe de muscles jusqu’à obtenir une boue musculaire bien émincée.
    REMARQUE : Il s’agit d’une étape très importante pour maximiser le rendement des PAF et des MuSC. Il est recommandé de passer 8-10 min (4-5 min si vous isolez uniquement les muscles TA) dans cette étape pour assurer un hachage musculaire approprié.
  4. Transférer les muscles émincés de chaque souris dans le tube conique contenant MDB.
  5. Sceller les tubes avec un film de laboratoire et incuber dans un bain-marie à 37 °C avec agitation (75 tr/min) pendant 1 h. Placez les tubes horizontalement le long du chemin de secousse et utilisez des poids pour maintenir les tubes immergés dans l’eau.
  6. Décongeler 1 mL de bouillon de collagénase II et 1 mL de bouillon de dispase par souris. Avant utilisation, faire tourner le stock de dispase dans un rotor à godet oscillant à 10 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Utilisez uniquement le surnageant.
  7. Si des muscles entiers des membres postérieurs ont été recueillis, procédez comme suit:
    1. Après 1 h, retirer le tube de l’agitateur et le remplir à 50 mL avec WM. Retourner doucement plusieurs fois pour assurer le mélange.
    2. Centrifuger les cellules dans un rotor à godet oscillant à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Transférer 42 mL de surnageant dans deux nouveaux tubes (~21 mL dans chaque tube) et laisser ~8 mL dans le tube d’origine.
      1. Remplir les nouveaux tubes contenant 21 mL du surnageant jusqu’à 50 mL avec WM. Centrifuger à nouveau les cellules dans un rotor à godet oscillant à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Aspirez tout le surnageant et gardez les granulés sur la glace.
    3. Ajouter 1 mL de bouillon de collagénase II et 1 mL de bouillon de dispase dans le tube original contenant ~8 mL de MDB.
    4. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, remettre la pastille en suspension 10 fois sans colmatage. Éjectez la solution vers la paroi du tube, en évitant la formation de bulles. Si le colmatage se produit pendant la remise en suspension, poussez l’extrémité de la pipette contre le fond du tube pour perturber mécaniquement les morceaux musculaires. Passez à l’étape 3.9.
  8. Si les muscles TA ont été collectés, procédez comme suit:
    1. Après 1 h, retirer le tube de l’agitateur et le remplir à 15 ml de WM. Retourner doucement plusieurs fois pour assurer le mélange.
    2. Centrifuger les cellules dans un rotor à godet oscillant à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Transférer 13 mL de surnageant dans un nouveau tube de 15 mL et laisser ~2 mL dans le tube d’origine.
      1. Remplir le nouveau tube contenant 13 mL du surnageant jusqu’à 15 mL avec WM. Centrifuger à nouveau les cellules dans un rotor à godet oscillant à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Aspirez tout le surnageant et gardez le granulé sur la glace.
    3. À l’aide d’un embout de pipette de 1000 μL, remettre en suspension la pastille dans le tube d’origine de haut en bas sans colmatage.
    4. Ajouter 1 mL de bouillon de collagénase II et 1 mL de bouillon de dispase dans le tube original contenant 2 mL de MDB et remplir jusqu’à 10 mL de WM. Passez à l’étape 3.9.
  9. Sceller les tubes avec un film de laboratoire et incuber dans un bain-marie à 37 °C en agitant (75 tr/min) pendant 30 min. Placez les tubes comme à l’étape 3.5.

4. Génération de cellules mononucléées

REMARQUE: Si vous travaillez avec des muscles TA prélevés dans un tube conique de 15 mL, transférez la suspension dans un tube conique de 50 ml avant de passer à l’étape 4.1.

  1. Après 30 min, retirez le tube de l’agitateur. Aspirer et éjecter la suspension musculaire à travers une seringue de 10 ml avec une aiguille de 20 G avec succès 10 fois.
    REMARQUE: Éjectez la suspension musculaire vers la paroi du tube pour éviter les bulles et la mousse. De petits morceaux de tendons ou de cartilages non digérés peuvent obstruer l’aiguille pendant les premières séries d’aspiration. En cas de colmatage, utilisez des pinces stériles pour enlever le bouchon de la pointe de l’aiguille.
  2. Remplir chaque tube jusqu’à 50 ml avec WM et retourner doucement quelques fois pour assurer le mélange.
  3. Centrifuger les cellules dans un rotor à godet oscillant à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube (~42 mL) et laisser ~8 mL dans le tube d’origine.
    1. Remplir le nouveau tube contenant 42 mL du surnageant jusqu’à 50 mL avec WM. Centrifuger à nouveau les cellules dans un rotor à godet oscillant à 350 x g pendant 8 min à 4 °C. Aspirez tout le surnageant et gardez le granulé sur la glace.
  4. Placer une passoire à cellules en nylon de 40 μm dans le tube conique original de 50 mL contenant 8 mL de WM et prémouiller la crépine cellulaire avec 1-2 mL de WM.
  5. Tout en tenant la crépine à cellules en nylon de 40 μm, utilisez une pipette de 10 mL pour remettre doucement la pastille en suspension 5 à 10 fois. Filtrez les granulés à travers la crépine de cellules dans le même tube pour minimiser la perte de cellule.
  6. À cette étape, assurez-vous qu’il y a des tubes supplémentaires avec des pastilles de cellules sur de la glace. Filtrer ces pastilles dans le tube d’origine en ajoutant 4-5 mL de WM à chaque tube pour remettre les granulés en suspension et transférer la solution dans la crépine à cellules positionnée dans le tube d’origine. Permettre le filtrage par gravité.
  7. Après avoir recueilli toutes les pastilles dans le tube conique original de 50 mL, rincer la crépine cellulaire avec un autre 4-5 ml de WM. Utilisez une pipette de 1000 μL pour recueillir tout le liquide de la face inférieure de la crépine cellulaire.
  8. Remplir chaque tube avec WM jusqu’à 50 ml et retourner doucement quelques fois pour assurer le mélange.
  9. Centrifuger les cellules dans un rotor à godet oscillant à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer immédiatement tout le surnageant après centrifugation sans perturber la pastille.
  10. Remettez la pastille en suspension dans 600 μL de WM et transférez-la dans un tube microcentrifuge de 2 mL.

5. Coloration des anticorps pour la cytométrie en flux

REMARQUE : Pour chaque expérience, configurez les contrôles suivants : i) contrôle non coloré, ii) contrôle de la viabilité à sélectionner pour la population de cellules vivantes, iii) contrôles de compensation de coloration unique pour corriger le débordement des émissions de fluorochrome, et iv) contrôles de fluorescence moins un (FMO) pour établir les limites de déclenchement en tenant compte de la propagation des débordements. Reportez-vous au tableau 1 pour obtenir la liste complète des contrôles de coloration.

  1. Pour préparer un contrôle non coloré, transférer 10 μL de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant 190 μL de WM. Resuspendre la suspension cellulaire et filtrer à travers un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml avec un capuchon de crépine de 35 μm. Laissez la suspension filtrer par gravité.
  2. Utilisez une pipette de 200 μL pour recueillir tout le liquide de la face inférieure de la crépine cellulaire. Scellez avec un capuchon et laissez-le sur de la glace, à l’abri de la lumière.
  3. Préparer des contrôles de viabilité, de FMO et de coloration simple : étiqueter 10 tubes microcentrifuges de 2 mL et ajouter 190 μL de WM dans chaque tube et 10 μL de suspension cellulaire. Voir le tableau 1 pour obtenir la liste complète des contrôles. Ajouter des anticorps dans le tube approprié en fonction du contrôle expérimental. Se reporter au tableau 1 pour obtenir des renseignements sur la combinaison et la concentration d’anticorps.
  4. Transférer le reste de la suspension cellulaire (500 μL) dans un tube microcentrifuge de 2 mL (tube expérimental) et ajouter les anticorps suivants : CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotine et α7-Integrin-PE. Se reporter au tableau 1 pour obtenir des renseignements sur la combinaison et la concentration d’anticorps.
  5. Bien mélanger délicatement chaque tube pour assurer une distribution uniforme et incuber les cellules dans un agitateur rotatif à 4 °C pendant 45 min à l’abri de la lumière.
  6. Après 45 min, remplir tous les tubes microcentrifuges jusqu’à 2 mL avec WM. Retourner doucement les tubes plusieurs fois pour assurer un mélange complet. Centrifuger les tubes dans une centrifugeuse réfrigérée à rotor à angle fixe à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant sans déranger la pastille.
  7. Remettez les cellules en suspension dans tous les tubes de microcentrifugation dans 300 μL de WM.
  8. Ajouter l’anticorps anti-streptavidine dans les tubes appropriés. Se reporter au tableau 1 pour obtenir des renseignements sur la combinaison et la concentration d’anticorps. Bien mélanger délicatement chaque tube pour assurer une distribution uniforme et incuber les cellules dans un agitateur rotatif à 4 °C pendant 20 min à l’abri de la lumière. Laissez les tubes restants sur de la glace, à l’abri de la lumière.
  9. Après 20 min, remplir les tubes de microcentrifugation contenant des anticorps anti-streptavidine à 2 mL avec WM. Retourner doucement les tubes plusieurs fois pour assurer un mélange complet. Centrifuger les tubes dans une centrifugeuse réfrigérée à rotor à angle fixe à 250 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer complètement le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 300 μL de WM.
  10. Prémouiller le bouchon de la crépine cellulaire de 35 μm de 10 tubes à fond rond en polystyrène de 5 mL avec 200 μL de WM. Filtrer les cellules des tubes de contrôle à travers les tubes à fond rond en polystyrène de 5 mL appropriés. Utilisez une pipette de 200 μL pour recueillir tout le liquide de la face inférieure de la crépine cellulaire. Scellez avec des bouchons, laissez les tubes sur la glace et protégez-les de la lumière.
  11. Remettez en suspension les cellules dans le tube expérimental avec 200 μL supplémentaires de WM pour un total de 500 μL de WM. Pré-mouiller un capuchon de crépine cellulaire d’un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml avec 200 μL de WM. Transférer la suspension cellulaire du tube expérimental dans le tube à fond rond en polystyrène de 5 ml et lui permettre de filtrer par gravité.
  12. Rincer le tube microcentrifuge de 2 mL contenant la suspension expérimentale de l’échantillon avec 300 μL de WM et le faire passer à travers le même capuchon de crépine. Utilisez une pipette de 200 μL pour recueillir tout le liquide de la face inférieure de la crépine cellulaire. Scellez avec un capuchon, laissez les tubes sur la glace et protégez-les de la lumière.
    REMARQUE: Si le bouchon de la crépine cellulaire de 35 μm se produit, tapotez doucement le tube sur la paillasse pour faciliter l’écoulement.
  13. Préparer et étiqueter les tubes de prélèvement pour les PAF et les MuSC. Si vous isolez des cellules de muscles entiers des membres postérieurs, triez les cellules dans des tubes à fond rond en polypropylène de 5 ml avec jusqu’à 1 mL de FAP ou de milieu de culture MuSCs complété par 2x sérum. Si vous isolez des cellules des muscles TA, triez les FAP et les MuSC dans des tubes microcentrifugés de 2 mL contenant jusqu’à 400 μL de milieu de culture complété par 2x sérum.

6. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

REMARQUE: Ce protocole utilise un cytomètre de flux de recherche compact de paillasse équipé d’une buse de 100 μm et doté d’une configuration à trois lasers (488 nm, 640 nm, 405 nm) avec la capacité d’analyser jusqu’à neuf fluorochromes différents (11 paramètres, y compris la diffusion avant et latérale). Les fluorochromes utilisés dans ce protocole et leurs filtres passe-bande de détecteur associés sont les suivants: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Bleu Pacifique 448/45; 7-aminoactinomycine D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Les cellules sont triées à 4 °C et restent sur la glace après le tri. Avant d’utiliser cet instrument, assurez-vous que l’utilisateur est correctement formé par un spécialiste des applications techniques.

  1. Configurez et vérifiez les performances du trieur de cellules conformément aux spécifications du fabricant.
  2. Mettre en place une stratégie hiérarchique d’établissement de points de contrôle pour identifier les FAP et les MuSC (Figure 2).
    1. Isoler les FAP selon le schéma suivant : i) zone de diffusion des cellules vers l’avant par rapport à la zone de diffusion des cellules latérales (FSC-A par rapport à la SSC-A) pour séparer les cellules par rapport aux débris, ii) hauteur de diffusion des cellules latérales par rapport à la largeur de diffusion des cellules latérales (SSC-H par rapport à SSC-W) pour distinguer les singuliers des doublets dans la plage SSC, iii) hauteur de diffusion des cellules vers l’avant par rapport à la largeur de diffusion avant des cellules (FSC-H vs FSC-W) pour distinguer les singuliers des doublets dans la plage FSC, et iv) la zone 7-AAD par rapport à la SSC-A pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
      1. Si vous isolez les FAP par la méthode basée sur les anticorps, utilisez le schéma suivant : v) zone APC-CD45/CD31 vs zone Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) pour exclure les cellules CD31+ et CD45+ d’une analyse plus approfondie, et vi) zone PE-Cy7-VCAM-1 vs zone PE-α7-intégrine de la population CD31-/CD45-/Sca1+ pour distinguer les FAP. Les FAP sont identifiés comme des événements CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-.
      2. Si vous isolez des PAF par la méthode de déclaration de la GFP endogène, utilisez le schéma suivant : v) aire APC-CD45/CD31 vs zone GFP-PDGFRα pour exclure les cellules CD31+ et CD45+ d’une analyse plus approfondie et isoler les cellules GFP+. Les FAP sont identifiés comme des événements CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-.
    2. Isoler les MuSC en fonction du schéma suivant : i) zone de diffusion des cellules avant par rapport à la zone de diffusion des cellules latérales (FSC-A par rapport à la SSC-A) pour séparer les cellules par rapport aux débris, ii) hauteur de diffusion des cellules latérales par rapport à la largeur de diffusion des cellules latérales (SSC-H par rapport à SSC-W) pour distinguer les singuliers des doublets dans la plage SSC, iii) hauteur de diffusion des cellules avant par rapport à la largeur de diffusion des cellules avant (FSC-H vs FSC-W) pour distinguer les singuliers des doublets dans la gamme FSC, iv) zone 7-AAD vs SSC-A pour distinguer les cellules vivantes et mortes, v) zone APC-CD45/CD31 vs zone Pacific Blue-Ly-6A/E (Sca1) zone pour exclure les cellules CD31+ et CD45+ d’une analyse plus approfondie, et vi) zone PE-Cy7-VCAM-1 vs zone PE-α7-intégrine de la population CD31-/CD45-/Sca1- pour distinguer les MuSC. Les MuSC sont identifiés comme des événements CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+.
  3. Exécutez le contrôle non coloré et le contrôle de viabilité pour vous assurer que la population cellulaire est correctement positionnée dans le diagramme SSC-A vs FSC-A et pour contrôler correctement les cellules individuelles vivantes.
  4. Acquérir tous les contrôles tachés uniques et générer la matrice de compensation des débordements.
  5. Exécutez tous les contrôles FMO et déterminez le point de coupure entre la propagation de la fluorescence de fond et la population colorée positivement.
  6. Environ 5 à 10 minutes avant l’acquisition de l’échantillon expérimental, ajouter le colorant de viabilité 7-AAD et mélanger doucement.
  7. Une fois que tous les contrôles ont été traités, régler les portes de tri conformément aux contrôles de l’OGF; acquérir et trier les échantillons expérimentaux.
  8. Une fois tous les échantillons traités, nettoyez le cytomètre conformément aux spécifications du fabricant. Exportez toutes les données .fcs pour analyse.

7. Culture des PAF et des CSMU

NOTE: Les cellules triées doivent être cultivées immédiatement après le tri, dans un milieu approprié sur des plaques enduites de collagène I.

  1. Centrifuger les tubes de collecte dans un rotor à angle fixe à 250 x g pendant 5 min à 4 °C.
  2. Aspirer le surnageant sans perturber la pastille de cellule.
  3. Pour la culture de MuSC, remettre les cellules en suspension dans un volume approprié de milieu de culture MuSC et les incuber dans des conditions standard à 37 °C et 5% de CO2.
    1. Plaquer des MuSC fraîchement isolés à une densité de 20 000 cellules/cm2 et des MuSC activés à une densité de 15 000 cellules/cm2.
    2. Après le placage, les cellules apparaissent petites, sphériques et translucides. Dans les 36 h, les MuSC adhèrent à la surface de la plaque et augmentent lentement leur taille pendant les 48 premières heures.
    3. Remplacez le milieu tous les 2 jours.
      REMARQUE: Les MuSC sont très sensibles à la densité cellulaire. Pour maintenir les MuSC dans leur état de prolifération, cultivez-les jusqu’à ce qu’ils soient confluents à 60%-70%. Passage des cellules dans du nouveau collagène J’ai enduit des plats ou des assiettes et ajouter un nouveau milieu frais tous les 2 jours. Si les MuSC sont conservés dans le même plat ou la même assiette pendant plus de 3-4 jours, ils acquerront une forme allongée et s’aligneront avec les cellules voisines jusqu’à fusion.
  4. Pour la culture de FAP, remettre les cellules en suspension dans un volume approprié de milieu de culture MuSC et les incuber dans des conditions standard à 37 °C et 5% de CO2.
    1. Plaquer les FAP isolés du muscle non perturbé à une densité de 15 000 cellules/cm2 et les FAP isolés du muscle blessé à 9 000 cellules/cm2.
      NOTE: Après le placage, les FAP adhèrent complètement à la surface de la plaque dans les 48 heures, tandis que les FAP activés se fixent à la plaque en quelques heures. Une fois attachés, les FAP acquièrent leur forme caractéristique, avec un petit corps cellulaire et des processus cellulaires allongés, et ils prolifèrent rapidement.
    2. Remplacez le milieu tous les 2 jours.
      REMARQUE: Les FAP sont très sensibles à la densité cellulaire. L’ensemencement des PAF à faible densité peut entraîner une faible croissance cellulaire et la mort cellulaire. Au contraire, le placage des PAF à haute densité d’ensemencement stimulera la survie des cellules et améliorera leur expansion. Les FAP provenant de muscles endommagés nécessitent généralement une densité cellulaire inférieure à celle du muscle non endommagé, car ils sont déjà activés. Il est recommandé d’ajuster la densité de placage FAP en fonction des conditions expérimentales et de la source des échantillons.
  5. Pour la coculture, remettre en suspension les FAP et les MuSC dans le milieu de coculture dans un rapport de 1:1 et incuber ceux dans des conditions normales à 37 °C et 5 % de CO2. Laisser les cellules se fixer pendant 48 h et remplacer le milieu tous les 2 jours.

8. Analyse d’immunofluorescence des FAP et des MuSC cultivés

  1. Aspirez le milieu cellulaire et effectuez deux ou trois lavages avec 1x PBS.
  2. Fixer les cellules avec 2% de paraformaldéhyde (PFA) dans 1x PBS pendant 15 min à TA.
  3. Aspirez 2% PFA et lavez rapidement les cellules deux ou trois fois avec 1x PBS.
  4. Effectuer la perméabilisation et le blocage cellulaires:
    1. Pour l’immunomarquage des PAF fraîchement isolées, effectuer la perméabilisation et le blocage cellulaires en incubant les cellules avec 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% d’albumine sérique bovine (BSA) + 5% de sérum normal d’âne (NDS) pendant 30 min à TA.
    2. Pour l’immunomarquage des MuSC fraîchement isolés, effectuer la perméabilisation et le blocage cellulaires en incubant les cellules avec PBST + 1% BSA + 5% de sérum de chèvre normal (NGS) pendant 30 min à TA.
  5. Appliquer des anticorps primaires :
    1. Pour l’immunocoloration des PAF fraîchement isolées, appliquer l’anticorps primaire anti-PDGFRα de chèvre (1:300) dilué dans du PBST + 1 % de BSA + 5 % de NDS pendant une nuit à 4 °C.
    2. Pour l’immunocoloration des MuSC fraîchement isolés, appliquer l’anticorps primaire anti Pax7 de souris (1:10) dilué dans du PBST + 1% BSA + 5% NGS pendant 45 min à TA.
  6. Lavez les cellules deux ou trois fois avec 1x PBS pour éliminer la solution d’anticorps primaire.
  7. Appliquer des anticorps secondaires :
    1. Pour l’immunocoloration des FAP fraîchement isolées, appliquer l’anticorps secondaire Alexa Fluor 488 Alexa 488 anti-chèvre (1:500) dilué dans du PBST + 1% BSA pendant 1 h à TA.
    2. Pour l’immunomarquage des MuSC fraîchement isolés, appliquer l’anticorps secondaire IgG 1 Alexa Fluor 555 (1:500) anti-souris de chèvre dilué dans du PBST +1 % BSA pendant 45 min à TA.
  8. Lavez les cellules deux ou trois fois avec 1x PBS pour éliminer la solution d’anticorps primaire.
  9. Effectuer une contre-coloration nucléaire en incubant des cellules avec DAPI dans PBST (1:1000) pendant 5 min à RT.
  10. Lavez les cellules trois fois avec 1x PBS pour retirer la solution DAPI.
    ATTENTION : Le DAPI est toxique et dangereux; Manipulez-le avec soin et jetez-le dans le flacon de déchets dangereux.
  11. Conserver les cellules à 4 °C à l’abri de la lumière.

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Résultats

Ce protocole permet d’isoler environ un million de PAF et jusqu’à 350 000 MuSC à partir de membres postérieurs non blessés de souris adultes de type sauvage (3 à 6 mois), ce qui correspond à un rendement de 8 % pour les PAF et de 3 % pour les MuSC d’événements totaux. Lors du tri des cellules de TA endommagées 7 jours après la blessure, deux à trois muscles TA sont mis en commun pour obtenir jusqu’à 300 000 FAP et 120 000 MuSC, ce qui correspond à un rendement de 11% et 4%, respectivement. Les valeurs de pureté post-tri ...

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Discussion

L’établissement de protocoles efficaces et reproductibles pour l’identification et l’isolement des populations de cellules souches adultes pures est la première et la plus importante étape pour comprendre leur fonction. Les FAP et les MuSC isolés peuvent être utilisés pour effectuer des analyses multiomiques dans des expériences de transplantation en tant que traitement potentiel des maladies musculaires ou peuvent être génétiquement modifiés pour la modélisation de la maladie dans la thérapie par cellules souches.

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Remerciements

Nous tenons à remercier Tom Cheung (Université des sciences et technologies de Hong Kong) pour ses conseils sur l’isolement du MusC. Ce travail a été financé par le NIAMS-IRP grâce aux subventions AR041126 et AR041164 des NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à fond rond en polypropylène de 5 mlFalcon352063
Tube à fond rond en polystyrène de 5 ml avec capuchon de filtrecellulaire Falcon352235
Aiguille BD de 20 g à usage unique de 1 po, stérileBD Biosciences.
anti-Alpha 7 Integrin PE (clone :R2F2) (RatIgG2b)Université de la Colombie-Britannique53-0010-01
APC anti-souris CD31 AnticorpsBioLegend102510
APC anti-souris CD45 AntibodyBioLegend103112
BD FACSMelody Cell SorterBD Biosciences  ;
Seringue de contrôle de l’embout BD Luer-Lok, 10 mLBD Biosciences  ;
Souris anti-biotine Anticorps CD106BioLegend105703
souris C57BL/6J (femelle et mâle)The Jackson Laboratory000664
B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Souris Sor/JThe Jackson Laboratory007669
Corning BioCoat Collagen I Plaque multipuits traitée TC à 6 puits Clear Flat BottomCorning356400
Corning BioCoat Collagen I Plaque multipuits 12 puits à fond plat transparent traitée TC Corning356500
Corning BioCoat Collagen I Plaque multipuits transparente à fond plat traitée TC 24 puitsCorning356408
solution DAPI (1 mg/mL)ThermoFisher Scientific62248
Pipettes aspirantes jetables, polystyrène, stérileVWR414004-265
Anticorps secondaire anti-chèvre IgG (H+L) hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11055
Falcon 40 µ ; m Passoire cellulaire, bleu, stérileCorning352340
Falcon 60 mm Boîte de culture cellulaire traitée TC,Corning353002
Falcon Tubes à centrifuger, polypropylène, stérile, Corning, 15 mlVWR352196
Falcon, polypropylène, stérile, Corning, 50 mlCorning352070
Falcon à fond rond, polypropylène, CorningVWR60819-728
Falcon Tubes à fond rond, polystyrène, avec capuchon de crépine cellulaire 35um CorningVWR21008-948
Facteur de croissance des fibroblastes, basique, humain, recombinant (rhFGF, Basic)PromegaG5071
FlowJo 10.8.1
Gibco Collagenase, Type II, poudreThermoFisher Scientific17101015
Gibco Dispase, poudreThermoFisher Scientific17105041
Gibco DMEM, haute teneur en glucose, HEPESThermoFisher Scientific12430054
Gibco Fetal Bovin Serum, certifié, États-UnisThermoFisher Scientific16000044
Gibco Ham’s F-10 Nutrient MixThermoFisher Scientific11550043
Gibco Horse Sérum, origine néo-zélandaiseThermoFisher Scientific16050122
Gibco PBS, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010023
Gibco PBS (10x), pH 7,4ThermoFisher Scientific70011044
Gibco Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100x)ThermoFisher Scientific10378016
Anticorps secondaire à absorption croisée IgG1 de la souris, Alexa Fluor 555ThermoFisher ScientificA-21127
Ciseaux fins durcisFine Science Tools Inc14090-09
Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycine D)ThermoFisher ScientificA1310
Souris PDGF  ; Anticorps R alphaR& D SystemsAF1062
Sérum d’âne normalFisher ScientificNC9624464
Sérum de chèvre normalThermoFisher Scientific31872
Bleu Pacifique anti-souris Ly-6A/E (Sca 1) AnticorpsBioLegend108120
Paraformaldéhyde, 16Fisher ScientificNCC0528893
Anticorps monoclonal de souris Pax7 (IgG1) (surnageant)Étude développementale Hybridoma BankN/A
PE/Cyanine7 StreptavidinBioLegend405206
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools Inc91500-09
Student Dumont #5 ForcepsFine Science Tools Inc91150-20
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
305175309604 stérile Tubes à centrifuger  %

Références

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