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Les larves de poisson-zèbre comme modèle pour évaluer les radiosensibilisants ou les protecteurs potentiels

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DOI :

10.3791/64233

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25 août 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Tumor microenvironment and animal models lab, Institute of Life Sciences, 2Vascular Biology lab, Institute of Life Sciences, 3Regional Centre for Biotechnology, 4School of Biotechnology, KIIT University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le poisson-zèbre a récemment été exploité comme modèle pour valider les modificateurs potentiels de rayonnement. Le présent protocole décrit les étapes détaillées de l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour des expériences de dépistage basées sur les rayonnements et certaines approches observationnelles pour évaluer l’effet de différents traitements et rayonnements.

Résumé

Le poisson-zèbre est largement utilisé dans plusieurs types de recherche car il est l’un des modèles de vertébrés faciles à entretenir et présente plusieurs caractéristiques d’un système de modèle unique et pratique. Comme les cellules hautement prolifératives sont plus sensibles aux dommages à l’ADN induits par les radiations, les embryons de poisson-zèbre sont un modèle in vivo de première ligne dans la recherche sur les rayonnements. De plus, ce modèle projette l’effet des rayonnements et de différents médicaments dans un court laps de temps, ainsi que les événements biologiques majeurs et les réponses associées. Plusieurs études sur le cancer ont utilisé le poisson-zèbre, et ce protocole est basé sur l’utilisation de modificateurs de rayonnement dans le contexte de la radiothérapie et du cancer. Cette méthode peut être facilement utilisée pour valider les effets de différents médicaments sur les embryons irradiés et témoins (non irradiés), identifiant ainsi les médicaments comme des médicaments radiosensibilisants ou protecteurs. Bien que cette méthodologie soit utilisée dans la plupart des expériences de dépistage de drogues, les détails de l’expérience et l’évaluation de la toxicité avec le contexte de l’exposition aux rayons X sont limités ou seulement brièvement abordés, ce qui la rend difficile à réaliser. Ce protocole aborde cette question et traite de la procédure et de l’évaluation de la toxicité avec une illustration détaillée. La procédure décrit une approche simple pour l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour les études de radiation et le dépistage de médicaments à base de rayonnement avec beaucoup de fiabilité et de reproductibilité.

Introduction

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle animal bien connu qui a été largement utilisé dans la recherche au cours des 3 dernières décennies. C’est un petit poisson d’eau douce facile à élever et à élever dans des conditions de laboratoire. Le poisson-zèbre a été largement utilisé pour diverses études développementales et toxicologiques 1,2,3,4,5,6,7,8. Le poisson-zèbre a une fécondité élevée et une génération embryonnaire courte ; Les embryons sont adaptés au suivi de différents stades de développement, sont visuellement transparents et se prêtent à diverses manipulations génétiques et à des plates-formes de criblage à haut débit 9,10,11,12,13,14. En outre, le poisson-zèbre fournit une imagerie in toto et en direct pour laquelle son processus de développement et les différentes déformations en présence de diverses substances ou facteurs toxiques peuvent être facilement étudiés à l’aide de la microscopie stéréoscopique ou fluorescente 7,15,16.

La radiothérapie est l’un des principaux modes thérapeutiques utilisés dans le traitement du cancer 17,18,19,20,21,22,23,24. Cependant, la radiothérapie du cancer nécessite des radioprotecteurs potentiels pour empêcher les cellules saines normales de mourir tout en tuant les cellules malignes ou pour protéger la santé humaine pendant le traitement impliquant des radiations à haute énergie 25,26,27,28,29. À l’inverse, de puissants radiosensibilisants sont également à l’étude pour augmenter l’efficacité des radiations à tuer les cellules malignes, en particulier dans les thérapies ciblées et de précision30,31,32,33. Par conséquent, pour valider des radioprotecteurs et des sensibilisateurs puissants, un modèle adapté au criblage de médicaments à semi-haut débit et présentant des effets mesurables des rayonnements est fortement sollicité. Plusieurs modèles disponibles sont utilisés dans les études sur les rayonnements et impliqués dans les expériences de dépistage de drogues. Cependant, les vertébrés supérieurs et même le modèle in vivo le plus couramment utilisé, les souris, ne conviennent pas au criblage de médicaments à grande échelle, car il est long, coûteux et difficile de concevoir de telles expériences de dépistage avec ces modèles. De même, les modèles de culture cellulaire sont idéaux pour les variétés d’expériences de criblage de médicaments à haut débit34,35. Cependant, les expériences impliquant la culture cellulaire ne sont pas toujours pragmatiques, hautement reproductibles ou fiables, car les cellules en culture peuvent modifier considérablement leur comportement en fonction des conditions de croissance et de la cinétique. De plus, les variétés de types de cellules présentent une sensibilisation différentielle aux rayonnements. Notamment, les systèmes de culture cellulaire 2D et 3D ne représentent pas le scénario de l’organisme entier et, par conséquent, les résultats obtenus peuvent ne pas récapituler le niveau réel de radiotoxicité36,37. À cet égard, le poisson-zèbre offre plusieurs avantages dans le dépistage de nouveaux radiosensibilisateurs et radioprotecteurs. La facilité de manipulation, la grande taille de la couvée, la courte durée de vie, le développement embryonnaire rapide, la transparence de l’embryon et la petite taille du corps font du poisson-zèbre un modèle approprié pour le dépistage de drogues à grande échelle. En raison des avantages ci-dessus, les expériences peuvent être facilement répétées en peu de temps et l’effet peut être facilement observé sous un microscope à dissection dans des plaques multi-puits. Par conséquent, le poisson-zèbre gagne en popularité dans la recherche sur le dépistage des drogues impliquant des études sur les radiations38,39.

Le potentiel du poisson-zèbre en tant que modèle authentique pour le criblage des modificateurs de rayonnement a été démontré dans diverses études 40,41,42,43,44,45. L’effet radioprotecteur des modificateurs radio potentiels, tels que la nanoparticule DF1, l’amifostine (WR-2721), les protéines de réparation de l’ADN KU80 et ATM, et les cellules souches hématopoïétiques transplantées, ainsi que les effets des radiosensibilisateurs, tels que le flavopiridol et l’AG1478, dans le modèle du poisson-zèbre ont été rapportés 19,41,42,43,44,45,46 . En utilisant le même système, l’effet radioprotecteur de DF-1 (nanoparticule de fullerène) a été évalué à la fois au niveau systémique et au niveau d’un organe spécifique, et l’utilisation d’embryons de poisson-zèbre pour le criblage de radioprotecteurs a également été explorée plus en détail47. Récemment, le miel de Kelulut a été signalé comme radioprotecteur dans les embryons de poisson-zèbre et s’est avéré augmenter la survie des embryons et prévenir les dommages spécifiques aux organes, les dommages à l’ADN cellulaire et l’apoptose48.

De même, les effets radioprotecteurs des polymères générés par la réaction de Hantzsch ont été vérifiés sur des embryons de poisson-zèbre dans le cadre d’un criblage à haut débit, et la protection a été principalement conférée par la protection des cellules contre les dommages à l’ADN49. Dans l’une des études précédentes, la statine lipophile fluvastatine a été trouvée comme radiosensibilisant potentiel en utilisant le modèle du poisson-zèbre avec cette approche50. De même, les nanoparticules d’or sont considérées comme un radiosensibilisateur idéal et ont été utilisées dans de nombreuses études51,52.

Le développement embryonnaire chez le poisson-zèbre implique un clivage dans les 3 premières heures au cours desquelles un zygote unicellulaire se divise pour former 2 cellules, 4 cellules, 8 cellules, 16 cellules, 32 cellules et 64 cellules qui sont facilement identifiées avec un stéréomicroscope. Ensuite, il atteint le stade blastula avec 128 cellules (2,25 h après la fécondation, hpf), où les cellules doublent toutes les 15 minutes et passent par les étapes suivantes : 256 cellules (2,5 hpf), 512 cellules (2,75 hpf) et atteignent 1 000+ cellules en seulement 3 h (Figure 1). À 4 h, l’œuf atteint le stade sphérique, suivi de la formation d’un dôme dans la masse embryonnaire 7,53,54. La gastrulation chez le poisson-zèbre commence à partir de 5,25 hpf54, où elle atteint le stade de bouclier. Le bouclier indique clairement le mouvement de convergence rapide des cellules d’un côté de l’anneau germinatif (Figure 1) et constitue une phase proéminente et distincte de la gastrulation des embryons qui peut être facilement identifiée53,54. Bien que l’exposition aux rayonnements des embryons puisse se faire à n’importe quel stade de leur développement, l’exposition aux rayonnements pendant la gastrulation pourrait avoir des changements morphologiques plus distincts, ce qui faciliterait une meilleure lecture des toxicités induites par les rayonnements55 ; De même, l’administration de médicaments aux embryons peut être commencée dès 2 HPF54.

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Protocole

La présente étude a été menée avec l’approbation préalable et en suivant les directives du Comité institutionnel d’éthique animale de l’Institut des sciences de la vie de Bhubaneswar. Tous les travaux d’entretien et d’élevage des poissons-zèbres ont été effectués dans une installation piscicole ambiante à 28,5 °C, et les embryons ont été maintenus dans un incubateur à demande biologique en oxygène (DBO) à une température de 28,5 °C. Ici, la souche AB du poisson-zèbre a été utilisée, et la mise en scène a été effectuée selon Kimmel et al.54. Le rayonnement X a été administré à 6 hpf (stade bouclier), et différents phénotypes ont été observés jusqu’à 120 hpf.

1. Mise en place de l’élevage et collecte d’embryons

  1. Réglez les bacs d’élevage (en polycarbonate, capacité 1 L, voir Tableau des matériaux). Verser l’eau du système (pH, 6,8-7,5 ; conductivité, 500 μS ; et température, 28,5 °C) dans les bassins d’élevage couvrant près de 40 % de son volume. Placez le séparateur dans le réservoir pour créer deux chambres, l’une pour les femelles et l’autre pour les mâles.
  2. À l’aide d’un filet, prélevez soigneusement deux femelles et un mâle en bonne santé dans les bassins parents, placez-les dans leurs moitiés respectives et gardez-les dans l’obscurité pendant la nuit (minimum 10 h) à 28,5 °C.
  3. Le lendemain matin, retirez le séparateur et laissez les poissons s’accoupler sans déranger les bassins d’élevage.
    REMARQUE : Les femelles commenceront à frayer et les œufs seront vus couchés au fond de l’aquarium dans les 10 à 15 minutes après que les poissons soient autorisés à s’accoupler56,57,58.
  4. remettre les poissons dans leurs aquariums après le frai, recueillir les embryons dans le bac d’élevage à l’aide d’une passoire, les laver correctement avec l’eau du système et conserver les œufs collectés dans une boîte de Pétri avec un milieu E-3 (4,94 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,43 mM de CaCl 2, 0,85 mM de sels de MgCl2, 1 % p/v de bleu de méthylène, voir Tableau des matériaux).
  5. Observez les oeufs au microscope à dissection, retirez les embryons non fécondés ou morts à l’aide d’une pipette Pasteur et conservez les boîtes de Petri contenant les ovules fécondés dans le milieu E-3 à 28,5 °C dans un incubateur pour leur bonne croissance et leur entretien.
    REMARQUE : Les ovules non fécondés peuvent être identifiés avec un aspect blanc laiteux avec un chorion coagulé ou avec des cellules rompues à l’intérieur du chorion. En plus des ovules non fécondés, les ovules qui ne subissent pas de clivage et les ovules présentant des déformations telles que des irrégularités pendant le clivage, par exemple une asymétrie, la formation de vésicules ou des lésions du chorion, ou qui ne se développent pas activement, doivent être jetés pour garder les embryons collectés en bonne santé et pour garder le milieu propre 7,56.

2. Surveillance des embryons et sélection pour les expériences de rayonnement

  1. Surveillez les embryons en croissance au microscope à dissection, identifiez le stade approprié 7,54 et retirez tous les embryons morts ou en mauvaise santé. S’assurer que la stadification embryonnaire est adéquate, car les doses de radiation et de médicament seront administrées à un stade particulier de la gastrulation.
    REMARQUE : Chaque jour, vérifiez le niveau et la qualité des milieux dans les plats de culture. Changez le milieu toutes les 24 heures, ainsi que le retrait des embryons morts. Il est préférable d’utiliser des pipettes Pasteur pour le prélèvement d’embryons ou le changement de milieu.
  2. Avant de commencer l’expérience, répartissez soigneusement les embryons sains dans les plaques expérimentales à l’aide d’une pipette Pasteur. Pour chaque groupe expérimental, prélever 15 à 20 embryons.
    REMARQUE : Ne placer que des embryons sains des stades de développement souhaités dans la plaque expérimentale. Supposons que le traitement médicamenteux doive être effectué avec des embryons à 6 hpf, puis commencez à les ensemencer dans des plaques expérimentales au moins 30 à 60 minutes plus tôt.

3. Traitement de la toxicomanie

  1. Ajouter les médicaments de la concentration désirée aux embryons de poisson-zèbre. Préparez le milieu E-3 contenant le médicament bien à l’avance. Assurez-vous que la solution mère du médicament ne contient pas de médicament non dissous avant de préparer le milieu de travail pour le traitement des embryons de poisson-zèbre.
  2. Avant d’ajouter un médicament à un milieu pour le dépistage par rayonnement, vérifiez l’effet cytotoxique du médicament avec les degrés de concentration du médicament. Suivre les lignes directrices de l’OCDE pour évaluer la CL 50 des médicaments évalués 59,60,61.
    REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous déplacez les assiettes et les plats pendant le temps d’irradiation ou d’observation. Il y a de nombreuses chances que les plaques soient perturbées lors de cette manipulation, ce qui entraînerait une fuite du milieu hors des puits ou le débordement des embryons hors de leurs puits respectifs, contaminant potentiellement les puits voisins et ruinant l’expérience.

4. Irradiation aux rayons X

  1. Lors de la mise en place d’une expérience sur les rayonnements, inclure un groupe témoin/non irradié et un groupe de rayonnements uniquement. De même, lors d’un dépistage de drogues, inclure un autre groupe où les médicaments seront administrés avec la même concentration que ceux administrés dans l’expérience de dépistage avec la radiothérapie.
    REMARQUE : Étiquetez à la fois le couvercle et la base des plaques de puits ou des boîtes de culture afin que les couvercles ne soient pas égarés.
  2. Distribuer les embryons dans une plaque de puits si les écrans anti-rayonnement peuvent couvrir et protéger les puits supplémentaires contre les rayonnements pendant que les autres puits sont exposés à une dose de rayonnement particulière ; sinon, utilisez des plaques ou des disques individuels pour ensemencer les embryons en fonction de la dose de rayonnement.
  3. Mettez en marche l’appareil d’irradiateur à rayons X (voir le tableau des matériaux) et lancez l’initialisation et le préchauffage de la machine.
    REMARQUE : La valeur de la distance entre la source et le sujet (SSD) doit être de 50 cm ; on peut à nouveau utiliser différents SSD, ce qui nécessite une standardisation.
  4. Placez la plaque expérimentale sous l’irradiateur à l’intérieur de la machine au centre, en veillant à ce que la plaque se trouve directement sous la source de rayons X, puis réglez la dose (par exemple, 5 GY) et démarrez la radiographie.
    REMARQUE : Scellez les plaques avec un film de paraffine pour éviter tout déversement ou contamination indésirable pendant le transport des plaques de l’incubateur à l’irradiateur et vice-versa.
  5. Une fois l’irradiation terminée, retirez les plaques, arrêtez le programme de la machine, éteignez la machine et vérifiez les plaques au microscope immédiatement après la radiothérapie. Retirez les embryons morts et remettez les plaques dans l’incubateur à 28,5 °C. Enregistrez le nombre d’embryons morts après les avoir évalués au microscope à dissection.
    NOTA : Irradier les différents groupes d’embryons avec des doses de rayonnement désignées sans trop de retard entre les groupes individuels, car l’effet du rayonnement peut être considérablement affecté par la différence de stade de développement.
    ATTENTION : Lors de l’utilisation de l’appareil à rayons X, prenez les mesures de protection appropriées.

5. Collecte, imagerie et analyse des données

  1. Recueillez des données à des intervalles de temps prédéterminés, par exemple toutes les 24 heures après l’administration du rayonnement. Noter toutes les observations possibles telles que la survie, l’efficacité de l’éclosion, le stade de développement, le nombre de battements cardiaques, la courbure du corps et de la queue, l’œdème péricardique, l’extension du sac vitellin, la microcéphalie, le développement de la vessie natatoire, la motilité ou l’activité générale, etc.62,63,64.
  2. Pour capturer des images, choisissez des embryons représentatifs sur une lame propre, vérifiez les embryons au microscope, orientez-les dans une direction particulière et cliquez sur les images. Renommez les fichiers image en fonction du groupe et de l’heure.
    REMARQUE : Le même grossissement et le même éclairage doivent être utilisés lors de la capture d’images à des intervalles de temps différents.

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Résultats

La présentation générale du protocole est illustrée à la figure 2. L’effet du rayonnement et la caractérisation en fonction de la dose ont été évalués à l’aide des analyses suivantes.

Évaluation des toxicités induites par les rayons X
À l’aide d’un stéréomicroscope, les anomalies suivantes ont été évaluées et caractérisées après le traitement médicamenteux et/ou la radiothérapie. Conformément aux lignes directrices de l’OCDE 6...

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Discussion

Les poissons-zèbres sont utilisés comme modèles précieux dans de nombreuses études, y compris plusieurs types de recherche sur le cancer. Ce modèle fournit une plate-forme utile pour le dépistage de drogues à grande échelle67,68. Comme toute autre méthode d’évaluation de la toxicité, l’évaluation quantitative des changements biologiques majeurs lors d’une radiothérapie et/ou d’un traitement médicamenteux est la partie la plus cruciale de ce protocole. Dans ce typ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas déclaré d’intérêts concurrents.

Remerciements

Le laboratoire de SS et le laboratoire de RKS sont financés par des subventions de DBT et de SERB, en Inde. APM est récipiendaire de la bourse de l’ICMR du gouvernement de l’Inde. Le Programme du diplôme est récipiendaire d’une bourse du CSIR du gouvernement de l’Inde. L’ONU est récipiendaire de la bourse DST-Inspire du gouvernement de l’Inde. La figure 2 a été générée à l’aide de Biorender (https://biorender.com).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
6 plaques de puitsCorningCLS3335Polystyrène
Incubateur B.O.DOswaldJRIC-10
Chlorure de calciumFisher Scientific10101-41-4
Microscope de dissectionZeissStemi 2000
Réservoir externe pour le réservoir d’élevage de 1,0 LTecniplastZB10BTEpolycarbonate
Pétriplaques en verreBorosil3165A75
Verre GraphpadPrismGraphPad Software, Inc.Version 5.01
Lames de concavité KlineHimediaGW092-1PK
Verre Chlorure de MagnésiumSigma-AldrichM8266
Bleu de méthylène hydratéSigma-Aldrich66720-100G
ParafilmTarsons380020Film de paraffine
PipettesPasteur HimediaPW1212-1X500NOPolyéthylène
Réservoir intérieur perforé en plastique pour le réservoir d’élevage de 1,0 LTecniplastZB10BTI
Séparateur en polycarbonate polycarbonate pour le réservoir d’élevage de 1,0 LTecniplastZB10BTD
couvercle en polycarbonate pour le réservoir d’élevage de 1,0 LTecniplastZB10BTLPolycarbonate
chlorurede potassium Sigma-AldrichP5655
Chlorurede sodium Sigma-AldrichS7653-5KG
Pastille d’hydroxyde de sodiumSRL1949181
Stéréomicroscope Leica M205FALeicaModèle/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Rayons Xprécision Rayons X de précision X-RAD225XL
de

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