Un modèle murin d’instabilité de l’articulation complexe cheville-sous-talienne

Les entorses de la cheville sont l’une des blessures sportives les plus courantes dans le monde. On estime que 10 000 personnes sont blessées chaque jour aux États-Unis¹, dont 15 à 45 % pour les blessures liées au ^sport2. Les coûts médicaux associés au traitement des entorses de la cheville aux États-Unis s’élèvent à 4,2 milliards de dollars par an ^3,4,5. L’instabilité chronique du pied est un problème courant à la suite d’entorses de la cheville et survient dans environ 74 % des entorses de la cheville⁶, y compris l’instabilité de la cheville ou sous-talienne. Cependant, en raison des symptômes et des signes cliniques similaires, il est difficile pour le personnel médical de distinguer si l’instabilité chronique de la cheville s’accompagne également d’une instabilité chronique de l’articulation sous-talienne en clinique et, par conséquent, l’instabilité sous-talienne chronique peut facilement passer inaperçue. Par conséquent, l’incidence réelle de l’instabilité chronique de l’articulation complexe cheville-sous-talienne (ASCJ) (un type spécifique d’instabilité chronique du pied qui comprend à la fois l’instabilité chronique de la cheville et l’instabilité sous-talienne chronique) peut être plus élevée que celle rapportée ^7,8,9. Si elle n’est pas traitée, l’instabilité chronique de l’articulation complexe cheville-sous-talienne peut provoquer des entorses répétées de la cheville, conduisant à un cercle vicieux d’entorses de la cheville et d’instabilité chronique du complexe cheville-sous-talaire. L’instabilité chronique à long terme du complexe cheville-sous-talaire peut entraîner une dégénérescence de l’ASCJ et une arthrose post-traumatique, qui peut affecter les articulations adjacentes dans les cas graves¹⁰. Pour ces maladies, le traitement clinique actuel est principalement conservateur, en plus des méthodes de traitement chirurgical telles que la réparation et la reconstruction ligamentaire^11,12.

L’ASCJ est la structure centrale du pied et maintient l’équilibre du corps pendant le mouvement¹³. Des recherches approfondies ont été menées sur la structure de l’articulation de la cheville et de l’articulation sous-talienne séparément^14,15,16,17. Cependant, les recherches sur l’ensemble de l’articulation cheville-sous-talienne sont rares. Environ un quart des cas de blessure à la cheville sont associés à une lésion de l’articulation sous-talienne¹⁸. En raison du mécanisme complexe de l’instabilité de l’ASCJ, il n’y a pas de consensus sur le diagnostic et le traitement de l’instabilité en milieu clinique. Compte tenu de la situation actuelle des blessures à la cheville en clinique, une méthode plus scientifique est nécessaire pour étudier la cheville et l’articulation sous-talienne dans son ensemble, fournissant ainsi une nouvelle compréhension pour l’étude des maladies du pied.

Étant donné que la structure anatomique de l’arrière-pied de la souris au niveau musculo-squelettique est comparable à celle du pied humain 19, dans plusieurs études, des modèles murins pour la recherche pied/cheville ont déjà été mis en œuvre^10,19. Chang et ^al.19 ont développé avec succès trois modèles murins différents d’arthrose de la cheville. Inspirés par l’établissement réussi de l’instabilité de la cheville dans le modèle murin, nous avons établi un modèle murin pour l’instabilité du complexe cheville-sous-talaire, en émettant l’hypothèse que la section des ligaments partiels de l’arrière-pied de la souris entraînerait une instabilité mécanique de l’ASCJ, ce qui conduirait à l’arthrose post-traumatique (PTOA) de l’ASCJ. Le modèle animal d’instabilité ASCJ pourrait être utilisé pour le traitement de l’instabilité de la cheville et de l’instabilité sous-talienne, ce qui est plus conforme à la situation clinique réelle que le modèle d’instabilité simple de la cheville actuellement utilisé 7,8,9,19. Pour tester cette hypothèse, deux modèles murins d’instabilité de l’ASCJ induite par la transection ligamentaire ont été conçus. Les résultats de la fonction sensori-motrice - le test de la poutre d’équilibre, l’analyse de l’empreinte et l’évaluation de la nociception thermique - ont été utilisés pour évaluer la faisabilité du modèle, et la micro-tomodensitométrie (TDM) et la coloration histologique ont été utilisées pour évaluer les dommages et la dégénérescence du cartilage articulaire de la souris. La mise en place réussie d’un modèle murin d’instabilité de l’ASCJ fournit non seulement une nouvelle compréhension pour l’étude des maladies du pied, mais fournit également une référence précieuse pour la recherche clinique sur les mécanismes liés aux blessures, offre de meilleures options de traitement pour les entorses de la cheville et est utile pour d’autres études sur la maladie.

Toutes les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Soochow.

1. Interventions chirurgicales

1. Divisez 21 souris mâles C57BL/6 de 6 semaines en trois groupes : le groupe du ligament cervical transverse et du ligament talo-fibulaire antérieur, le groupe du ligament cervical transverse et du ligament deltoïde, et le groupe de chirurgie simulée. Assurez-vous que toutes les souris ont été élevées dans un environnement qui répond aux normes spécifiques sans agents pathogènes (SPF).
2. Acclimater les souris au nouvel environnement d’élevage (un cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h, et une température et une humidité constantes de 18-22 °C et 40%-70%, respectivement) pendant 2 semaines avant l’expérience. Soumettre les souris à un entraînement à la poutre d’équilibre et à la démarche, en allant d’une extrémité d’une poutre d’équilibre ou d’un tuyau en forme de U à l’autre extrémité sans s’arrêter, 1 semaine avant l’expérience.
3. À l’âge de 8 semaines, anesthésier la souris par inhalation d’isoflurane en mouillant une boule de coton avec 2 mL d’isoflurane et en la plaçant dans un récipient hermétique pour une volatilisation complète. Surveillez l’activité de la souris et continuez l’inhalation jusqu’à ce que l’activité de la souris ait considérablement diminué. Déterminez la profondeur de l’anesthésie en pinçant les orteils des souris pour observer leurs réactions. Inhaler de l’isoflurane vaporisé (2 %) à travers un masque facial pour maintenir l’anesthésie chez les souris pendant les opérations ultérieures. Utilisez une pommade ophtalmologique vétérinaire pendant l’anesthésie pour éviter que les yeux ne se dessèchent.
4. Après l’anesthésie, retirez les poils de l’articulation de la cheville des membres postérieurs droits de la souris avec un rasoir et désinfectez la peau exposée trois fois avec des rondes alternées de boules de coton iodé et de boules de coton alcoolisées. Administrer 5 mg/kg de carprofène par injection sous-cutanée. Transférez la souris dans la salle d’opération de microchirurgie animale à l’aide d’un tampon chirurgical stérile.
5. Pour le groupe du ligament cervical transverse et du ligament talo-fibulaire antérieur (CL + ATFL), faites une incision longitudinale oblique vers le bas de 7 mm avec un scalpel sur la peau au-dessus de l’articulation de la cheville droite et sondez avec une pince droite microscopique devant l’articulation de la cheville.
6. Assurez-vous de l’exposition de l’ATFL au bord inférieur du corps du talus et du péroné après avoir sondé et coupez-le doucement avec un scalpel. Séparez les tendons fibulaires longs et courts et les tendons longs de l’extenseur des doigts, exposez le CL et coupez-le avec un scalpel.
7. Pour le groupe transverse CL + ligament deltoïde (DL), faites une incision verticale de 8 mm sur la peau médiale de l’articulation de la cheville droite et séparez carrément le DL de la malléole médiale pour finalement la couper. Ensuite, coupez le CL comme décrit à l’étape 1.5.
8. Pour le groupe simulé (groupe de chirurgie simulée), effectuez une chirurgie fictive sur l’articulation de la cheville droite, mais ne coupez aucun ligament.
9. Rincez l’incision avec une solution saline normale stérile et suturez-la avec du fil de nylon chirurgical 5-0. Enfin, désinfectez l’incision suturée à l’aide d’une boule de coton iodée.
10. Gardez la souris sous observation jusqu’à ce qu’elle puisse maintenir la décubition sternale et surveillez-la jusqu’à ce qu’elle soit pleinement consciente. Désinfecter l’incision de la cheville deux fois par jour avec une boule de coton iodé et administrer du carprofène (5 mg/kg, injection sous-cutanée), une fois par jour pendant 1 semaine. Reculez seul après l’opération et portez une attention particulière à l’état postopératoire de la souris.
11. Deux semaines après la chirurgie et lorsque le gonflement de l’articulation de la cheville a diminué, commencez à faire travailler les souris dans la machine à fatigue rotative de souris pendant 1 h chaque jour.

2. Test de poutre d’équilibre

1. Fixez une poutre circulaire en bois d’une longueur de 1 m et d’un diamètre de 20 mm, inclinée à 15° à une extrémité, à l’aide d’un clip pour trépied photographique, et placez l’autre extrémité sur un plan de travail relié à une cassette fermée.
2. Effectuez un entraînement à la poutre d’équilibre 1 semaine avant la chirurgie pour vous assurer que les souris se déplacent en douceur d’un bout à l’autre de la poutre. Considérons qu’une souris a réussi le test lorsqu’elle traverse le faisceau deux fois en 60 s sans faire de pause.
3. Effectuez deux essais consécutifs pour chaque souris et vaporisez la poutre d’équilibre avec de l’alcool à 75 % après chaque essai pour éviter que l’odeur résiduelle de la souris précédente n’affecte la souris suivante.
4. Effectuez le test de la poutre d’équilibre avant l’opération, 3 jours, 1 semaine, 4 semaines, 8 semaines et 12 semaines après la chirurgie. Enregistrez le temps moyen de chaque souris qui passe la poutre d’équilibre deux fois de suite et le nombre de fois que l’arrière-pied droit glisse de la poutre en tant que variables dépendantes.

3. Analyse de l’empreinte

1. Placez un canal en plastique en forme de U d’une longueur de 50 cm, d’une largeur de 10 cm et d’une hauteur de 10 cm sur la table expérimentale et connectez une extrémité du canal en plastique à une cassette fermée.
2. Placez un papier pigmenté uni à plat dans le canal, puis tenez la souris à deux mains et peignez ses pattes avant et arrière uniformément avec un pigment rouge et vert non toxique.
3. Placez doucement la souris peinte à une extrémité du canal et laissez-les se déplacer vers l’autre extrémité de la cassette. Prenez le papier pigmenté avec les empreintes, marquez-le et placez-le sur une grille pour le faire sécher dans un endroit aéré et ombragé.
4. Une fois que chaque souris est passée, vaporisez le canal en plastique en forme de U avec de l’alcool à 75 % afin d’éviter que l’odeur résiduelle de la souris précédente n’affecte la souris suivante.
5. Sélectionnez trois empreintes de souris transparentes consécutives sur chaque papier et utilisez une règle pour mesurer la longueur de pas de l’empreinte du pied droit de la souris, ainsi que la largeur de pas entre les empreintes gauche et droite.

4. Évaluation de la nociception thermique

1. Au cours de l’expérience, utilisez le test plantaire pour enregistrer le temps de réaction de nociception thermique du pied de souris et le temps de réaction de la souris pendant l’activité et le repos, respectivement. Enregistrez les données de mesure en quelques secondes.
2. Placez la souris dans l’instrument de mesure, alignez l’instrument avec son pied droit et commencez à chauffer l’instrument en augmentant lentement la température. Observez la réponse de la souris. Lorsque la température dépasse la tolérance, la souris se retire rapidement ou se lèche le pied droit. Enregistrez le temps à l’aide de l’instrument et définissez le temps comme temps de réaction pendant l’activité.
3. Pour mesurer le temps de réaction au repos, laissez la souris reposer pendant 30 minutes sur la table de repos sans chauffer, puis obtenez les données de temps comme expliqué à l’étape 4.2. Utilisez ces données temporelles acquises pour une analyse ultérieure.

5. Micro-tomodensitométrie

1. Euthanasiez des souris de 12 semaines avec du dioxyde de carbone en postopératoire, décollez la peau de leur cheville droite, puis coupez leur tibia moyen et leur péroné avec des ciseaux chirurgicaux pour obtenir des échantillons complets de cheville. Placer les échantillons dans des tubes à centrifuger marqués de 15 ml contenant 10 % de formol neutre pendant 48 h.
2. Après la fixation, placer les échantillons par lots (quatre échantillons par lot) dans un réservoir d’éponge spécial pour la micro-tomodensitométrie. Réglez les paramètres de la machine comme suit : tension = 50 kV, courant = 200 mA, filtre = 0,5 mmAl et résolution = 9 μm. Lancez le micro-tomodensitomètre.
3. Après la numérisation, utilisez le logiciel de reconstruction pour délimiter la plage de l’image et sélectionnez une position d’angle spécifique après avoir ajusté l’axe XYZ de l’image délimitée à l’aide d’un logiciel d’analyse de données commercial, comme décrit dans Liu et ^al.10.
4. Utiliser un logiciel d’analyse micro-tomodensitométrique pour sélectionner les régions d’intérêt continues à 10 couches dans les images restructurées ajustées par les axes XYZ, et analyser quantitativement les articulations requises pour déterminer la fraction volumique osseuse (BV/TV), comme décrit dans Liu et ^al.10.
5. Enfin, utilisez un logiciel de traitement d’images médicales tridimensionnelles pour effectuer un traitement d’image tomodensitométrique tridimensionnel des articulations de la cheville de la souris, comme décrit dans Liu et ^al.10. Après la reconstruction, observer l’usure et la formation d’ostéophytes dans l’ASCJ.

6. Coloration de section du cartilage articulaire

REMARQUE : Toutes les étapes de coloration sont effectuées dans une hotte et un masque est porté pendant la procédure.

1. Utilisez une pince à épiler microscopique et des ciseaux pour enlever l’excès de tissus mous autour des échantillons de cheville, puis placez les échantillons dans un tube à centrifuger contenant une solution de décalcification EDTA à 10 % préparée avec 44 g de NaOH, deux paquets de PBS et 400 g d’EDTA-2Na, avec un pH ajusté à 7,35-7,45 avec de l’acide chlorhydrique, et marquez les différents groupes.
2. Ensuite, placez le tube de centrifugation sur une table vibrante (vitesse réglée à 20 tr/min) pour la détartration et changez la solution de détartrage une fois par jour. Déterminer la décalcification des échantillons.
3. Après 1 mois de décalcification, déshydrater les échantillons avec de l’alcool de gradient, puis utiliser du n-butanol pendant 8 h à des fins de nettoyage. Enfin, immergez les échantillons dégagés dans de la paraffine en position coronale pour l’enrobage.
4. Placez les échantillons de paraffine dans un réfrigérateur à 4 °C pour une utilisation ultérieure. Avant le sectionnement, sortez les échantillons du réfrigérateur à 4 °C et placez-les dans un congélateur à −20 °C pendant environ 10 min pour faciliter la découpe du plan complet.
5. Fixez les échantillons sur le microtome et sectionnez-les à une épaisseur de 6 μm. Dans le même temps, utilisez un microscope pour observer si les échantillons ont été coupés au niveau attendu - pénétration facile d’une aiguille de seringue dans le tissu osseux.
6. Réglez à l’avance la température de l’eau de la machine à comprimés à 40 °C. Ensuite, coupez deux à trois sections complètes de paraffine d’affilée et transférez-les dans la machine à comprimés pour une expansion complète. Ensuite, retirez les sections de paraffine avec une lame de verre et vidangez l’eau. Enfin, marquez les diapositives avec des groupes et des chiffres.

7. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)

1. Placez les sections dans un incubateur à 60 °C de manière à ce que la structure intacte de l’articulation ASCJ puisse être observée au microscope et faites cuire les sections pendant 40 à 50 min. Ensuite, déparaffinez les sections avec du xylène 3x, numérotées I, II et III pour faciliter l’identification, pendant 15 min, 15 min et 10 min, respectivement.
2. Placez les sections déparaffinées dans 100 % éthanol 2x, numérotées I et II pour une identification facile, 90 % d’éthanol et 80 % d’éthanol pendant 3 min, 3 min, 5 min et 5 min, respectivement. Ensuite, lavez les sections avec de l’eau doublement distillée (ddH₂O) pendant 5 min.
3. Après avoir trempé avec de l’hématoxyline pendant 1 min, lavez les sections avec du ddH₂O jusqu’à ce qu’elles deviennent incolores. Faire tremper les sections dans une solution de différenciation à l’éthanol acide à 1 % pendant 30 s et les laver 3 fois pendant 1 min avec du ddH₂O. Après cela, teignez les sections avec une solution d’ammoniac à 1% pendant 1 min, puis lavez-les 3x pendant 1 min chacune avec du ddH₂O.
4. Ensuite, colorez les échantillons avec une solution de coloration à l’éosine pendant 1 min, puis mettez-les dans de l’éthanol à 95 % et de l’éthanol à 100 % pendant 1 minute chacun à la suite. Enfin, traitez les sections avec du xylène IV pendant 1 min.
5. Séchez les sections à l’air libre, collez une goutte de résine neutre sur les échantillons sur les lames et recouvrez-les d’une lamelle. Ensuite, prenez des images avec un microscope à fluorescence vertical en fond clair à 5x et 20x.

8. Safranine O-fast coloration verte

1. Placez les sections sélectionnées dans un incubateur à 60 °C et faites cuire les sections pendant 40-50 min. Ensuite, déparaffinez les sections avec du xylène I, II et III pendant 15 min, 15 min et 10 min, respectivement.
2. Placez les sections déparaffinées dans de l’éthanol I et II à 100 %, de l’éthanol à 90 % et de l’éthanol à 80 % pendant 3 min, 3 min, 5 min et 5 min, respectivement. Ensuite, lavez les sections avec ddH₂O pendant 5 min.
3. Après avoir trempé avec de l’hématoxyline pendant 1 min, lavez les sections avec du ddH₂O jusqu’à ce qu’elles deviennent incolores. Faire tremper les sections dans une solution de différenciation à l’éthanol acide à 1 % pendant 30 s et les laver 3 fois pendant 1 min avec du ddH₂O. Ensuite, teignez les sections avec une solution d’ammoniac à 1% pendant 1 min et lavez-les 3x pendant 1 min chacune avec du ddH₂O.
4. Faire tremper les sections dans du vert rapide à 0,05 % pendant 2 min, puis tremper les sections dans une solution d’acide acétique à 1 % pendant 30 s et dans de la safranine à 0,1 % pendant 5 min. Placez les échantillons colorés dans de l’éthanol à 95 % et de l’éthanol à 100 % pendant 1 min, l’un après l’autre.
5. Enfin, traitez les sections avec du xylène IV pendant 1 min. Séchez les sections à l’air libre, collez une goutte de résine neutre sur les échantillons sur les lames et recouvrez-les d’une lamelle. Ensuite, prenez des images avec un microscope à fluorescence vertical en fond clair à 5x et 20x.

9. Immunohistochimie

1. Jour 1 : Placez les sections sélectionnées dans un incubateur à 60 °C, faites cuire les sections pendant 40 à 50 minutes, puis déparaffinez-les avec du xylène I, II et III pendant 15 minutes, 15 minutes et 10 minutes, respectivement. Placez les sections déparaffinées dans de l’éthanol I et II à 100 %, de l’éthanol à 90 % et de l’éthanol à 80 % pendant 3 min, 3 min, 5 min et 5 min, respectivement. Ensuite, lavez les sections avec du ddH₂O pendant 5 min, utilisez un stylo histochimique pour encercler la zone de l’échantillon et placez-les dans une boîte sombre.
2. Récupération de l’antigène : Déposer 20 à 50 μL de trypsine à 0,25 % dans la zone encerclée de l’échantillon, incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 60 min, puis laver les échantillons 3 fois pendant 2 min chacun avec du PBS. Bloquez la peroxydase endogène en ajoutant 3 % de H 2 O 2, incubez les échantillons pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité, puis lavez-les 3 fois pendant₂min chacun avec du PBS. Effectuer un blocage du sérum en ajoutant 10 % de sérum de chèvre à température ambiante pendant 20 minutes, puis incuber avec l’anticorps primaire (collagène anti-souris de type II, dilué 1 000 fois) à 4 °C pendant la nuit.
3. Jour 2 : Réchauffez les sections à température ambiante pendant 30 min. Récupérez l’anticorps primaire et lavez les coupes 3x pendant 2 min chacune avec du PBS. Incuber avec l’anticorps secondaire pendant 40 min dans un incubateur à 37 °C, puis laver les coupes 3x pendant 2 min chacune avec du PBS.
4. Développement de la couleur DAB : Ajouter 5 mL de ddH 2 O, deux gouttes de tampon, quatre gouttes de DAB et deux gouttes deH 2 O₂pour préparer le réactif DAB. Ajouter 20 à 50 μL de réactif dans les sections, garder les échantillons à l’abri de la lumière pendant 5 min, puis laver les sections pendant 2 min avec ddH₂O.
5. Après avoir trempé avec de l’hématoxyline pendant 1 min, lavez les sections avec du ddH₂O jusqu’à ce qu’elles deviennent incolores. Faire tremper les sections dans une solution de différenciation à l’éthanol acide à 1 % pendant 30 s et les laver 3 fois pendant 1 min chacune avec du ddH 2 O. Teindre les sections pendant 1 min avec une solution d’ammoniac à 1 %, puis les laver 3 fois pendant 1 minchacune avec du ddH₂O.
6. Ensuite, placez les sections dans de l’éthanol à 95 % et de l’éthanol à 100 %, respectivement, pendant 1 min chacune. Enfin, incubez les sections pendant 1 min avec du xylène IV. Séchez les sections à l’air libre, collez une goutte de résine neutre sur les échantillons sur les lames et recouvrez-les d’une lamelle. Ensuite, prenez des images avec un microscope à fluorescence vertical en fond clair à 5x et 20x.

L’analyse statistique des données de corrélation a été réalisée à l’aide d’outils d’analyse statistique en ligne. Les données qui répondaient aux deux critères de la distribution normale et de l’homogénéité de la variance ont été utilisées pour une analyse statistique plus poussée par analyse de variance à un facteur. Si les données ne répondaient pas aux deux tests, le test de Kruskal-Wallis a été utilisé pour l’analyse statistique. Les données sont exprimées sous la forme de la moyenne ±écart-type (ET), et p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Test de la poutre d’équilibre
L’analyse statistique du temps moyen nécessaire à chaque souris pour passer deux fois à travers le faisceau d’équilibre à chaque étape a montré qu’il n’y avait pas de différences statistiques dans le temps nécessaire à chaque groupe de souris pour passer le faisceau d’équilibre avant l’intervention chirurgicale (p = 0,73). Trois jours après l’opération, les souris des groupes CL + ATFL et CL + DL ont eu besoin d’un temps plus long pour passer à travers la poutre d’équilibre par rapport aux souris du groupe simulé, et la différence était statistiquement significative (p < 0,05). Quatre semaines après l’opération, aucune différence significative n’a été observée dans le temps nécessaire aux souris des groupes CL + ATFL et CL + DL pour passer la poutre d’équilibre par rapport aux souris du groupe simulé (p > 0,05). De plus, 8 semaines et 12 semaines après la chirurgie, les souris des groupes CL + ATFL et CL + DL ont eu besoin de plus de temps pour passer la poutre d’équilibre que les souris du groupe simulé, et la différence était statistiquement significative (p < 0,01). Aucune différence statistiquement significative n’a été observée dans le temps mis par les souris du groupe CL + ATFL pour passer la poutre d’équilibre par rapport aux souris du groupe CL + DL au cours de chaque période d’essai (p > 0,05 ; Graphique 1A).

Le nombre de fois où l’arrière-pied droit de la souris a glissé à travers la poutre d’équilibre n’était pas statistiquement différent entre les trois groupes de souris avant la chirurgie (p = 0,68). De plus, aucune différence significative n’a été observée dans le nombre de sections de l’arrière-pied droit pour les souris des groupes CL + ATFL et CL + DL par rapport aux souris du groupe simulé 3 jours après la chirurgie. En ce qui concerne les autres points de temps postopératoires, le nombre de sections dans le groupe de transsection ligamentaire était plus élevé que celui des souris dans le groupe simulé, et la différence était statistiquement significative (p < 0,05). À 8 semaines et 12 semaines après la chirurgie, le nombre de fois où l’arrière-pied droit du groupe CL + ATFL a glissé hors de la poutre d’équilibre était plus élevé que celui des souris du groupe CL + DL, et la différence était statistiquement significative (p < 0,05 ; Graphique 1B).

Analyse de l’empreinte
La longueur de la foulée des souris de chaque groupe augmentait avec l’âge, mais la section des ligaments pouvait raccourcir la longueur de la foulée. Aucune différence significative n’a été observée dans la longueur du pas de l’arrière-pied droit entre les trois groupes de souris avant la chirurgie (p > 0,05). Dans le test de marche 12 semaines après la chirurgie, la longueur de pas de l’arrière-pied droit dans le groupe de coupure ligamentaire était plus courte que dans le groupe simulé à la même période, et la différence était statistiquement significative (p < 0,01). Cependant, la longueur de foulée de l’arrière-pied droit des souris du groupe CL + ATFL n’était pas significativement différente de celle des souris du groupe CL + DL (p > 0,05 ; Graphique 2A et B).

Évaluation de la nociception thermique
L’analyse statistique du temps de réponse thermique à la nociception des pieds des souris pendant l’activité a montré qu’il n’y avait pas de différences statistiques dans les temps de réaction des trois groupes de souris avant la chirurgie (p > 0,5). Dans l’évaluation de la nociception thermique après la chirurgie, les temps de réponse de la nociception thermique des souris du groupe de coupure ligamentaire étaient plus longs que ceux des souris du groupe simulé au cours de la même période, et la différence était statistiquement significative (p < 0,01 ; Graphique 3).

Micro-tomodensitométrie
Douze semaines après la chirurgie, la micro-tomodensitométrie a été utilisée pour analyser quantitativement l’ASCJ de l’arrière-pied droit pour les souris de chaque groupe. La reconstruction tridimensionnelle des images tomodensitométriques a montré que l’ASCJ de l’arrière-pied droit dans les deux groupes avec des ligaments sectionnés était plus rugueux que dans le groupe simulé. La surface articulaire était concave, convexe et plate, il y avait des marques d’usure évidentes, des ostéophytes étaient générés autour des articulations et les articulations présentaient des changements dégénératifs. De plus, environ 28,6 % des souris du groupe CL + DL ont développé une luxation de l’éboulis (Figure 4A,B)10. La fraction volumique osseuse de l’ASCJ de l’arrière-pied droit dans les groupes CL + ATFL et CL + DL était significativement plus élevée que dans le groupe simulé, et la différence était statistiquement significative (p < 0,01 ; Graphique 4C,D)10.

Coloration en coupe du cartilage articulaire
La coloration verte H&E et Safranin O-fast a montré que la structure de l’ASCJ des souris du groupe simulé était complète, que la morphologie du cartilage était intacte et que les chondrocytes étaient uniformément répartis. La couche cartilagineuse de l’ASCJ des deux groupes de souris présentant des coupures ligamentaires a montré une discontinuité évidente et le nombre de chondrocytes a diminué (Figure 5A,B)10. Le système de notation modifié de la Mankin and Osteoarthritis Research Society International (OARSI) a été utilisé pour évaluer la coloration verte H&E et Safranin O-fast de l’ASCJ pour les souris de chaque groupe20,21,22. Le score de Mankin modifié a été déterminé par les caractéristiques structurelles du cartilage et le nombre et la coloration des chondrocytes, et le score OARSI a été déterminé par le grade histopathologique et le stade du cartilage. Les scores des deux groupes de souris ayant subi une amputation ligamentaire étaient plus élevés que ceux des souris du groupe simulé, et la différence était statistiquement significative (p < 0,05 ; Graphique 5C-F)10.

Les images de la coloration immunohistochimique typique du collagène de type II ont montré que la teneur en collagène de type II dans la couche de cartilage articulaire ASCJ de l’arrière-pied droit dans le groupe simulé était plus uniforme que celle des deux groupes de souris avec des ligaments sectionnés, et il n’y avait pas de perte évidente de collagène de type II (Figure 6A). Les résultats de l’analyse quantitative ont montré que l’expression du collagène de type II dans l’ASCJ des souris du groupe simulé était plus élevée que celle des deux groupes de souris avec des ligaments sectionnés, et la différence était statistiquement significative (p < 0,05 ; Graphique 6B et C).

Figure 1 : Analyse comportementale des souris à l’aide du test de la poutre d’équilibre. (A) Temps nécessaire aux souris pour traverser la poutre d’équilibre. (B) Le nombre de glissements du pied droit lors de la traversée de la poutre d’équilibre. Les données représentent la moyenne ±écart-type, n = 7 échantillons par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse comportementale des souris à l’aide de l’analyse de l’empreinte. (A) Comparaison de la longueur du pas droit pour les souris de chaque groupe avant la chirurgie. (B) Comparaison de la longueur du pas droit pour les souris de chaque groupe 12 semaines après la chirurgie. Les différences statistiquement significatives sont indiquées par **, où p < 0,01, et ***, où p < 0,001 entre les groupes indiqués. Les données représentent la moyenne ±écart-type, n = 7 échantillons par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse comportementale des souris à l’aide de l’évaluation de la nociception thermique. Temps de réponse de la nociception thermique pendant l’activité chez la souris. Les données représentent la moyenne ±écart-type, n = 7 échantillons par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse micro-tomodensitométrique du pied droit d’une souris. (A) Reconstruction tridimensionnelle du talus de souris sans luxation dans le complexe articulation cheville-sous-talienne (vue latérale, vue médiale, vue antérieure). (B) Reconstruction tridimensionnelle du talus de souris disloqué dans le complexe articulation cheville-sous-talienne (vue latérale, vue médiale, vue antérieure). (C) Analyse quantitative de la fraction volumique osseuse (BV/TV) des articulations de la cheville de souris. (D) Analyse quantitative de la fraction volumique osseuse (BV/TV) des articulations sous-taliennes de souris. Les flèches noires indiquent la formation d’ostéophytes ou la luxation d’éboulis. Les différences statistiquement significatives sont indiquées par ***, où p < 0,001 entre les groupes indiqués. Ce chiffre a été modifié à partir de Liu et al.10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Coloration verte H&E et Safranin O-fast et analyse des articulations de la cheville. (A) Coloration H&E des articulations sous-taliennes de la cheville de souris. (B) Coloration O-rapide de la safranine des articulations sous-taliennes de la cheville de la souris. (C) Scores de Mankin modifiés pour les articulations de la cheville de la souris. (D) Scores de Mankin modifiés pour les articulations sous-taliennes de la souris. (E) Scores de l’Osteoarthritis Research Society International (OARSI) pour les articulations de la cheville chez la souris. (F) Scores OARSI pour les articulations sous-taliennes de la souris. Symboles : a = articulation de la cheville ; s = articulation sous-talienne. Les différences statistiquement significatives sont indiquées par ***, où p < 0,001 entre les groupes indiqués. Barre d’échelle = 100 μm, n = 7 échantillons par groupe. Ce chiffre a été modifié à partir de Liu et al.10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Coloration immunohistochimique et analyse des articulations de la cheville. (A) Coloration immunohistochimique du collagène de type II de la cheville et des articulations sous-taliennes de la souris. (B) Pourcentage de rapport de surface de collagène II (+) pour les articulations de la cheville de la souris. (C) Pourcentage de rapport de surface de collagène II (+) pour les articulations sous-taliennes de la souris. Symboles : a = articulation de la cheville ; s = articulation sous-talienne. Les différences statistiquement significatives sont indiquées par ***, où p < 0,001 entre les groupes indiqués. Barre d’échelle = 100 μm, n = 7 échantillons par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Aucun des auteurs n’a d’intérêts divergents.