Forberedelse, egenskaper, toksisitet og effekt Evaluering av nasal selvmontert nanoemulsjonstumorvaksine in vitro og in vivo

Summary

Her presenterer vi detaljerte metoder for fremstilling og evaluering av nasal selvmontert nanoemulsjonstumorvaksine in vitro og in vivo .

Abstract

Epitoppeptider har tiltrukket seg stor oppmerksomhet innen tumorvaksiner på grunn av deres sikkerhet, høye spesifisitet og praktiske produksjon; Spesielt kan noen MHC I-begrensede epitoper indusere effektiv cytotoksisk T-lymfocyttaktivitet for å fjerne tumorceller. I tillegg er nasal administrasjon en effektiv og sikker leveringsteknikk for tumorvaksiner på grunn av dens bekvemmelighet og forbedret pasientoverensstemmelse. Imidlertid er epitoppeptider uegnet for nasal levering på grunn av deres dårlige immunogenisitet og mangel på leveringseffektivitet. Nanoemulsjoner (NE) er termodynamisk stabile systemer som kan lastes med antigener og leveres direkte til neseslimhinnens overflate. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) er kjernen pentapeptid av laminin, et integrinbindende peptid uttrykt av humane respiratoriske epitelceller. I denne studien ble en intranasal selvmontert epitoppeptid NE-tumorvaksine inneholdende det syntetiske peptidet IKVAV-OVA_{257-264 (I-OVA} ) fremstilt ved en lavenergiemulgeringsmetode. Kombinasjonen av IKVAV og OVA_257-264 kan øke antigenopptaket i neseslimhinneepitelceller. Her etablerer vi en protokoll for å studere de fysisk-kjemiske egenskapene ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM), atomkraftmikroskopi (AFM) og dynamisk lysspredning (DLS); stabilitet i nærvær av mucinprotein; toksisitet ved å undersøke cellelevedyktigheten til BEAS-2B-celler og nese- og lungevev hos C57BL/6-mus; cellulært opptak ved konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM); frigjøringsprofiler ved avbildning av små dyr in vivo; og den beskyttende og terapeutiske effekten av vaksinen ved bruk av en E.G7 tumorbærende modell. Vi forventer at protokollen vil gi tekniske og teoretiske ledetråder for fremtidig utvikling av nye T-celleepitop-peptidslimhinnevaksiner.

Introduction

Som en av de mest kritiske folkehelseinnovasjonene spiller vaksiner en nøkkelrolle i å bekjempe den globale byrden av menneskelig sykdom¹. For eksempel testes for tiden mer enn 120 kandidatvaksiner for COVID-19-sykdommer, hvorav noen er godkjent i mange land². Nylige rapporter sier at kreftvaksiner effektivt har forbedret fremdriften av kliniske kreftbehandlinger fordi de leder immunsystemet til kreftpasienter til å gjenkjenne antigener som fremmede for kroppen³. Videre kan flere T-celleepitoper lokalisert i eller utenfor tumorceller brukes til å designe peptidvaksiner, som har vist fordeler ved behandling av metastatisk kreft på grunn av mangel på signifikant toksisitet forbundet med strålebehandling og kjemoterapi ^4,5. Siden midten av 1990-tallet har prekliniske og kliniske studier for tumorbehandling hovedsakelig blitt utført ved bruk av antigenpeptidvaksiner, men få vaksiner har tilstrekkelig terapeutisk effekt på kreftpasienter⁶. Videre har kreftvaksiner med peptidepitoper dårlig immunogenitet og utilstrekkelig leveringseffektivitet, noe som kan skyldes rask nedbrytning av ekstracellulære peptider som diffunderer raskt fra administrasjonsstedet, noe som fører til utilstrekkelig antigenopptak av immunceller⁷. Derfor er det nødvendig å overvinne disse hindringene med vaksineleveringsteknologi.

OVA 257-264, MHC klasse I-bindende_257-264 epitop uttrykt som et fusjonsprotein, er en hyppig brukt modellepitop⁸. I tillegg er OVA_257-264 avgjørende for den adaptive immunresponsen mot svulster, som avhenger av cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) respons. Det medieres av antigenspesifikke CD8⁺ T-celler i svulsten, som induseres av OVA_{257-264-peptidet} . Det er preget av utilstrekkelig granzyme B, som frigjøres av cytotoksiske T-celler, noe som fører til apoptose av målceller⁸. Imidlertid kan fri OVA_257-264 peptidadministrasjon indusere liten CTL-aktivitet fordi opptaket av disse antigenene forekommer i uspesifikke celler i stedet for antigenpresenterende celler (APCer). Mangelen på passende immunstimulering resulterer i CTL-aktivitet⁵. Derfor krever induksjon av effektiv CTL-aktivitet betydelig fremgang.

På grunn av barrieren fra epitelceller og kontinuerlig sekresjon av slim, fjernes vaksineantigener raskt fra neseslimet ^9,10. Å utvikle en effektiv vaksinevektor som kan passere gjennom slimhinnevevet er avgjørende fordi de antigenpresenterende cellene ligger under slimhinneepitelet⁹. Intranasal injeksjon av vaksiner induserer teoretisk slimhinneimmunitet for å bekjempe slimhinneinfeksjon¹¹. I tillegg er nasal levering en effektiv og sikker administrasjonsmetode for vaksiner på grunn av dens bekvemmelighet, unngåelse av tarmadministrasjon og forbedret pasientoverensstemmelse⁷. Derfor er nasal levering et godt administrasjonsmiddel for den nye peptidepitopen nanovaccine.

Flere syntetiske biomaterialer har blitt utviklet for å kombinere epitoper av celle-vev og celle-celle-interaksjoner. Visse bioaktive proteiner, som Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), har blitt introdusert som en del av hydrogelens struktur for å gi bioaktivitet¹². Dette peptidet bidrar sannsynligvis til cellefeste, migrasjon og utvekst¹³ og binder integriner α 3β1 og_{α 6β1} for å interagere med forskjellige kreftcelletyper. IKVAV er et celleadhesjonspeptid avledet fra lamininkjellermembranproteinet α_1-kjeden som opprinnelig ble brukt til å modellere det nevrale mikromiljøet og forårsake nevrondifferensiering¹⁴. Derfor er det viktig å finne et effektivt leveringsmiddel for denne nye vaksinen for sykdomskontroll.

Nylig rapporterte emulsjonssystemer, som W805EC og MF59, har også blitt forsterket for nesehulelevering av inaktivert influensavaksine eller rekombinant hepatitt B overflateantigen og illustrert for å utløse både mukosal og systemisk immunitet¹⁵. Nanoemulsjoner (NE) har fordelene ved enkel administrasjon og praktisk samdannelse med effektive hjelpestoffer sammenlignet med partikkelformige slimhinneleveringssystemer¹⁶. Nanoemulsjonsvaksiner har blitt rapportert å endre den allergiske fenotypen på en vedvarende måte forskjellig fra tradisjonell desensibilisering, noe som resulterer i langsiktige undertrykkende effekter¹⁷. Andre rapporterte at nanoemulsjoner kombinert med Mtb-spesifikke immunodominante antigener kunne indusere potente slimhinnecelleresponser og gi betydelig beskyttelse¹⁸. Derfor ble en ny intranasal selvmontert nanovaksine med det syntetiske peptidet IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, peptidet bestående av IKVAV bundet til OVA_257-264) designet. Det er viktig å vurdere denne nye nanovaksinen systematisk.

Formålet med denne protokollen er å systematisk evaluere de fysisk-kjemiske egenskapene, toksisiteten og stabiliteten til nanovaccinen, oppdage om antigenopptak og beskyttende og terapeutiske effekter forbedres ved hjelp av tekniske midler, og utdype det viktigste eksperimentelle innholdet. I denne studien etablerte vi en rekke protokoller for å studere de fysisk-kjemiske egenskapene og stabiliteten, bestemme størrelsen på toksisiteten til I-OVA NE til BEAS-2B-celler ved CCK-8, og observere antigenpresenterende evne til BEAS-2B-celler til vaksinen ved hjelp av konfokalmikroskopi, evaluere frigjøringsprofilene til denne nye nanovaccinen in vivo og in vitro , og oppdage den beskyttende og terapeutiske effekten av denne vaksinen ved å bruke en E.G7-OVA tumorbærende musemodell.

Protocol

Dyreforsøkene ble utført i samsvar med Laboratory Animal-Guideline for ethical review of animal welfare (GB / T 35892-2018) og ble godkjent av Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee of the Third Military Medical University. Musene ble avlivet ved en intraperitoneal injeksjon på 100 mg/kg av 1% natriumpentobarbital. 1. Tilberedning av I-OVA NE Bland 1 mg monofosforyllipid A (MPLA) med 100 μL DMSO, virvel i 5 minutter, og la den stå i 4 timer ved romtempe…

Representative Results

I henhold til protokollen fullførte vi preparatet og in vitro og in vivo eksperimentell evaluering av nasal tumor nanovaccine levering. TEM, AFM og DLS er effektive midler for vurdering av de grunnleggende egenskapene til overflatezetapotensialet og partikkelstørrelsen til nanovaksinen (figur 1). BEAS-2B epitelceller er en nyttig screeningmodell for in vitro toksisitetstesting av nasale vaksiner (figur 2A). Mikrofotografiene farget m…

Discussion

Nanovacciner funksjonalisert med immunocytmembraner har store fordeler i sykdomsmålrettet terapi, og bivirkningene minimeres av egenskaper som unik tumortropisme, identifisering av spesifikke mål, langvarig sirkulasjon, forbedrede intercellulære interaksjoner og lav systemisk toksisitet. De kan også enkelt integreres med andre behandlingsmoduler for å behandle kreft i fellesskap^16,20. Ønskelige egenskaper kan oppnås ved å kontrollerefysiske og kjemiske eg…

Materials

96-well plates	Corning Incorporated, USA	CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader	Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA	Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits	Dojindo, Japan	CK04
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, USA	D9542
fetal bovine serum (FBS)	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30088.03
FITC-labeled I-OVA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
HF 90/240 Incubator	Heal Force, Switzerland	NA
HPLC	Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.	E2695
Inverted Microscope	Nikon,Japan	DSZ5000X
IPC-208	Chong Qing University, China	NA
IVIS system	Caliper Life Science Limited Company	NA
JEM-1230 TEM	JEOL Limited Company of Japan	1230 TEM
Malvern NANO ZS	Malvern Instruments Ltd., UK	NA
MPLA	Invivogen Lit. Co.	tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment	Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd.	H31022262
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
RPMI 1640 medium	Hyclone (Life Technology, USA)	SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope	Zeiss, Germany	Zeiss LSM800