Modifications précises de CRISPR-Cas9 dans les cœurs de poisson zèbre

Résumé

Ce protocole décrit une approche visant à faciliter des modifications précises dans les embryons de poisson-zèbre à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un pipeline de phénotypage est présenté pour démontrer l’applicabilité de ces techniques à modéliser une variante génétique associée au syndrome du QT long.

Résumé

Les courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées (CRISPR) dans des modèles animaux permettent une manipulation génétique précise pour l’étude des phénomènes physiologiques. Le poisson zèbre a été utilisé comme modèle génétique efficace pour étudier de nombreuses questions liées aux maladies héréditaires, au développement et à la toxicologie au niveau de l’organe entier et de l’organisme. En raison du génome du poisson zèbre bien annoté et cartographié, de nombreux outils d’édition de gènes ont été développés. Cependant, l’efficacité de la génération et la facilité de détection des modifications précises à l’aide de CRISPR sont un facteur limitant. Décrit ici est une approche knock-in basée sur CRISPR-Cas9 avec la détection simple de modifications précises dans un gène responsable de la repolarisation cardiaque et associé au trouble électrique, le syndrome du QT long (LQTS). Cette approche à deux ARN à guide unique (ARNg) excise et remplace la séquence cible et relie un gène rapporteur génétiquement codé. L’utilité de cette approche est démontrée en décrivant des mesures phénotypiques non invasives de la fonction électrique cardiaque chez des larves de poisson-zèbre de type sauvage et génétiquement modifiées. Cette approche permet l’étude efficace des variantes associées à la maladie dans un organisme entier. De plus, cette stratégie offre des possibilités d’insertion de séquences exogènes de choix, telles que des gènes rapporteurs, des orthologues ou des éditeurs de gènes.

Introduction

Les stratégies d’édition de gènes basées sur CRISPR dans des modèles animaux permettent l’étude des maladies génétiquement héréditaires, du développement et de la toxicologie au niveau de l’organisme entier ^1,2,3. Le poisson zèbre fournit un modèle puissant qui est plus proche de l’homme dans de nombreux aspects physiologiques que les modèles cellulaires murins ou dérivés de l’homme⁴. Un large éventail d’outils et de stratégies génétiques ont été utilisés chez le poisson zèbre pour le dépistage génétique avant⁵

Protocole

Les études utilisant le poisson zèbre ont été menées en accord avec les politiques et procédures du Comité de protection des animaux de l’Université Simon Fraser et du Conseil canadien de protection des animaux et ont été réalisées conformément au protocole # 1264K-18.

1. Conception de composants CRISPR pour des montages précis

1. Pour concevoir les guides à deux ARNg qui seront utilisés pour exciser la séquence contenant le site cible du KI, identifiez d’abord l’orthologue du poisson zèbre pour le gène d’intérêt.
   REMARQUE : La figure 2 fournit un aperçu sommaire des étapes permettant....

Résultats

L’utilisation réussie de cette approche CRISPR de remplacement d’exon à deux ARNG est mise en évidence par l’introduction et la détection simple d’une modification précise pour concevoir la variante associée au LQTS, R56Q, dans le gène zkcnh6a chez le poisson zèbre. La figure 6 montre 3 larves dpf représentatives injectées au stade embryon unicellulaire avec des composants CRISPR comme décrit ci-dessus. La figure 6A montre la présence de l’expression du.......

Discussion

L’ingénierie de modifications génétiques précises à l’aide de CRISPR-Cas9 est remise en question par la faible efficacité des mécanismes HDR et leur détection efficace. Ici, une approche de remplacement d’exons à deux ARNg basée sur CRISPR-Cas9 est décrite qui produit des modifications précises chez le poisson zèbre avec une détection visuelle directe des modifications positives. L’efficacité de cette approche est démontrée en générant des modifications précises dans le gène zkcnh6a . Cet article montre comment .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Program
CRISPOR	TEFOR Infrastructure
ENSEMBL	Institut
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)
Micro-Manager	Open Source (Github)
NEBiocalculator	New England Biolabs (NEB)
EQUIPMENT
24-well Plaque	VWR
25 mm Boîte de Petri VWR
Blackfly USB3 Caméra	Teledyne FLIR
C1000 Thermocycleur	Bio-Rad
Centrifuge 5415C	Eppendorf
Kit d’extraction de gel EZNA Kit de	Omega Biotek
MAXIscript T7	Incubateur Invitrogen
MaxQ 5000	Barnstead Lab Line
Miniprep Kit	Qiagen
mMessage mMachine T7 Ultra Kit de transcription	Invitrogen
ND1000 Spectrophotomètre	Nanodrop
PCR Kit de purification	Qiagen
PLI 100A Picoinjecteur	Harvard Appareil
PowerPac Alimentation de base	Bio-Rad
Stemi 305 Stéroscope	Zeiss
	Bio-Rad
ZebTec Zebrafish Boîtier Système	Tecniplast
SERVICES
Synthèse de gènes	Genewiz
Sanger Séquençage	Genewiz
REAGENTS
10&beta ; Cellules compétentes	NEB
10X PCR Tampon	Qiagen
100 mM Mélange de nucléotides	ABM
Ampicilline	Sigma
BamHI Endonuclease avec tampon	NEB
BsaI Endonuclease avec tampon	NEB
DR274 Plasmide (XL1 Bleu gélose bactérienne stab)	Addgene
EcoRI Endonuclease avec tampon	NEB
Glycérol
HEPES	Sigma
HindIII Endonuclease avec tampon	NEB
Kanamycin	Sigma
Methylene Blue	Sigma
MLM3613 Plasmide (XL1 Bleu Gélose bactérienne stab)	Addgene
MS-222 (Tricaïne)	Sigma
pKHR5 Plasmide (DH5&alpha ; poignardage de gélose bactérienne)	Addgene
PmeI Endonuclease w/ buffer	NEB
SalI Endonuclease w/ buffer	NEB
Sodium Hydroxide	Sigma
T4 Ligase avec tampon	Sigma
Taq Polymerase	Qiagen
TE Tampon	Sigma
XhoI Endonuclease avec tampon	NEB
RECIPES
Solution	Fournisseur	composants
Tampon de recuit (pH 7,5-8,0)	10 mM Tris	Sigma
	50 mM NaCl	Sigma
	1 mM EDTA	Sigma
E3 Média (pH 7,2)	5 mM NaCl	Sigma
	0,17 mM KCl	Sigma
	0,33 mM CaCl2	Sigma
	0,33 mM Tampon d’injection MgSO4	Sigma
(pH 7,5)	20 mM HEPES	Sigma
	150 mM KCl	Sigma

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