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Cellules humaines de type microglie : différenciation à partir de cellules souches pluripotentes induites et dosage in vitro de la phagocytose sur cellules vivantes à l’aide de synaptosomes humains

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DOI :

10.3791/64323

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18 août 2022

 , 
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Translation Science Program, Morningside Graduate School of Biomedical Sciences, University of Massachusetts Chan Medical School

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit le processus de différenciation des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) en cellules de type microglie pour l’expérimentation in vitro . Nous incluons également une procédure détaillée pour générer des synaptosomes humains à partir de motoneurones inférieurs dérivés de l’iPSC qui peuvent être utilisés comme substrat pour des tests de phagocytose in vitro utilisant des systèmes d’imagerie de cellules vivantes.

Résumé

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes d’origine myéloïde qui maintiennent l’homéostasie dans le microenvironnement cérébral et sont devenues un acteur clé dans de multiples maladies neurologiques. L’étude de la microglie humaine dans la santé et la maladie représente un défi en raison de l’approvisionnement extrêmement limité en cellules humaines. Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) dérivées d’individus humains peuvent être utilisées pour contourner cette barrière. Ici, il est démontré comment différencier les CSPi humaines en cellules de type microglie (iMG) pour l’expérimentation in vitro . Ces iMG présentent les propriétés attendues et physiologiques de la microglie, y compris la morphologie de type microglie, l’expression de marqueurs appropriés et la phagocytose active. De plus, une documentation pour isoler et étiqueter les substrats de synaptosomes dérivés de motoneurones inférieurs dérivés de l’iPSC humaine (i3LMN) est fournie. Un test d’imagerie longitudinale sur cellules vivantes est utilisé pour surveiller l’engloutissement des synaptosomes humains marqués avec un colorant sensible au pH, ce qui permet d’étudier la capacité phagocytaire de l’iMG. Les protocoles décrits ici sont largement applicables à différents domaines qui étudient la biologie de la microglie humaine et la contribution de la microglie à la maladie.

Introduction

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) et jouent un rôle crucial dans le développement du SNC. Les microglies sont également importantes dans le cerveau adulte pour maintenir l’homéostasie et répondre activement aux traumatismes et aux processus pathologiques. Les preuves cumulatives montrent que les microglies sont des contributeurs clés à la pathogenèse de multiples maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives 1,2. Bien que les connaissances actuelles sur la biologie microgliale proviennent principalement de modèles murins, des études récentes ont élucidé des différences importantes entre la microglie murine et la microglie humaine, soulignant la nécessité de développer des technologies pour étudier la génétique et les fonctions biologiques de la microglie humaine 3,4. L’isolement de la microglie à partir de tissu primaire disséqué peut modifier gravement les propriétés de la microglie5, ce qui peut confondre les résultats obtenus avec de telles cellules. L’objectif global de cette méthode est de différencier les CSPi humaines en MAGi, fournissant ainsi un système de culture cellulaire pour étudier la microglie humaine dans des conditions basales. De plus, un test de phagocytose utilisant un système modèle entièrement humain est inclus ici comme moyen d’étudier la fonctionnalité des MGi, à la fois comme mesure de contrôle de la qualité et pour évaluer le dysfonctionnement de l’iMG dans le contexte de la maladie.

De multiples protocoles de différenciation de la microglie par rapport aux CSPi ont récemment émergé dans la littérature 6,7,8,9,10. Les inconvénients potentiels de certains protocoles comprennent des périodes de différenciation prolongées ou longues, l’ajout de facteurs de croissance multiples et/ou des procédures expérimentales complexes 6,9,10. Ici, une méthode de différenciation « conviviale » est démontrée qui récapitule les aspects de l’ontogenèse de la microglie par la différenciation des CSPi en cellules précurseurs appelées précurseurs primitifs de macrophages (PMP)7,11. Les PMP sont générés comme décrit précédemment, avec quelques optimisations présentées ici12. Les PMP imitent les macrophages dérivés du sac vitellin indépendants du MYB, qui donnent lieu à une microglie au cours du développement embryonnaire en envahissant le cerveau avant la fermeture de la barrière hémato-encéphalique13. Pour différencier de manière terminale les PMP en iMG, nous avons utilisé une méthode de monoculture rapide et simplifiée basée sur les protocoles de Haenseler et al. et Brownjohn et al., avec quelques modifications pour générer une méthode efficace de différenciation de la microglie dans laquelle les iMG expriment de manière robuste les marqueurs enrichis en microglies 7,8. Cette méthode de différenciation peut être reproduite dans des laboratoires ayant une expertise dans la culture des CSPi et ayant des objectifs de recherche visant à étudier la biologie de la microglie à l’aide d’un système modèle humain.

Les microglies dérivées des CSPi représentent une source biologiquement pertinente de microglies humaines pour l’expérimentation in vitro et constituent un outil important pour étudier les fonctions canoniques microgliales, y compris la phagocytose. Les microglies sont les phagocytes professionnels du cerveau et du SNC, où ils éliminent les débris cellulaires, les protéines agrégées et la myéline dégradée14. La microglie fonctionne également dans le remodelage synaptique en engloutissant les synapses et dans la défense contre les infections externes par phagocytose des agents pathogènes15,16. Dans ce protocole, la phagocytose par les iMG est évaluée à l’aide de synaptosomes humains comme matériau pour l’engloutissement de l’iMG. À cette fin, une description de l’isolement des synaptosomes dérivés de LMN i3humains est décrite. Les synaptosomes humains dérivés du LMN3sont marqués avec un colorant sensible au pH qui permet de quantifier les synaptosomes localisés dans les compartiments acides pendant le traitement et la dégradation des phagosomes in vitro. Un test de phagocytose utilisant la microscopie sur cellules vivantes est montré pour surveiller le processus dynamique d’engloutissement de la microglie en temps réel. Ce test fonctionnel établit une base pour étudier les défauts possibles de la phagocytose microgliale dans la santé et la maladie en utilisant un système humain complet.

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Protocole

NOTE: Tous les réactifs utilisés dans ce protocole doivent être stériles, et toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité dans des conditions stériles. Toutes les lignes iPSC, ainsi que les supports de maintenance et de différenciation, sont décrits dans le tableau des matériaux. La méthode de différenciation de la microglie illustrée ci-dessous est basée sur les protocoles 7,8,12 précédemment publiés avec les nouvelles modifications décrites ici.

1. Différenciation des microglies

REMARQUE : Une vue d’ensemble du protocole est résumée à la figure 1.

  1. Culture de cellules souches pluripotentes induites (CSPi)
    NOTE: De plus amples détails décrivant les techniques de culture iPSC peuvent être trouvés ailleurs17.
    1. Décongélation et entretien
      1. Préparer le milieu iPSC, aliquote du milieu et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois. Décongeler les aliquotes pendant une nuit à 4 °C et les utiliser jusqu’à 1 semaine. Laisser le média à température ambiante pendant au moins 1 h avant utilisation.
      2. Enduire les puits d’une plaque à 6 puits en ajoutant 1 mL de 10 μg/mL de laminine 521 diluée dans du DPBS contenant du calcium et du magnésium18. Conserver les plaques dans un incubateur à 37 °C et 5% deCO2 pendant au moins 2 h ou de préférence toute la nuit. Une fois diluée, conservez la laminine à 4 °C pendant 3 mois.
      3. Préparer la solution mère d’inhibiteur de Rhokinase Y27632 (inhibiteur de ROCK) à 10 mM en diluant dans de l’eau stérile. Fabriquer des aliquotes à usage unique de la solution inhibitrice de ROCK et les conserver à -20 °C jusqu’à 1 an.
      4. Préparer 0,5 mM d’EDTA en diluant la solution mère de 0,5 M d’EDTA dans du DPBS.
      5. Pour décongeler un flacon de CSPi congelées, placer le flacon au bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il soit presque décongelé. Transférer immédiatement le contenu du flacon dans un tube conique de 15 mL contenant 4 mL de milieu iPSC. Centrifuger à 500 × g pendant 1 min.
      6. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension en ajoutant 1 mL de milieu iPSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK lentement contre la paroi du tube pour éviter de perturber les colonies.
      7. Ajouter 1,5 mL de milieu CSPi contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK à chacun des puits revêtus et transférer goutte à goutte les colonies en suspension goutte à goutte dans les puits contenant le milieu.
        REMARQUE : Utilisez 5 à 7 gouttes de l’étape 1.1.1.6 pour le maintien de la culture, mais ajustez la densité de semis optimale pour chaque ligne iPSC.
      8. Répartir uniformément les cellules dans les puits en mélangeant manuellement la plaque d’un côté à l’autre et de l’arrière vers l’avant. Placer les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2. Le lendemain, remplacez complètement le milieu en ajoutant un milieu iPSC frais sans inhibiteur de ROCK.
      9. Pour l’entretien, changez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
        REMARQUE: Les cellules peuvent être maintenues sans changer le milieu pendant 2 jours si le milieu iPSC utilisé permet un programme d’alimentation flexible. Il est conseillé de limiter cela à une fois par passage et seulement si les cellules sont confluentes à moins de 50%.
    2. Fractionnement
      1. Aspirer le milieu et laver les cellules avec 1 mL de DPBS (sans calcium ni magnésium).
      2. Pour déloger les cellules, ajouter 1 mL d’EDTA 0,5 mM et incuber pendant 2-3 minutes à température ambiante jusqu’à ce que les bords des colonies cellulaires se soulèvent de la surface du puits. Lavez à nouveau les cellules avec DPBS et ajoutez 1 mL de milieu iPSC.
      3. Dissociez les colonies cellulaires en les grattant doucement à l’aide d’un élévateur cellulaire. Grattez chaque zone du puits une seule fois pour éviter de déranger les colonies.
        NOTE: D’autres méthodes pour déloger les colonies du puits peuvent être trouvées ailleurs17.
      4. À l’aide d’un embout de pipette de 1 mL, recueillir les cellules et les transférer goutte à goutte dans un rapport de 1:6 (cellules à moyen) dans des puits prérevêtus (tel que mentionné à l’étape 1.1.1.2) contenant 1,5 mL de milieu iPSC.
  2. Différenciation des CSPi en cellules de type microglie (iMG)
    NOTE: Les petites molécules et les facteurs de croissance sont dissous dans de l’albumine sérique bovine filtrée à 0,1% dans du DPBS à une concentration de stock 1 000 fois supérieure à la concentration finale. Il est recommandé de différencier les CSPi en iMG lors des premiers passages. Le caryotypage de routine des lignes iPSC est conseillé.
    1. Préparer la solution de revêtement standard
      1. Décongeler la solution mère d’un réactif de revêtement à matrice extracellulaire sur de la glace à 4 °C pendant une nuit.
      2. Prérefroidir les tubes de microcentrifugation et les embouts des pipettes filtrantes à 4 °C.
      3. Aliquote 250 μL du réactif concentré de revêtement de la matrice extracellulaire dans chaque tube et placer immédiatement sur la glace. Conserver les aliquotes à -20 °C.
      4. Pour préparer la solution de revêtement, décongeler l’une des aliquotes du réactif de revêtement de la matrice extracellulaire sur de la glace à 4 °C pendant une nuit.
      5. Ajouter 50 mL de DMEM-F12 glacé optimisé pour la croissance de cellules souches embryonnaires humaines et pluripotentes induites (appelé DMEM-F12) dans un tube conique prérefroidi et le conserver sur la glace.
      6. Refroidir un embout de pipette de 1 mL en pipetant du DMEM-F12 glacé de haut en bas plusieurs fois, puis utiliser immédiatement l’embout de la pipette pour transférer 250 μL du réactif de revêtement de la matrice extracellulaire dans le tube conique contenant le milieu DMEM-F12.
        REMARQUE: La solution de revêtement standard peut être conservée pendant 2 semaines à 4 ° C.
    2. Formation de corps embryoïdes (EB)
      1. Préparer le milieu EB qui peut être maintenu à 4 °C jusqu’à 4 jours.
      2. Une fois que les CSPi ont atteint 80 % de confluence, dissocier les colonies en les lavant avec 1 mL de DPBS et en ajoutant 1 mL d’un réactif de dissociation pendant 2 min à 37 °C. Délogez les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules en grattant plusieurs fois pour créer une suspension unicellulaire. Recueillir les cellules et transférer le tout dans un tube conique de 15 mL contenant 9 mL de DPBS.
      3. Centrifuger les cellules à 500 × g pendant 1 min, retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu EB. Prendre 10 μL de cellules et diluer 1:1 avec du bleu de trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et, en fonction du nombre de cellules, diluez le stock cellulaire jusqu’à une dilution finale de 10 000 cellules par 100 μL. Pour les cellules de placage, ajouter 100 μL de cellules diluées par puits dans une plaque à fond rond à faible adhérence, à 96 puits.
        NOTA : En général, 48 puits de la plaque de 96 puits peuvent être obtenus à partir de chaque puits confluent à 80 % des CSPi.
      4. Centrifuger la plaque à 125 × g pendant 3 min et incuber à 37 °C et 5% deCO2 pendant 4 jours. Effectuez un changement demi-milieu le jour 2 en utilisant une pipette multicanal et en recueillant doucement 50 μL d’ancien milieu, puis en ajoutant 50 μL de milieu EB frais.
        REMARQUE : Le jour 4, les CSPi formeront des structures cellulaires sphériques appelées EB, comme décrit dans la section des résultats. Le processus de différenciation EB peut être prolongé jusqu’à 7 jours, si nécessaire.
    3. Génération de précurseurs primitifs de macrophages (PMP)
      1. Préparer le milieu de base PMP, filtre stérile, et le conserver à 4 °C jusqu’à 1 mois.
      2. Enduire les puits d’une plaque à 6 puits en ajoutant 1 mL de solution de revêtement Matrigel glacé et incuber à 37 °C et 5% de CO 2 pendant au moins2 h ou de préférence pendant une nuit.
      3. Le jour 4 de la différenciation EB, transférer les EB dans les puits recouverts de matrigel en collectant les EB avec des pointes de pipette de 1 mL (à l’aide d’une pipette). Pipeter de haut en bas une ou deux fois pour déloger les EB du puits. Tenez la plaque à 6 puits à un angle incliné pour permettre aux EB de s’installer au bord du puits.
        NOTE: Neuf ou dix EB peuvent être plaqués par puits revêtu.
      4. Une fois que tous les EB se sont installés, pipeter doucement et retirer l’ancien milieu à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL tout en gardant les EB au bord du puits. Ajouter 3 mL de milieu complet PMP fraîchement préparé à chaque puits. Répartir uniformément les cellules dans les puits en mélangeant manuellement la plaque d’un côté à l’autre et de l’arrière vers l’avant. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
      5. Ne pas déranger la plaque pendant 7 jours pour permettre aux EB de se fixer au fond du puits. Après ce temps, effectuez un changement demi-moyen en utilisant le milieu complet PMP.
        REMARQUE: À ce stade, la plupart des EB doivent être fixés à la plaque. Tous les EB flottants peuvent être supprimés.
      6. Après 5-7 jours, inspectez les EB sous un microscope à champ lumineux à un grossissement de 4x pour vous assurer qu’ils sont fixés au fond des puits. Modifier le support comme décrit au point 1.2.3.5. Au jour 21, effectuer un changement de milieu complet avec 3 mL de milieu complet PMP.
        REMARQUE: Les progéniteurs myéloïdes flottant dans le milieu peuvent être évidents à ce stade. Ces cellules doivent être jetées lors du changement de milieu.
      7. Le jour 28, recherchez des cellules rondes appelées PMP dans le surnageant et recueillez le milieu contenant les PMP à l’aide d’une pipette de 10 ml et d’un pipetor automatique. Veillez à ne pas déranger les EB. Transférer les PMP et le milieu dans un tube conique de 15 mL et procéder comme décrit à l’étape 1.2.4.
        REMARQUE : Habituellement, les PMP de la même ligne iPSC peuvent être prélevés dans cinq puits d’une plaque de 6 puits et regroupés dans un seul tube conique de 15 mL.
      8. Ajouter 3 mL de milieu complet PMP frais pour un entretien ultérieur des EB. Comme les PMP émergent continuellement des EB pendant plus de 3 mois, collectez-les tous les 4 à 7 jours (ne laissez pas le milieu changer de couleur pour un ton jaune) comme décrit aux étapes 1.2.3.7 et 1.2.3.8.
        REMARQUE : Bien que les PMP puissent être recueillies pendant plusieurs mois, elles peuvent changer de phénotype au fil du temps.
    4. Différenciation par rapport aux iMG
      1. Préparer le milieu de base iMG (table des matières), filtre stérile et le conserver à 4 °C jusqu’à 3 semaines.
      2. Une fois les PMP recueillis dans un tube conique de 15 mL, centrifugez-les à 200 × g pendant 4 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les PMP en utilisant 1-2 mL de milieu basal iMG. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre en prenant une petite partie aliquote et en diluant 1:1 avec du bleu de trypan.
        NOTE: 0,5-1,5 × 106 PMP sont normalement obtenus chaque semaine en fonction de la lignée iPSC et de l’âge de la culture EB.
      3. Centrifuger à nouveau le reste des cellules à 200 × g pendant 4 min. Diluer les PMP à la concentration désirée de telle sorte que les cellules soient plaquées à une densité de ~105/cm2 sur des plaques traitées par culture cellulaire en utilisant un milieu complet iMG fraîchement préparé. Effectuer un changement demi-moyen en utilisant un milieu complet iMG fraîchement préparé tous les 3-4 jours pendant 10-12 jours pour permettre la différenciation terminale.
        REMARQUE: À ce stade, les cellules devraient acquérir une morphologie semblable à celle de la microglie. Pour confirmer l’engagement des PMP envers le devenir de la microglie, une analyse d’immunofluorescence est effectuée pour corroborer l’expression de marqueurs enrichis en microglie tels que le récepteur purinergique P2RY12 et la protéine transmembranaire 119 (TMEM119)9.
      4. Pour préserver la santé et la viabilité des cellules, effectuez toutes les expériences entre les jours 10 et 12 de différenciation iMG.

2. Essai de phagocytose utilisant des synaptosomes humains dérivés de motoneurones

  1. Différenciation médiée par le facteur de transcription des motoneurones inférieurs dérivés de l’iPSC (i3LMN)
    REMARQUE : Une ligne WTC11 avec insertion stable de la cassette de facteur de transcription inductible hNIL contenant les facteurs de transcription neurogénine-2 (NGN2), îlot-1 (ISL1) et homéobox 3 LIM (LHX3) dans le locus de la sphère de sécurité CLYBL a été utilisée pour le processus de différenciation décrit précédemment17. La conduite iPSC a été maintenue telle que décrite à l’étape 1.1.1, mais avec les conditions de revêtement décrites à l’étape 1.2.1. Tout réactif de revêtement de matrice extracellulaire peut être utilisé pour la culture de CSPi qui seront utilisées pour la différenciation neuronale puisque la laminine 521 n’est pas nécessaire. Tous les fluides sont équilibrés à température ambiante pendant au moins 1 h avant utilisation.
    1. Enrober la vaisselle de 10 cm de 5 ml de solution d’enrobage étalon comme décrit à l’étape 1.2.1.
      NOTE: Ici, 3-4 plats de 10 cm ont été utilisés par différenciation.
    2. Préparer le milieu de base d’induction, filtre stérile, et le conserver à 4 °C jusqu’à 3 semaines.
    3. Préparez le milieu Neuron, filtre stérile, et conservez-le à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
    4. Préparer le tampon de borate en mélangeant 100 mM d’acide borique, 25 mM de tétraborate de sodium et 75 mM de chlorure de sodium dans de l’eau stérile. Ajustez le pH à 8,5 et filtrez-le stérile.
    5. Une fois que les CSPi ont atteint 80% de confluence, laver les cellules avec DPBS et déloger les colonies en ajoutant 0,5 mM d’EDTA.
      NOTE: Deux puits suffisent généralement pour chaque plat de 10 cm.
    6. Incuber les cellules pendant 4-5 min à température ambiante. Retirer l’EDTA et ajouter 3 mL de DMEM/F12 avec HEPES à chaque puits.
    7. Grattez les cellules à l’aide d’un élévateur de cellules et utilisez une pipette de 10 ml pour retirer les cellules du fond du puits en piquetant doucement de haut en bas de 2 à 3x.
    8. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 300 × g pendant 3 min.
    9. Remettez les cellules en suspension dans 3 mL de milieu iPSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre.
    10. Plaquette 1,5 × 106 CSPi dans une capsule préenrobée de 10 cm avec 12 mL de milieu CSPi contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK.
    11. Le lendemain, retirez le milieu et lavez les cellules avec DPBS. Ajouter 12 mL de milieu d’induction complète fraîchement préparé pour induire l’expression des facteurs de transcription.
    12. Le jour 2, enrober des plats de 10 cm de 5 mL de solution d’enrobage de neurones préparés avec des volumes égaux de 0,1 mg/mL de poly-D-lysine et de 1 mg/mL de poly-L-ornithine diluée dans un tampon de borate. Incuber pendant une nuit à 37 °C et 5% de CO2.
    13. Le jour 3, laver la vaisselle enduite d’eau stérile 3x, aspirer complètement l’eau et laisser sécher la vaisselle en inclinant les assiettes et en les laissant partiellement découvertes à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pendant au moins 1 h à température ambiante.
    14. Une fois les plats complètement séchés, les enrober de 6 mL de milieu d’induction complète complété par 15 μg/mL de laminine et 40 μM de BrdU pendant au moins 1 h à 37 °C et 5 % de CO2.
      NOTE: Le traitement BrdU est recommandé pour éliminer les cellules mitotiquement actives et ainsi améliorer la pureté des cultures neuronales. Les effets du BrdU sur la santé neuronale sont minimes.
    15. Traiter les cellules différenciantes avec 3 mL de réactif de dissociation par boîte de 10 cm et incuber pendant 3-4 min à température ambiante.
    16. Ajouter 6 mL de DPBS dans la plaque sans retirer le réactif de dissociation et pipeter les cellules en solution de haut en bas 4-5x avec une pipette de 10 mL pour dissocier les cellules.
    17. Recueillir la suspension cellulaire et la faire passer à travers une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube conique de 50 mL. Ajouter 1 mL de milieu de base par induction pour rincer la crépine.
    18. Centrifuger les cellules à 300 × g pendant 5 min. Aspirer le milieu et remettre les cellules en suspension dans 3 mL de milieu à induction complète contenant 40 μM BrdU.
    19. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Introduire environ 2,5 × 10 6 cellules par boîte de 10 cm dans des boîtes préenrobées en diluant les cellules dans6 mL de milieu à induction complète contenant 40 μM de BrdU sans retirer la solution d’enrobage ajoutée à l’étape 2.1.14.
    20. Le jour 4, aspirer le milieu, laver les cellules 1x avec DPBS et ajouter un nouveau milieu d’induction complète contenant 40 μM BrdU.
    21. Le jour 6, aspirer le milieu, laver les cellules 1x avec DPBS et ajouter un milieu neuronal complété par 1 μg/mL de laminine.
    22. Au jour 9, changer 1/3du milieu en le remplaçant par un milieu neuronal frais complété par 1 μg/mL de laminine.
    23. Maintenir i 3 LMN pendant 25 jours supplémentaires en effectuant des changements demi-moyens avec un milieu neuronal complété par 1 μg/mL frais de laminine tous les3-4jours.
      NOTE: A ce moment-là, i3LMN devraient présenter une morphologie neuronale avec des processus longs. Les neurones ont également tendance à former des amas ou des amas de cellules. Une description plus détaillée de la façon de valider la différenciationdes 3LMN peut être trouvée ailleurs17.
  2. Purification et étiquetage des synaptosomes
    REMARQUE : Maintenez des conditions stériles et effectuez toutes les étapes à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité.
    1. Lavez i3 LMN deux fois avec DPBS.
    2. Ajouter 2 mL de réactif de lyse cellulaire glacée pour isoler les synaptosomes, incuber sur de la glace pendant 2 minutes et gratter fermement les neurones.
    3. Transférer le lysat dans plusieurs microtubes de 2 mL (~1,5 mL de lysat par tube) et centrifuger à 1 200 × g pendant 10 min à 4 °C.
      REMARQUE: Maintenez les tubes sur la glace tout au long de cette procédure.
    4. Recueillir le surnageant (jeter la pastille) et centrifuger à 15 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Conserver et remettre en suspension la pastille contenant les synaptosomes avec un volume similaire (comme le lysat original) de DMSO à 5% dans DPBS.
      REMARQUE: Les synaptosomes peuvent être immédiatement marqués avec un fluorophore ou stockés à -80 ° C pour une utilisation future.
    5. Effectuer un dosage des protéines de l’acide bicinchoninique (BCA) pour tous les tubes afin d’évaluer le rendement total en protéines dans la préparation synaptosique.
      NOTE: D’autres tests pour mesurer la concentration en protéines peuvent être utilisés. Le rendement total en protéines obtenu à partir de différentes préparations a été inclus dans le tableau 1 à titre de référence. Il est recommandé d’effectuer une analyse Western blot de la préparation synaptosome pour confirmer la présence de protéines présynaptiques et postsynaptiques. Ici, le marqueur présynaptique, la synaptophysine (SYP), et le marqueur postsynaptique, la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD95) ont été choisis pour l’analyse Western blotting comme décrit précédemment19.
    6. Préparer une solution de 100 mM de bicarbonate de sodium dans de l’eau, ajuster le pH à 8,5 et filtrer stérile.
    7. Solubiliser 1 mg de poudre lyophilisée du colorant sensible au pH utilisé dans 150 μL de DMSO. Fabriquez des aliquotes à usage unique et conservez-les à -80 °C.
    8. Centrifuger les synaptosomes à 15 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
    9. Diluer jusqu’à 1 mg de synaptosomes dans 100 μL de solution de bicarbonate de sodium 100 mM.
    10. Pour marquer les synaptosomes, ajouter 1 μL de colorant sensible au pH reconstitué pour 1 mg de synaptosomes et couvrir la réaction avec du papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Agiter à température ambiante pendant 2 h à l’aide d’un agitateur tubulaire.
    11. Ajouter 1 mL de DPBS dans le tube et centrifuger les synaptosomes marqués à 15 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
    12. Retirer le surnageant et effectuer quatre lavages supplémentaires comme décrit à l’étape 2.2.11.
    13. Après le lavage final et l’essorage, retirer le surnageant autant que possible sans déranger la pastille et remettre en suspension les synaptosomes marqués avec 5% de DMSO dans DPBS à un volume correspondant à la concentration souhaitée (0,7 μg/μL utilisé ici). Préparer les aliquotes à usage unique et les conserver à -80 °C. Assurez-vous d’éviter l’exposition à la lumière aux synaptosomes étiquetés.
  3. Test de phagocytose sur cellules vivantes
    1. Plaquer 20-30 × 10 4 PMP dans des plaques à 96 puits dans 100 μL de milieu complet iMG et suivre le processus de différenciation pendant 10 jours comme indiqué à l’étape 1.2.4.
    2. Le jour de l’essai, préparer la solution de coloration nucléaire en ajoutant 1 goutte d’une coloration nucléaire pour cellules vivantes dans 2 mL de milieu basal iMG.
    3. Retirer 40 μL de milieu par puits de la plaque de 96 puits et ajouter 10 μL de la solution de coloration nucléaire à l’aide d’une pipette multicanal. Incuber la plaque à 37 °C et 5% de CO 2 pendant2 h.
    4. Décongeler les synaptosomes marqués sur de la glace et soniquer doucement à l’aide d’un soniateur d’eau pendant 1 min. Transférez immédiatement les synaptosomes sur la glace. Diluer les synaptosomes marqués dans un milieu complet iMG dans un rapport de 1 μL de synaptosomes par 50 μL de milieu.
      REMARQUE : La concentration de synaptosome dépend du dosage et peut nécessiter une optimisation. Pour maintenir un pourcentage relativement faible (c.-à-d. 0,1 % ou moins) de DMSO dans le milieu, il est conseillé de ne pas ajouter plus de 2 μL de synaptosomes par puits.
    5. Comme témoin négatif, prétraiter certains puits avec de la cytochalasine D pour inhiber la polymérisation de l’actine et donc la phagocytose. Préparer une solution de cytochalasine D 60 μM dans un milieu complet iMG. Ajouter 10 μL de cette solution à chaque puits pour une concentration finale de 10 μM et incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 30 min.
    6. Sortir la plaque de l’incubateur et incuber à 10 °C pendant 10 min. Maintenir la plaque sur de la glace et ajouter 50 μL de milieu contenant des synaptosomes préparés comme décrit à l’étape 2.3.4.
    7. Centrifuger la plaque à 270 × g pendant 3 min à 10 °C et maintenir la plaque sur la glace jusqu’à l’acquisition de l’imagerie.
  4. Acquisition et analyse d’imagerie
    1. Insérez la plaque dans un lecteur d’imagerie de cellules vivantes et sélectionnez les puits à analyser.
    2. Sélectionnez un objectif 20x .
    3. Ajustez la mise au point, l’intensité des diodes électroluminescentes (LED), le temps d’intégration et le gain des canaux de fond clair et bleu (4',6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]). La fluorescence des synaptosomes devrait être négligeable au point temporel initial. Pour vous concentrer sur le canal rouge (RFP), utilisez le canal en fond clair comme référence. Le temps d’intégration et le gain peuvent varier d’une expérience à l’autre; utilisez ces paramètres initiaux pour le canal rouge : LED : 4, temps d’intégration : 250 et gain : 5.
    4. Sélectionnez le nombre de tuiles individuelles à acquérir dans un montage par puits (acquérir 16 tuiles au centre du puits, imageant ainsi environ 5% de la surface totale du puits). Réglez la température à 37 °C et l’intervalle de temps souhaité pour l’imagerie.
      NOTE: Les images ont été acquises toutes les 1 à 2 heures pendant une période allant jusqu’à 16 heures dans cette étude.
    5. Ouvrez le logiciel d’analyse.
      1. Ouvrez l’expérience qui contient les images. Cliquez sur l’icône Réduction des données.
      2. Dans le menu, sélectionnez Assemblage d’images sous Traitement d’imagerie pour créer une image complète à partir des tuiles individuelles 4 x 4 du montage avec les paramètres décrits dans le Tableau 2.
      3. Une fois les images assemblées créées, définissez un seuil d’intensité à l’aide des canaux DAPI et RFP pour ces images. Ouvrez une image et cliquez sur Analyser; sous Analyse, sélectionnez Analyse cellulaire, puis sous Canal de détection, choisissez une image assemblée dans les canaux DAPI ou RFP. Accédez à l’onglet Primary Mask and Count (Masque primaire et nombre) et établissez une valeur de seuil et des valeurs de taille d’objet qui sélectionnent correctement les noyaux de cellule dans le canal DAPI ou le signal synaptosome dans le canal RFP. Répétez le processus avec différentes images jusqu’à ce que les paramètres pouvant être appliqués à l’ensemble de l’expérience soient optimisés.
        REMARQUE : Les valeurs suggérées se trouvent dans le tableau 2.
      4. Pour compter le nombre de noyaux, accédez au menu Réduction des données et, sous Analyse d’image, sélectionnez Analyse cellulaire. Accédez à l’onglet Primary Mask and Count (Masque principal et nombre) et, sous Channel, sélectionnez les images assemblées DAPI et utilisez les paramètres décrits dans le Tableau 2.
      5. Accédez à l’onglet Mesures calculées et sélectionnez Nombre de cellules. Pour obtenir la zone du signal synaptosome, allez dans le menu Réduction des données et sous Analyse, sélectionnez Analyse cellulaire.
      6. Accédez à l’onglet Primary Mask and Count (Masque principal et comptage ) et, sous Channel, sélectionnez RFP Stitched images (Images assemblées RFP ) et utilisez les paramètres détaillés dans le tableau 2.
      7. Accédez à l’onglet Métriques calculées et sélectionnez Zone de somme d’objets. Dans l’onglet Réduction des données , cliquez sur OK et autorisez le logiciel à analyser toutes les images acquises.
      8. Exportez les valeurs Zone de somme d’objets et Nombre de cellules pour chaque point temporel. Divisez la zone de somme d’objets par le nombre de cellules pour calculer la zone normalisée par point temporel. Si vous comparez plusieurs traitements ou génotypes, calculez l’indice de phagocytose à l’aide de l’équation (1) :
        figure-protocol-1 (1)
      9. Enregistrez les résultats et intégrez les données.

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Résultats

Pour générer des iMG à l’aide de ce protocole, il est important de commencer par des iPSC indifférenciés qui montrent une morphologie de colonie compacte avec des bords bien définis (Figure 2A). Les CSPi dissociées maintenues comme décrit dans la section sur la formation d’EB formeront des agrégats sphériques, appelés EB, qui augmenteront en taille jusqu’au jour 4 de la différenciation (Figure 2B). Une fois que les EB sont collectés et plaqués dans les condition...

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Discussion

Le protocole de différenciation décrit ici fournit une méthode efficace pour obtenir des cellules de type microglie dérivées de l’iPSC en ~6-8 semaines avec une pureté élevée et un rendement suffisant pour effectuer des expériences d’immunofluorescence et d’autres tests nécessitant un plus grand nombre de cellules. Ce protocole a donné jusqu’à 1 × 106 iMGs en 1 semaine, ce qui permet l’extraction de protéines et d’ARN et les analyses correspondantes en aval (par exemple, RNASeq, qRT-PCR, Western blot, spectrom...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs remercient Michael Ward d’avoir fourni la ligne iPSC hNIL du WTC11 pour la différenciation des motoneurones et les Laboratoires Jackson d’avoir fourni la ligne iPSC clone B03 du clone KOLF2.1J WT utilisée pour la différenciation de la microglie. Nous remercions également Dorothy Schafer pour son soutien lors de la mise en œuvre des protocoles, Anthony Giampetruzzi et John Landers pour leur aide avec le système d’imagerie de cellules vivantes ainsi que Hayden Gadd pour ses contributions techniques lors des révisions et Jonathan Jung pour sa collaboration à cette étude. Ce travail a été soutenu par le Fonds Dan et Diane Riccio pour les neurosciences de l’UMASS Chan Medical School et le Angel Fund, Inc.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps pour l’analyse par immunofluorescence
anti-IBA1Wako Chemical USANC9288364 dilution1:350
anti-P2RY12Sigma-AldrichHPA014518dilution 1:50
anti-TMEM119 de lapinSigma-AldrichHPA051870dilution
1:100Anticorps pour l’analyse par Western blot
anti-&beta ;-Tubuline Anticorps de lapinAbcamab6046Dilution 1:500
Anticorps anti-Synaptophysine (SYP) Anticorps de lapinAbclonalA6344Dilution 1:1 000
Anticorps anti-PSD95 Anticorps de sourisMilliporeMAB15961:500 dilution
Borate buffer composants
Acide borique (100 mM)SigmaB6768
Bicarbonate de sodium (NaHCO3) BioXtraSigma-AldrichS6297-250G
Chlorure de sodium (75 mM)Sigma  ; S7653
Tétraborate de sodium (25 mM)Sigma221732
Matériaux de culture cellulaire
plaques à 6 puitsGreiner Bio-One657160
40 &mu ; crépines à cellules m  ; Falcon352340
100 mm x 20 mm traité pour la culture tissulaireCELLTREAT229620
Élévateur de cellules, double extrémité, lame plate et Lame étroite, stérileCELLTREAT229305
à faible adhérence Plaque à fond rond à 96 puitsCorning7007
Primaria Plaque de culture cellulaire multipuits modifiée à 24 puitsCorning353847,
Primaria Cellule à 6 puits Transparent À fond plat Plaque de culture multipuits modifiéeCorning353846
Primaria Plat clair à 96 puits Microplaqueinférieure Corning353872
Réactifs de dissociation cellulaire
Accutase  ; Réactifs de dissociation Corning25058CIutilisés pour la différenciation des motoneurones inférieurs
Réactif TrypLE RéactifLife Technologies12-605-010Réactifs de dissociation utilisés pour la différenciation microgliale
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575020
Réactifs d’enrobage pour la culture cellulaire
Matrigel GFR Matrice membranaireCorning&commerce ;354230Réactif d’enrobage de matrice extracellulaire
CellAdhere Laminin-521Technologie STEMCELL77004Analogue à la laminine 521
Poly-D-LysineSigmaP7405Reconstituer à 0,1 mg/mL dans un tampon de borate
Poly-L-OrnithineSigma  ; P3655Reconstituer à 1 mg/mL dans un tampon de borate
Composants des milieux iPSC
  ; mTeSR Plus KitTechnologie STEMCELL100-0276Pour préparer les milieux iPSC mélanger les composants à 1x
Composants des milieux EB
BMP-4Fisher ScientificPHC9534concentration finale 50 ng/
mLMilieu iPSCconcentration finale 1x
Inhibiteur de ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822concentration finale 10 & micro ; M
SCFPeproTech300-07concentration finale 20 ng/mL
VEGF PeproTech100-20Aconcentration finale 50 ng/mL
Composants du milieu de base PMP
GlutaMAXGibco35050061concentration finale 1x
pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Gibco15140122concentration finale 100 U/mL
X-VIVO 15Lonza12001-988concentration finale 1x
Composants du média complet PMP
55 mM 2-mercaptoéthanolGibco21985023concentration finale 55 µ ; M
IL-3PeproTech200-03concentration finale 25 ng/mL
M-CSFPeproTech300-25concentration finale 100 ng/mL
PMP support de basefinale 1x
Composants du média de base iMG
Advanced DMEM/F12Gibco12634010concentration finale 1x
GlutaMAXGibco35050061concentration finale 1x
supplément N2, 100xGibco17502-048concentration finale 1x
pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL)Gibco15140122concentration finale 100 U/mL
Composants du milieu complet iMG
55 mM 2-mercaptoéthanolGibco21985023concentration finale 55 µ ; M
IL-34PeproTech ou Biologend200-34 ou 577904concentration finale 100 ng/mL
iMG milieu de basefinale 1x
M-CSFPeproTech300-25concentration finale 5 ng/mL
TGF-&beta ;PeproTech100-21concentration finale 50 ng/mL
Composants du média de base à induction
DMEM/F12 avec HEPESGibco11330032concentration finale 1x
GlutaMAXGibco35050061concentration finale 1x
supplément N2, 100xGibco17502-048final concentration 1x
acides aminés non essentiels (NEAA), 100xGibco11140050concentration finale 1x
Components of Complete induction media
Compound ECalbiochem565790concentration finale 0,2 &mu ; M et reconstituer le réactif de base à 2 mM dans de l’éthanol 1:1 et du DMSO
DoxycyclineSigmaD9891concentration finale 2 &mu ; g/mL et reconstituer le réactif mère à 2 mg/mL dans DPBS
em>Milieu de base d’inductionfinale 1x
inhibiteur de ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822concentration finale 10 &mu ; M
Components of Neuron mediaB-27
Plus Neuronal Culture SystemGibcoA3653401concentration finale 1x pour les milieux et suplemment
GlutaMAXGibco35050061concentration finale 1x
supplément N2, 100xGibco17502-048concentration finale 1x
Acides aminés non essentiels (NEAA), 100xGibco11140050concentration finale 1x
iPSC lines utilisées dans cette étude
KOLF2.1J : Clone WT B03The Jackson Laboratories
WTC11 hNILNational Institute of Health
Réactifs d’isolement des synaptoles
Kit de dosage des protéines BCAThermo Scientific Pierce23227
diméthylsulfoxyde (DMSO)SigmaD2650
Syn-PER Réactif d’extraction de protéines synaptiquesThermo Scientific87793Réactif de lyse cellulaire pour l’isolement des synaptosomes
colorants de dosage de la phagocytose
Réactif NucBlue Live ReadyInvitrogen  ; R37605
pHrodo Rouge, ester succinimidyliqueThermoFisher Scientific  ; P36600Désigné comme colorant sensible au pH
Autres réactifs de culture cellulaire
Bleu de trypan, solution à 0,4 %AMRESCO INCK940-100ML
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma22144-77-0
BrdUSigmaB9285Reconstituer à 40 mM dans de l’eau stérile
Cytochalasine DSigmaconcentration finale 10 & micro ; M
DPBS avec calcium et magnésiumCorning21-030-CV
DPBS sans calcium et magnésiumCorning21-031-CVAppelé DPBS
KnockOut  ; DMEM/F-12Gibco12660012Appelé DMEM-F12 optimisé pour la croissance de cellules souches embryonnaires humaines et pluripotentes induites
Laminine Protéine de souris, Gibco naturel23017015Appelé laminine
Logiciel et équipement
CentrifugeuseEppendorfModèle 5810R
Cytation 5 Imagerie de cellules vivantes lecteurBiotek
Gen5 Logiciel de lecture et d’imageur de microplaquesBiotekversion 3.03
Multi-Therm Heat-ShakeBenchmarkse référer à l’agitateur de tube
Sonicateur d’eauElmaMode Transsonic 310
anticorps de lapin anticorps de lapin concentration concentration <concentration

Références

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Mots-clés

Diff renciation microglialedosage des synaptosomesmarquage immunofluorescentWestern blotmaladies neurod g n ratives

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