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Article de méthode

Anesthésie et intubation de bébés souris préadolescents pour la chirurgie cardiothoracique

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DOI :

10.3791/64004

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2 juin 2022

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1Molecular Cardiology and Biophysics Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent’s Clinical School, University of New South Wales Sydney, 3Department of Anaesthesia, The Children’s Hospital at Westmead, 4School of Child and Adolescent Health, University of Sydney

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les modèles chirurgicaux cardiothoraciques chez les souris âgées de >7 jours nécessitent une intubation, mais cela est difficile pour les bébés souris préadolescents (8-14 jours) et il existe peu d’informations sur les régimes anesthésiques pour l’intubation. Ici, nous présentons des schémas posologiques de kétamine / xylazine / atropine chez des bébés souris C57BL / 6J âgés de 10 jours qui permettent l’intubation endotrachéale, tout en minimisant la mortalité animale.

Résumé

Les modèles chirurgicaux murins jouent un rôle important dans la recherche préclinique. Des connaissances mécanistes sur la régénération du myocarde après une lésion cardiaque peuvent être obtenues à partir de modèles de chirurgie cardiothoracique chez des souris âgées de 0 à 14 jours, dont les cardiomyocytes conservent une capacité proliférative, contrairement à ceux des adultes. Les bébés souris jusqu’à l’âge de 7 jours sont efficacement immobilisés par hypothermie et ne nécessitent pas d’intubation pour la chirurgie cardiothoracique. Les bébés souris préadolescents (8-14 jours), cependant, nécessitent une intubation, mais cela est difficile et il y a peu d’informations concernant l’anesthésie pour faciliter l’intubation. Ici, nous présentons des schémas posologiques de kétamine / xylazine / atropine chez des bébés souris C57BL / 6J âgés de 10 jours qui permettent l’intubation endotrachéale, tout en minimisant la mortalité animale. Le titrage empirique des schémas posologiques de kétamine/xylazine/atropine en fonction du poids corporel a indiqué que la réponse à l’anesthésie des bébés souris de poids différents était non linéaire, des doses de 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg et 50/6/0,18 mg/kg facilitant l’intubation des petits pesant entre 3,15 et 4,49 g (n = 22), 4,50 à 5,49 g (n = 20) et 5,50 à 8,10 g (n = 20), respectivement. Les chiots de poids inférieur ont nécessité plus de tentatives d’intubation que les chiots plus lourds (p < 0,001). La survie après l’intubation était corrélée au poids corporel (59 %, 70 % et 80 % pour les groupes de poids faible, moyen et élevé, respectivement,R2 = 0,995). Pour la chirurgie de l’infarctus du myocarde après intubation, un plan chirurgical d’anesthésie a été induit avec 4,5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène et maintenu avec 2% d’isoflurane dans 100% d’oxygène. La survie postopératoire était similaire pour les trois groupes de poids à 92 %, 86 % et 88 % (p = 0,91). Avec les améliorations apportées aux pratiques de manipulation des animaux pour l’intubation et la chirurgie, et la minimisation de la cannibalisation par la mère après la chirurgie, la survie globale pour l’ensemble de la procédure (intubation plus chirurgie) était corrélée au poids corporel (55%, 60% et 70% pour les groupes de poids faible, moyen et élevé, respectivement, R2 = 0,978). Compte tenu de la difficulté rencontrée avec l’intubation des chiots de 10 jours et de la mortalité élevée associée, nous recommandons que la chirurgie cardiothoracique chez les chiots de 10 jours soit limitée aux chiots pesant au moins 5,5 g.

Introduction

Les modèles murins sont des outils précieux dans la recherche cardiothoracique préclinique, en particulier en raison de la facilité avec laquelle des lignées de souris génétiquement modifiées peuvent être générées, et aussi de la facilité avec laquelle les souris peuvent être manipulées chirurgicalement pour fournir des modèles pathologiques de maladie permettant, par exemple, l’étude de la régénération myocardique après une lésion cardiaque1 . À cet égard, il est intéressant de noter que, contrairement aux souris adultes chez lesquelles les cardiomyocytes se sont retirés du cycle cellulaire, les cœurs de souris néonatales âgés de 0 à 2 jours se réparent avec une cicatrisation minimale après une résection apicale ou l’induction d’un infarctus du myocarde 2,3,4. En revanche, les cœurs néonatals âgés de 7 jours se régénèrent incomplètement avec une incidence plus élevée de cicatrices 2,3. Étant donné que les cardiomyocytes situés dans l’apex du ventricule gauche conservent une capacité proliférative jusqu’à 2 semaines après la naissance, les études mécanistes de la régénération après une lésion cardiaque chez des souris âgées de 0 à 14 jours peuvent être instructives pour identifier des cibles thérapeutiques pour la régénération du cœur adulte blessé5.

Le développement de modèles murins de lésions cardiaques implique une manipulation chirurgicale sous anesthésie. Cela nécessite que le thorax soit ouvert pour accéder au cœur, ce qui nécessite généralement une intubation et une ventilation mécanique. La souche de souris, le poids corporel et l’âge influencent la sensibilité aux anesthésiques6. Les souris adultes peuvent être anesthésiées avec un large éventail d’agents, un schéma d’intubation courant étant la kétamine/xylazine/atropine à 100/13/0,5 mg/kg 6,7. Les souris néonatales (0-7 jours) n’ont pas de réflexe douloureux centralisé et peuvent être efficacement immobilisées sur la glace et soumises à une intervention chirurgicale sans intubation 6,8,9. Les bébés souris préadolescents (8-14 jours) ne peuvent pas être anesthésiés par hypothermie 9,10; Ils nécessitent une intubation pour la chirurgie cardiothoracique. Il n’existe aucune étude antérieure sur la chirurgie cardiothoracique chez des souris préadolescentes âgées de moins de 14 jours. D’après notre expérience, l’intubation de souris préadolescentes de moins de 14 jours anesthésiées à l’isoflurane est difficile. Le schéma anesthésique injectable recommandé pour les souris âgées de plus de 7 jours est de 50 à 150 mg/kg de kétamine et de 5 à 10 mg/kg de xylazine10. Les souris préadolescentes sont encore en développement neurologique et leurs réponses aux médicaments et au métabolisme des médicaments sont très différentes de celles des animaux adultes6. Cela pose un risque accru de déséquilibre hydrique, électrolytique et acido-basique, ainsi que d’hypoglycémie et d’hypothermie en raison non seulement de leur taux métabolique élevé, qui épuise rapidement leurs réserves d’énergie limitées, mais aussi de leur immaturité thermorégulatrice 6,11,12. Ainsi, il existe peu d’informations sur les régimes anesthésiques qui facilitent l’intubation et maximisent la survie des souris préadolescentes.

Ici, nous avons ajusté empiriquement les schémas posologiques de kétamine / xylazine / atropine chez des bébés souris C57BL / 6J âgés de 10 jours pesant de 3 à 8 g pour obtenir un plan d’anesthésie suffisant pour permettre une intubation endotrachéale pour une chirurgie cardiothoracique ultérieure, tout en minimisant la mortalité animale. Nous avons également affiné les pratiques de manipulation des animaux afin de réduire la mortalité due à l’intubation, à la chirurgie et au cannibalisme maternel post-chirurgical.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’hôpital Garvan/St Vincent, conformément au Code de pratique australien pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et aux directives ARRIVE, et toutes les expériences ont été effectuées par un chirurgien expérimenté spécialisé dans les petits animaux (JW) avec les conseils d’un anesthésiste pédiatrique (JJS).

1. Préparation des instruments

  1. Le jour de la chirurgie, installez de l’équipement spécialisé pour l’intubation des petits de 10 jours (figure 1A,B). Cela comprend une lampe chauffante, une plate-forme d’intubation, une lumière à fibre optique, de petites pinces, un laryngoscope fabriqué à partir d’un morceau de fil de cuivre de 0,02 mm de diamètre (60 mm de longueur avec l’extrémité du fil façonnée en un cercle de 3 mm de diamètre à un angle de 175°; Figure 1B) et une canule intraveineuse en plastique de calibre 24, qui est utilisée comme tube endotrachéal.
  2. Assurez-vous que la canule est constituée d’un tube en plastique de 19 mm de long (0,7 mm de diamètre extérieur) fixé à un adaptateur de verrouillage luer femelle en plastique de 21 mm (figure 1B). Renforcez le tube de la canule en insérant un morceau de fil de cuivre via l’adaptateur de verrouillage luer. Utiliser une canule d’un volume total de 130 μL pour une souris dont le volume courant est de ~8 μL/g13,14.

2. Anesthésie de souris âgées de 10 jours

  1. Le jour de la chirurgie, retirez la mère d’une cage de chiots C57BL/6J âgés de 10 jours et placez la cage sur une plateforme chauffante (37 °C).
  2. Anesthésier les petits par injection intrapéritonéale de 10 μL par g de poids corporel à l’aide d’une seringue à insuline de 0,5 mL et d’une aiguille de 29 G avec de la kétamine/xylazine/atropine dans les rapports détaillés dans le tableau 1 pour différents groupes de poids.
  3. Immédiatement après l’injection, placez le chiot dans une chambre en plexiglas chauffée (37 °C) qui a été pré-oxygénée avec 100% d’oxygène.

3. Intubation de souris âgées de 10 jours

  1. Après 3-4 min d’oxygénation, transférer le chiot sur une plateforme d’intubation essentiellement comme pour les souris adultes. Effectuez cette opération avec le chiot en décubitus dorsal (figure 1C) ou suspendu à un angle de 45°15. Maintenez la température avec une lampe chauffante.
    1. Avant l’intubation, évaluer la profondeur de l’anesthésie par le réflexe de pincement de la patte. Pour une intubation optimale, le réflexe de pincement de la patte doit toujours être présent mais nettement réduit par rapport à celui d’un animal conscient.
  2. Après avoir fixé le chiot anesthésié en décubitus dorsal à une plate-forme d’intubation (figure 1C), tenez la langue avec une petite pince et utilisez un laryngoscope fabriqué à partir d’un morceau de fil de cuivre (figure 1B) pour exposer la glotte et les cordes vocales. Aide à la visualisation des cordes vocales par trans-illumination avec une lumière flexible à fibre optique (Figure 1D).
  3. À l’aide d’une canule raidie, inclinez la canule de manière à ce que l’extrémité du verrou luer soit légèrement plus basse (~10°) que l’extrémité de la pointe, et dès que les cordes vocales se séparent, insérez la canule et avancez-la jusqu’à ce que l’adaptateur de verrouillage luer soit juste à l’extérieur de la bouche. Retirez le fil immédiatement après l’intubation.
    NOTE: Aucune résistance pendant l’intubation n’est attendue chez les souris de cet âge, sauf si la canule est trop avancée et que la résistance est ressentie de la carène.
    1. Évaluer la profondeur de l’anesthésie après l’intubation par la capacité de l’animal à respirer spontanément. Confirmer la réussite de l’intubation trachéale des chiots qui respirent spontanément en bloquant brièvement le cathéter d’intubation pour vérifier que cela empêche les mouvements thoraciques.
  4. Transférer immédiatement le chiot intubé dans un coussin chauffant (37 °C) et connecter la canule endotrachéale à un ventilateur délivrant 100 % d’oxygène à un débit de 1 L/min avec 30 μL/course, 40 μL/course ou 50 μL/course pour 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g ou 5,50-8,10 g pour les petits, respectivement, et 150 coups/min.
  5. Effectuez ces procédures rapidement, dans les <15 s pour minimiser la respiration de nouveau.

4. Chirurgie de l’infarctus du myocarde de souris âgées de 10 jours

  1. Pour induire un plan chirurgical d’anesthésie pour la chirurgie, basculez le gaz circulant dans le ventilateur de 100% d’oxygène à 4,5% d’isoflurane dans l’oxygène (la concentration d’isoflurane étant déterminée par un vaporisateur) pendant 4-5min.
    1. Après le passage à l’isoflurane, confirmer à nouveau l’intubation trachéale en vérifiant que la fréquence des mouvements de la paroi thoracique est égale à celle du ventilateur. La perte de respiration spontanée suivie de l’absence d’un réflexe de pincement de la queue ou de la patte indique qu’un plan chirurgical d’anesthésie a été atteint (après 4-5 min).
  2. Maintenir l’anesthésie avec 2% d’isoflurane dans l’oxygène.
  3. Effectuer une chirurgie d’infarctus du myocarde sous un microscope chirurgical (objectif 10x et 16x) comme décrit en16.
    1. Désinfectez la peau en mouvement circulaire plusieurs fois avec des rondes alternées d’un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine et d’alcool à 70%. À l’aide de ciseaux fins, faites une incision cutanée horizontale entre la troisième et la quatrième côte (quatrième espace intercostal) dans la paroi latérale gauche de la poitrine. À l’aide d’une pince fine, ouvrez le thorax par dissection émoussée de l’espace intercostal et utilisez un rétracteur pour garder l’espace ouvert.
    2. Induire un infarctus du myocarde par ligature de l’artère coronaire gauche juste distale à l’appendice auriculaire gauche avec suture monofilament de polypropylène 9-0. Après la chirurgie de ~10 min d’infarctus, fermez la peau avec 7-0 prolene et désinfectez l’incision avec de la bétadine. Nettoyez le chiot du sang avec de l’éthanol à 70% ou une solution saline.
      REMARQUE: La ligature de l’artère coronaire gauche chez les chiots préadolescents est essentiellement sans effusion de sang, comme c’est le cas avec les ligatures adultes.
    3. Administrer l’un après l’autre avec une seringue à insuline de 0,5 mL et une aiguille de 29 G : atipamezole (1-5 mg/kg, 10 μL, intrapéritonéal) pour une récupération rapide de la sédation, analgésie (buprénorphine, 0,075 mg/kg, 10 μL, sous-cutanée) et solution saline (50 μL, intrapéritonéale).
  4. Permettre aux animaux de se rétablir en arrêtant l’isoflurane. Assurez-vous que la respiration spontanée reprend quelques minutes après.
    1. Remettre le chiot dans la chambre pré-oxygénée chauffée et surveiller continuellement pendant la récupération jusqu’à ce que le réflexe de redressement soit retrouvé, après quoi extuber le chiot.
    2. Frottez doucement le chiot avec la litière de la cage domestique, gardez le chiot au chaud, vérifiez que la respiration est régulière et que le chiot est capable de mouvement spontané. Cela réduira le cannibalisme post-opératoire par la mère.
  5. Remettez la mère dans la cage lorsque tous les chiots se sont complètement remis de l’anesthésie.
    REMARQUE: Le temps total nécessaire à la préparation, à l’anesthésie, à l’intubation, à la chirurgie et à la récupération d’un chiot peut varier de 40 à 60 minutes.
  6. Mère de maison et chiots pendant la nuit dans une cage placée à moitié sur une aire chauffante à 37 °C.

5. Évaluation postopératoire de la taille de l’infarctus

  1. Le 3e jour suivant la chirurgie, anesthésiez les petits en les plaçant dans une chambre en plexiglas prééquilibrée avec 4,5 % d’isoflurane dans l’oxygène à un débit de 1 mL/min.
  2. Une fois qu’un plan chirurgical d’anesthésie a été atteint (après 4-5 min), évalué par le réflexe de pincement de la patte, retirez le chiot de la chambre et fixez-le en décubitus dorsal sur un coussin chauffant en collant la queue.
  3. Placez un fil sur les incisives et du ruban adhésif en position pour maintenir la tête étendue et placez la tête dans un cône nasal relié à un ventilateur délivrant 4,5 % d’isoflurane dans l’oxygène à 200 μL/course, 150 coups/min. Maintenir un plan chirurgical d’anesthésie avec 2% d’isoflurane dans l’oxygène.
  4. Désinfectez la peau avec de l’éthanol à 70%. À l’aide de ciseaux fins, faire une incision de 1 cm dans la peau sur l’artère carotide commune droite le long de la trachée et canuler le vaisseau exposé à l’aide d’un tube en polyéthylène à lumière unique (DO 0,61 mm, ID 0,28 mm) pour administrer 0,2 mL de solution saline héparinée (200 U) pendant 1 min pour prévenir la coagulation du sang.
  5. Augmenter l’isoflurane à 4,5 % dans l’oxygène pendant 1 min avant d’administrer rapidement 0,2 mL de 3,3 M KCl en 2 s pour arrêter le cœur en diastole.
  6. Disséquez la veine jugulaire droite via la même incision et transectez-la. Perfuser le cœur avec 0,2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis perfuser avec 0,1 mL de bleu d’Alcian à 0,2% pour colorer le myocarde à distance non infarctus. Vérifiez la perfusion réussie, mise en évidence par le lavage du sang, PBS, puis bleu d’Alcian via la veine jugulaire.
  7. Ouvrez le thorax et excisez le cœur en disséquant le tissu conjonctif et les vaisseaux environnants pour libérer le cœur. Rincez le cœur dans PBS, retirez les oreillettes si vous le souhaitez et photographiez le cœur avec une caméra montée sur un microscope chirurgical à l’aide d’un objectif 10x.

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Résultats

Anesthésie de souris âgées de 10 jours. Les petits de 10 jours peuvent être anesthésiés avec 4,5% d’isoflurane en 4-5 min; Cependant, ils se rétablissent de l’anesthésie dans le processus de préparation à l’intubation. En raison de leur petite taille, l’intubation sous anesthésie à l’isoflurane délivrée par un cône nasal standard n’est pas réalisable. Nous avons déjà utilisé un régime anesthésique kétamine/xylazine/atropine de 100/13/0,5 mg/kg, respectivement, pour la chirurgie cardiothoracique chez les ...

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Discussion

Actuellement, il n’existe pas de méthodes bien documentées pour l’anesthésie et l’intubation de souris âgées de 10 jours pour la chirurgie cardiothoracique. À cette fin, nous avons ajusté les schémas posologiques de kétamine/xylazine/atropine en fonction du poids corporel, où des doses de 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg et 50/6/0,18 mg/kg ont facilité l’intubation des petits ayant un poids corporel faible (3,15-4,49 g), moyen (4,50-5,49 g) et élevé (5,50-8,10 g), respectivement. La survie après l’intubation était corrél...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention du programme NHMRC [ID 1074386], une subvention du réseau transatlantique d’excellence en recherche cardiovasculaire [RMG] de Leducq et une subvention du RT Hall Trust [RMG & SEI].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Atipamezole (Antisedan)Provet (NSW) Pty LtdATIP I
Atropine 600 mcg/mLClifford Hallam Healthcare Pty Ptd1957699 PFIZER-0143386
BetadineLivingstone InternationalBU0520
Buprénorphine (Temgesic)Provet (NSW) Pty LtdTEMG I
Lumière à fibre optiqueLeica  ;3011350CLS 150X
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 9.1.2
Plate-forme d’intubation  ;--Toute boîte solide (par exemple, boîte d’embouts en plastique) de dimensions approximatives 12 (L) x 8,5 x (L) x 7,5 cm (H)
IsofluraneProvet (NSW) Pty LtdISOF 07
Kétamine 100 mg/mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1
Canule intraveineuse en plastique de calibre 24 Polywin Safety  ;BD Insyte  ;CE0086Longueur de 19 mm de tube en plastique (diamètre extérieur de 0,7 mm) fixé à un adaptateur Luer Lock femelle en plastique de 21 mm ; volume total de l’anneau 130 &mu ; L
Tube en polyéthylène à lumière uniqueCritchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSWDiamètre extérieur 0,61 mm, diamètre intérieur 0,28 mm
Petite pinceF.S.T.NO 11051-10
Microscope chirurgical (caméra en option)Leica  ;M651 (Caméra Leica IC80 HD)Objectif 10x et 16x
Suture 7-0 proleneEthicon8708H
Suture 9-0 monofilament de polypropylèneEthicon2813
V-1 Plateau avec système d’anesthésie isoflurane à balayage actifVetEquip901820
Chambre à induction ventilée en plexiglas de 2 litresVetQuip Pty Ltd94210225 cm (L) x 13 cm (L) x 11 cm (H)
Lampe chauffanteBrilant Lighting99223
XylazineProvet (NSW) Pty LtdXYLA Z 2

Références

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Réimpressions et autorisations

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