Déchiffrer le mécanisme moléculaire et la fonction des toxines formant des pores à l’aide de Leishmania major

Summary

Un protocole utilisant des promastigotes majeurs de Leishmania est présenté ici pour déterminer la liaison, la cytotoxicité et la signalisation induites par les toxines formant des pores. Une preuve de concept avec la streptolysine O est fournie. D’autres toxines peuvent également être utilisées pour tirer parti des mutants génétiques disponibles chez L. major afin de définir de nouveaux mécanismes de résistance aux toxines.

Abstract

Comprendre la fonction et le mécanisme des toxines formant des pores (PFT) est difficile parce que les cellules résistent aux dommages membranaires causés par les PFT. Bien que les approches biophysiques aident à comprendre la formation des pores, elles reposent souvent sur des approches réductionnistes dépourvues du complément complet de lipides et de protéines membranaires. Les cellules humaines cultivées fournissent un système alternatif, mais leur complexité et les redondances dans les mécanismes de réparation rendent difficile l’identification de mécanismes spécifiques. En revanche, le protozoaire humain pathogène responsable de la leishmaniose cutanée, Leishmania major, offre un équilibre optimal entre complexité et pertinence physiologique. L. major est génétiquement traitable et peut être cultivé à haute densité in vitro, et tout impact des perturbations sur l’infection peut être mesuré dans des modèles murins établis. De plus, L. major synthétise des lipides distincts de leurs homologues mammifères, ce qui pourrait modifier la dynamique membranaire. Ces altérations de la dynamique membranaire peuvent être sondées avec des PFT de la famille de toxines la mieux caractérisée, les cytolysines dépendantes du cholestérol (CDC). Les CDC se lient à l’ergostérol dans la membrane de Leishmania et peuvent tuer les promastigotes de L. major, ce qui indique que L. major est un système modèle approprié pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires de la fonction PFT. Ce travail décrit les méthodes de test de la fonction PFT chez les promastigotes de L. major, y compris la culture de parasites, les outils génétiques pour évaluer la sensibilité aux lipides, les tests de liaison membranaire et les tests de mort cellulaire. Ces essais permettront l’utilisation rapide de L. major en tant que système modèle puissant pour comprendre la fonction PFT à travers une gamme d’organismes évolutifs divers et de points communs dans l’organisation des lipides.

Introduction

Les toxines formant des pores (PFT) constituent la plus grande famille de toxines bactériennes¹, mais les mécanismes par lesquels elles perforent et détruisent les cellules sont mal compris. La famille de toxines formant des pores la mieux étudiée est celle des cytolysines dépendantes du cholestérol (CDC). Les CDC sont principalement synthétisés par des bactéries à Gram positif, y compris l’agent causal de la fasciite nécrosante, Streptococcus pyogenes². S. pyogenes sécrète la streptolysine O (SLO) du CDC, qui se lie aux stérols dans la membrane plasmique des cellules hôtes sous forme de monomères, olig....

Protocol

Toutes les lignes directrices appropriées et les pratiques normalisées en matière de microbiologie, d’innocuité et de culture cellulaire ont été utilisées pour l’utilisation et la manipulation de l’agent pathogène du GR2 Leishmania major et de l’ADN recombinant. Toutes les expériences avec L. major vivant ont été réalisées dans une enceinte de biosécurité dans un laboratoire certifié BSL-2. Le travail a été supervisé par le comité institutionnel de biosécurité de l’Université Texas Tech.

REMARQUE : Du point de vue de l’innocuité, les promastigotes L. major vivants sont des agents pathogènes du groupe de risque 2 .....

Results

Augmentation de la sensibilité promastigote au SLO dans le tampon de Tyrode par rapport à M199
La sensibilité SLO des promastigotes de L. major a été comparée entre différents tampons d’essai. Les promastigotes de type sauvage, spt2 et spt2^-/+SPT2 ont été testés avec SLO dans du M199 sans sérum ou du tampon de Tyrode complété par 2 mM CaCl₂ pendant 30 minutes avant l’analyse sur un cytomètre en flux. Les parasites appropriés pour l’analyse ét.......

Discussion

Dans cette étude, des méthodes pour étudier les mécanismes moléculaires et les fonctions des PFT ont été décrites, en utilisant l’agent pathogène humain Leishmania major comme système modèle. Un test de cytotoxicité basé sur la cytométrie en flux à moyen débit pour mesurer la viabilité d’une cellule unique a été mis au point. La viabilité est quantitative au niveau de la population parce que les valeurs de CL₅₀ peuvent être calculées à partir de la courbe dose-réponse à l’aide d’une modélisation logis.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes de microtitration (Marsh) de 1,2 mL	Fisher	02-681-376	Essai de cytotoxicité
Tube de microcentrifugation de 1,5 mL	Fisher	05-408-129	Dilutions de toxines
Tube de centrifugation de 15 mL.	Avantor VWR (Radnor, PA)	89039-666	Pour maintenir les cellules et les milieux
1x Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Fisher	BP399	Pour le traitement cellulaire
3 % H2O2  ;	Walmart ; (Fayetteville, AR)	N/A	Pour ECL
5x M199	Cell-gro	11150067	Milieu de croissance basal pour L. major promastigotes
Enceinte de biosécurité	Baker		Pour cultiver des cellules dans des conditions stériles
Albumine sérique bovine (BSA)	Fisher	BP1605-100	Fraction V pureté acceptable
CaCl2	Fisher	BP510-100	matière 100 mM
Centrifugeuse	Thermo Fisher  ;	Heraeus Megafuge 40R	Pour granuler les cellules de la culture
Cy5 Pack de colorants monoréactifs	Cytiva (Marlborough, MA)	PA25031	Marquage fluorophore pour les toxines
Bain sec numérique	Benchmark	BSH1002	Pour dénaturer les échantillons de protéines
EGTA	Amresco	0732-100G	Concentration de stock 0,5 M
Excel	Microsoft (Redmond, VA)		Analyse des données logiciel
Cytomètre en flux (4 lasers Attune NxT)	Fisher		Cytomètre pour l’acquisition de données
FlowJo	BD (Ashland, OR)		Logiciel
Formaldéhyde	Fisher	BP531-500	Fixateur pour le comptage des cellules
G418	Fisher	BP673-1	Agent de sélection pour les cellules
Hellmanex III	Sigma	Z805939	Dilué 1:4 pour le nettoyage du cytomètre
Hémacytomètre	Fisher	0267151B	Pour le comptage des cellules
Globules rouges humains	Zen-bio (Durham, NC)	SER-10MLRBC	Pour valider l’activité des toxines
Seau
Microscope optique	Nikon	Eclipse 55i	Pour visualiser les cellules
Nitrocellulose	Fisher	88018	Pour sonder protéines via des anticorps
Pipettors et pointes	Avantor VWR		Pour distribuer des réactifs
Alimentation	Bio-Rad		Pour exécuter SDS-PAGE et transferts Iodure
propidium	Biotium	40016	Concentration de stock 2 mg/mL dans l’eau
Échelle protéique	Bio-Rad	161-0373	Pour déterminer le poids moléculaire des protéines
SDS-PAGE Running Appareil (Mini Protean III)	Bio-Rad	165-3302	Pour séparer les protéines en fonction de leur taille
Ruban d’étanchéité	R& D	DY992	Pour sceller des plaques avec des cellules
Streptolysine O C530A insert			plasmidique Cloné dans le vecteur pBAD-gIII (Référence : 7)
Streptolysine O C530A toxine Laboratoire	purifié		Activité spécifique  ; 4.34 x 105 HU/mg
Rotor à godets oscillants	Thermo Fisher  ;	75003607	Pour centrifuger les cellules
Plaque à fond en V	Greiner Bio-one	651206	Pour le test de cytotoxicité
Vortex	Benchmark	BV1000	Pour mélanger les cellules
Système d’imagerie Western Blot (Chemi-doc)	Bio-Rad		Pour visualiser les protéines par Western Blot
Appareil de transfert Western Blot (Mini Protean III)	Bio-Rad	170-3930	Transfert protéines en nitrocellulose
Whatman Papier filtre	GE Healthcare Life Sciences	3030-700	Utilisé dans le transfert de protéines en nitrocellulose
anticorps anti-ERK	Cell Signaling Technologies  ;	Cat# 9102S	Lapin (dilution 1:1000)
Anticorps anti-lipophosphoglycane (LPG)	CreativeBioLabs  ;	Cat# WIC79.3	Souris (1 : 1000)
Anticorps anti-MEK	Cell Signaling Technologies  ;	Cat# 9122L	Lapin (1:1000)
Anti-souris IgG, conjugué HRP	Jackson Immunoresearch  ;	Cat#715-035-151	Âne (1:10000)
Anticorps anti-phosphoERK	Cell Signaling Technologies  ;	Cat# 9101S	Rabbit (1:1000)
Anticorps anti-pMEK	Cell Signaling Technologies  ;	Cat# 9121S	Lapin (1:1000)
Anti-lapin IgG, HRP conjugué	Jackson Immunoresearch  ;	Cat#711-035-152	Âne (1:10000)
Anticorps anti-tubuline	Sigma	Cat# T5168	Souris (1 : 2000)
Leishmania major Genotypes  ;			Référence : 13
Addback épisomal (spt2-/+SPT2)			&Delta ; spt2 ::HYG/&Delta ; spt2 :PAC/+pXG-SPT2
Sérine palmitoyltransférase sous-unité 2 knockout (spt2-)			&Delta ; spt2 ::HYG/&Delta ; spt2 ::P AC  ;
Type sauvage (WT)			LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P)