Vitesse de sédimentation des érythrocytes: une caractérisation basée sur la physique dans un contexte médical

La vitesse de sédimentation érythrocytaire (VS) est un outil clinique médical in vitro, formellement introduit dans la médecine fondée sur les preuves au cours du XXe siècle 1,2,3,4. Il est actuellement utilisé dans le monde entier comme test inflammatoire non spécifique, ou pour surveiller l’évolution de certaines conditions spécifiques 5,6,7,8. Ceci est principalement dû à une augmentation de la concentration en fibrinogène, mais aussi à d’autres composants plasmatiques tels que les IgM 1,9,10,11. Selon le protocole standard actuel de Westergren, les valeurs ESR sont rapportées comme la mesure de la couche de plasma acellulaire à un point de temps donné (30 min ou 1 h) après avoir laissé un tube vertical d’une taille typique de 20 cm verticalement au repos¹². Cependant, cette méthode de mesure a été critiquée car qualitativement différentes étapes du processus de sédimentation ont été rapportées, y compris un délai avant d’atteindre la vitesse maximale de décantation¹³. Ce délai dure plus de 1 h dans environ la moitié des échantillons sains¹⁴. La vitesse au cours de cette phase obéit à une échelle différente de celle de la seconde phase, plus rapide, de la sédimentation¹⁵. En limitant la lecture à la vitesse moyenne de décantation au cours de la première heure, on compare ensuite un mélange différent de diverses propriétés sanguines entre différents individus.

De plus, il a été récemment démontré que les considérations théoriques habituelles derrière ce protocole étaient erronées^16,17,18. À l’hématocrite physiologique (au-dessus d’environ 25%), les globules rouges (GR) ne sédimentent pas sous forme d’agrégats séparés, mais plutôt sous la forme d’un réseau continu, dit percolant, de globules rouges 17,18, obéissant à un ensemble d’équations physiques différent de la sédimentation de Stokes ^16,17 habituellement mentionnée. Il a été démontré que la prise en compte d’une description physique basée sur les mesures résolues dans le temps de la sédimentation (courbe entière) était plus robuste dans certains contextes médicaux nouveaux^19,20. De plus, ces mesures pourraient être utilisées pour faire la lumière sur les mécanismes physiques altérant la VS dans les pathologies dans lesquelles les formes cellulaires sont altérées^19,20. De plus, une VS lente peut avoir une interprétation médicale utile, comme indiqué dans les mesures d’une cohorte de patients atteints du syndrome de neuroacanthocytose^19,20. Cet article examine comment implémenter concrètement la mesure de paramètres physiquement significatifs, basée sur l’ensemble de la cinétique ESR. Plus précisément, la méthode présentée ici extrait la vitesse maximale de sédimentation U_m, dont la valeur peut être corrigée pour considérer l’effet de l’hématocrite du donneur^16,17. Ce paramètre est plus précis et donc plus fiable que la mesure traditionnelle^16,17,19,20.

De plus, dans certaines recherches fondamentales, au lieu de surveiller l’état inflammatoire d’un patient donné, il est intéressant d’exclure l’effet de l’hématocrite sur la VS 21,22,23, ou d’étudier le rôle des globules rouges dans une VS modifiée 19,20,24,25 entre différents donateurs. Il peut être utile de comparer les échantillons qui ne sont pas directement des échantillons de sang complets de patients. Par conséquent, la remise en suspension des globules rouges avec un hématocrite contrôlé dans le plasma autologue, ou dans un substituant plasmatique, pourrait être utilisée comme première étape de la mesure de la VS. Par exemple, les solutions de Dextran 70 kDa avec une concentration de 55 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) produisent une plage de sédimentation dans la plage de contrôle pour les cellules saines¹⁹. Ce manuscrit montre également comment de telles étapes devraient être menées, et que l’analyse présentée est également pertinente dans ces cas.

Le prélèvement d’échantillons de sang et les expériences ont été approuvés par l’Ärztekammer des Saarlandes, éthique votum 51/18, et effectués après avoir obtenu le consentement éclairé conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les mesures standard doivent être effectuées avec du sang anticoagulé à l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (concentration standard d’EDTA de 1,6 mg/mL de sang, norme européenne NF EN ISO 6710), dans des tubes Westergren. Le volume nécessaire pour remplir le tube Westergren dépend du fabricant (car les parties inférieures contiennent parfois un réservoir plus large); Le volume devrait être d’environ 1 mL de sang total et de 800 μL pour les tubes indiqués dans le tableau des matériaux. La méthode décrite ci-dessous est toutefois valable quelle que soit la suspension spécifique et la forme du récipient, tant que l’hématocrite des échantillons sondés est supérieur à 25. Les volumes, les contenants, le milieu de suspension et les additifs doivent donc être choisis en fonction des objectifs spécifiques de la recherche effectuée.

1. Expériences et mesures

REMARQUE : Notez la vitesse de sédimentation de l’échantillon toutes les minutes.

1. Préparation de l’échantillon (si nécessaire): Si un hématocrite témoin ou un liquide en suspension est nécessaire, commencez par laver les cellules et préparer les échantillons (à titre d’exemple, nous montrons comment préparer des échantillons avec différents niveaux de fibrinogène, en mélangeant du sérum autologue et du plasma). Le sérum peut en effet être approximé sous forme de plasma sans fibrinogène^26,27, et peut être utilisé afin de diminuer l’agrégation des globules rouges^, dans des conditions physiologiques différentes. Afin de préparer plusieurs échantillons, prélever le sang dans des tubes EDTA standard de 9 mL et le sérum dans des tubes de sérum standard (avec des billes de silice comme activateurs de coagulation) de 9 mL.
   1. Centrifuger les échantillons de sang (c.-à-d. 9 mL d’EDTA standard et de tubes de sérum dans l’exemple choisi) à 3 000 x g pendant au moins 7 minutes, pour un compactage optimal des érythrocytes emballés. Remplacer le surnageant par du PBS ou le liquide de suspension souhaité, si une quantité suffisante est disponible. S’il est simplement nécessaire de contrôler l’hématocrite dans le plasma autologue, passez directement à l’étape 1.1.3. Sinon, mélanger délicatement après inclusion du surnageant pour le lavage.
   2. Répétez trois fois. Effectuez le dernier lavage avec le liquide de suspension souhaité dans tous les cas.
      1. Dans l’exemple choisi, préparer des mélanges de plasma et de sérum autologues avec des proportions déterminées (p. ex., 25 %/75 %, 50 %/50 % ou 75 %/25 % de la fraction volumique plasma-sérum). Par exemple, lors de la préparation de 2,5 mL du mélange plasma-sérum à 25 %/75 %, ajouter 0,625 mL de plasma à 1,875 mL de sérum.
   3. Extraire le volume requis de cellules emballées et le suspendre dans le liquide désiré. Traiter les cellules emballées comme un liquide très visqueux (à l’aide d’un prépipetage et/ou d’un pipetage inversé standard ou d’une pipette volumétrique²⁸). Dans l’exemple choisi, pour un échantillon de 4 mL à un hématocrite de 45 %, suspendre 1,8 mL de cellules emballées à moins de 2,2 mL du mélange plasma-sérum.
2. Si l’hématocrite de l’échantillon n’est pas contrôlé, déterminez-le par microcentrifugation à grande vitesse (d’autres méthodes standard conviennent également).
   1. Extraire la quantité requise d’échantillon pour la détermination de l’hématocrite : remplir les capillaires micro-hématocrites en immergeant son extrémité inférieure dans le liquide. Arrêtez-le en couvrant l’ouverture supérieure lorsque la quantité requise d’échantillon monte dans le tube par aspiration capillaire.
   2. Scellez les capillaires avec de la cire à cacheter. Placez-les dans la centrifugeuse micro-hématocrite et faites-la fonctionner à 15 000 x g (12 000 tr/min) pendant 5 min, ou selon les instructions du fabricant.
   3. Lisez le niveau d’hématocrite sur le capillaire et écrivez-le pour référence.
3. Installez une caméra pour enregistrer la sédimentation des échantillons. Pour éviter de surcharger la mémoire ou de vider la batterie, alimentez l’appareil à partir du secteur et enregistrez les images directement sur un ordinateur ou un disque dur externe.
   1. Installez une caméra stable devant le support où les tubes ESR seront laissés au repos. Utilisez un fond blanc et éclairé (les feuilles de papier blanches en arrière-plan fonctionnent parfaitement).
   2. À l’aide de tubes Westergren vides, de préférence sans marquages, réglez la mise au point et le champ de vision de la caméra pour obtenir la résolution la plus élevée où les échantillons seront placés. De préférence, assurez-vous que les bordures des images sont alignées dans le sens vertical et horizontal.
   3. Prenez une photo d’un tube à l’échelle pour extraire la résolution en pixels. L’utilisation d’images RVB est recommandée.
   4. Réglez la lumière et le temps d’exposition de l’appareil photo pour qu’ils aient un fond blanc, mais pas de saturation. L’exemple de la Figure 1 a été obtenu à l’aide d’un Canon EOS M50, avec un temps d’exposition de 1/15s, une ouverture de F8.0, une balance des blancs au tungstène, en mode prise de vue unique avec mise au point manuelle et une vitesse ISO de 1 000.
4. Préparez et placez les tubes ESR.
   1. Remplissez le récipient inférieur du tube Westergren avec le volume correspondant aux instructions du fabricant. Insérez le tube Westergren dans le récipient inférieur comme indiqué par le fabricant.
   2. Dès que le premier tube est prêt, placez-le dans le support et démarrez l’enregistrement de la caméra. L’enregistrement d’une image toutes les minutes donne généralement une bonne résolution de la courbe cinétique ESR.
   3. Préparez et placez les échantillons suivants. Assurez-vous de ne pas vous tenir devant un échantillon lorsqu’une photo est prise.
   4. Laissez les mesures fonctionner pendant au moins 2 h, afin de comparer avec les mesures standard à 30 min, 1 h et 2 h. Cependant, il est également préférable de voir la saturation et l’arrêt de la sédimentation. Pour les échantillons sains, ou en cas d’inflammation, l’enregistrement des échantillons pendant la nuit, entre 12 h et 24 h, est plus que suffisant puisque la courbure des échantillons les plus rapides est visible dans les 3 h^13,19. Toutefois, si une condition diminue la vitesse de sédimentation, comme le fait une diminution de la concentration de fibrinogène (c.-à-d. dans l’exemple choisi, fraction volumique sérique élevée), des enregistrements de 50 heures ou plus peuvent être nécessaires pour obtenir l’information la plus précise^16,19.

2. Analyse d’images

REMARQUE: Une fois les images enregistrées, extrayez la courbe ESR. Un exemple de code Matlab est fourni en tant que fichier supplémentaire 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

1. Sélectionner ou identifier une région d’intérêt (ROI) où un seul tube est visible, la bordure inférieure étant située sous la position la plus basse de l’interface plasma acellulaire érythrocytaire, mais à l’intérieur de l’échantillon (voir Figure 1A, B). Si nécessaire, faites pivoter l’image de sorte que la direction verticale soit alignée le long de la première composante de l’image.
2. Convertissez le retour sur investissement de l’image RVB en une image en niveaux de gris ou une matrice Gr. Habituellement, la combinaison des canaux tricolores (rouge [R], vert [G] et bleu [B]) comme Gr = 2 * R - B - G est très efficace avec un arrière-plan clair (voir Figure 1C et MatlabCodeImageAnalysisSampled.m lignes 121-128).
3. Binariser l’image. Pour un échantillon sain, l’utilisation du seuil Otsu²⁹ donne généralement un résultat cohérent (voir la figure 1D et la ligne 133 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Pour les échantillons avec un hématocrite élevé ou avec une certaine hémolyse, il peut être préférable de l’ajuster manuellement ou d’utiliser une autre méthode automatique (comme dans les lignes 129-131 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), en fonction du contraste exact obtenu entre les différentes phases à l’intérieur du tube.
4. Obtenir la moyenne des valeurs de pixels (ou d’éléments) de Gr le long de la direction horizontale. Cette étape minimise le bruit et calcule efficacement la moyenne des irrégularités d’interface possibles (voir Figure 1E et MatlabCodeImageAnalysisSampled.m ligne 137).
5. Avant de calculer les variations, lisser la courbe avec une moyenne mobile, surtout si les tubes contiennent des marques horizontales (voir figure 1F). Pour les exemples fournis, une fenêtre mobile de ~2,5 mm (50 pixels) a été utilisée pour ce processus (voir la ligne 138 de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Ensuite, identifiez la position de l’interface comme le point avec la variation d’intensité la plus élevée (voir Figure 1G).
6. Répétez l’opération pour chaque image et chaque échantillon. Pour chaque exemple, enregistrez les positions de l’interface dans un format approprié pour adapter le modèle physique à tout logiciel adapté.

3. Ajustement du modèle physique

1. En utilisant n’importe quel logiciel convenablement adapté, connaissant l’hématocrite et la hauteur initiale de la colonne sanguine h 0, trouvez les valeurs du temps de retard t₀, du temps sans dimension γ et de la fraction volumique finale emballée Φ_mdes érythrocytes qui minimise la somme des écarts résiduels au carré pour le modèle physique¹⁷. Un code Matlab (ShapeAnalyzerIntegrated.m) est fourni en tant que fichier supplémentaire 2 à titre d’exemple de la façon d’effectuer un tel ajustement. Voir le dossier supplémentaire 2 pour plus d’instructions. Comme décrit ailleurs^16,17, les érythrocytes au niveau des sédiments physiologiques de l’hématocrite sous forme de gel de particules molles, où les paramètres physiques importants sont la différence de densité entre le plasma et les globules rouges du donneur Δρ, le diamètre caractéristique des globules rouges r_GR^, la viscosité plasmatique à température ambiante η et l’hématocrite Φ du donneur . En utilisant ces paramètres, et en supposant que la contrainte gravitationnelle est le principal processus d’entraînement pour que le plasma s’écoule vers le haut à travers le réseau poreux formé par les érythrocytes après un temps de retard t 0, on obtient l’évolution temporelle^16,17:
   
   avec , et étant le rayon moyen du disque d’un érythrocyte. Un exemple de code Matlab effectuant cette opération est fourni en pièce jointe (ShapeAnalyzerIntegrated.m correspond à la fonction définie dans SedimFit.m [Fichier supplémentaire 3]). Alternativement, G/γ peut également être utilisé directement comme paramètre d’ajustement avec des unités de 1/t.
2. Une fois la courbe quantitative extraite de l’image, enregistrez les paramètres physiques de l’échantillon. Les valeurs ESR traditionnelles à 30 min, 1 h ou 2 h peuvent encore être extraites de la courbe pour référence (voir ShapeAnalyzerIntegrated.m lignes 123-132).

Un exemple de séquence d’images correctement acquise est fourni en tant que film supplémentaire 1 (MovieS1.avi). Une série d’ajustements caractéristiques du modèle est illustrée pour diverses conditions à la figure 2. La concentration de fibrinogène a été déterminée à partir de la concentration de fibrinogène dans le Fib0 plasmatique, en supposant que le sérum ne contient aucun fibrinogène. Par conséquent, Fib = C Fib0, où C est la fraction volumique plasmatique dans le mélange plasma-sérum. Dans des études antérieures16, Fib0 a été déterminé par des méthodes standard dans le laboratoire de chimie clinique de l’hôpital universitaire de la Sarre (Homburg, Allemagne). S’il est nécessaire de mesurer une telle quantité indépendamment, une méthode pratique pour déterminer la concentration en fibrinogène comprend des coagulomètres à bille (semi-)automatisés, ce qui peut également nécessiter l’obtention d’un échantillon de sang anticoagulé au citrate du donneur30. Les courbes ESR des études qui ont généré ces courbes ont pu être ajustées avec un coefficient de Pearson R2 [0,974, 0,9996], avec une moyenne de 0,996 et un écart-type de 0,004 (une seule courbe sur 35 a donné un R2 < 0,99). Les paramètres finalement extraits sont l’hématocrite final dans la phase Φm de globules rouges, le temps de retard t0 nécessaire pour que le gel se fracture et commence à s’affaisser et la vitesse instantanée maximale, atteinte au début de l’effondrement. Le paramètre sans dimension γ est associé à l’inverse de la zone des pores dans le réseau de compactage des globules rouges (exprimé en multiples de rayon de particules), Δρ est la différence de densité entre le plasma et les globules rouges du donneur, a est le diamètre caractéristique des globules rouges, η est la viscosité du plasma à température ambiante et Φ est l’hématocrite du donneur. L’ajustement est en fait effectué en fixant Δρ, a, η et Φ, puis en déterminant les meilleurs γ, Φ m et t0. L’hématocrite doit être déterminé indépendamment par une autre méthode étalon, tandis que l’autre peut être fixée à des valeurs standard (Δρ80kg/m3 31,32, η 1,5 mPa s 33 et 4μm). Tout écart des autres paramètres modifierait simplement la valeur déterminée de γ d’un facteur correspondant, mais ne changerait pas la détermination finale de Um, qui est alors un paramètre robuste à cet égard.

Les collections de valeurs de paramètres recueillies dans les études fondamentales précédentes, montrant les tendances des paramètres en fonction des taux d’hématocrite et de fibrinogène, sont présentées à la figure 3 et à la figure 4.

Figure 1 : Traitement de l’image. (A) Vue idéale de plusieurs échantillons, avec des ROI pertinents, mis en évidence pour un échantillon. (B) Zoom sur le ROI sélectionné. (C) Conversion du ROI coloré en niveau de gris. (D) Image binarisée obtenue avec le seuil Otsu. (E) L’intensité moyenne horizontale de l’image binaire en fonction de la hauteur (selon la convention habituelle en traitement d’image, l’origine est considérée comme étant en haut de l’image; voir aussi l’étape 2.4 du protocole.) (F) Intensité lissée en effectuant une moyenne mobile sur un voisinage vertical de 50 pixels (voir également l’étape 2.5 du protocole). (G) Variations de l’intensité lissée le long de la direction verticale. La position de la valeur maximale absolue est prise comme position de l’interface (voir également l’étape 2.5 du protocole). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Ajustements caractéristiques. (A) Courbes et ajustements obtenus pour un donneur sain, avec divers hématocrites ajustés. Les courbes sont adaptées d’une étude précédente17. (B) Courbes et ajustements obtenus pour un donneur sain, avec diverses concentrations de fibrinogène. Diverses concentrations de fibrinogène ont été obtenues en mélangeant du plasma autologue et du sérum dans diverses proportions. Les courbes et les données proviennent d’une étude précédente16. Les barres d’erreur (obtenues à partir de la résolution en pixels ou des statistiques d’ajustement) sont plus petites que la taille du symbole. Les chiffres ont été réimprimés avec la permission de Dasanna et al.16 (18 échantillons provenant de quatre prises de sang indépendantes) et de Darras et al.17 (16 échantillons provenant de sept prises de sang indépendantes). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Valeurs caractéristiques des paramètres extraits pour divers hématocrites. (A) Variation de la vitesse maximale de sédimentation Umextraite en fonction de l’hématocrite de l’échantillon Φ. Les cercles sont des mesures individuelles; Différentes couleurs sont liées à différents donneurs sains. La ligne rouge continue est la tendance prédite par le modèle, obtenue avec les valeurs moyennes de Φm et γ. La valeur corrigée de Umpour un hématocrite de Φ = 0,45 est également montrée, à la fois sous forme de triangles pour les valeurs individuelles et de droite pour la constante prédite du modèle. Cette valeur corrigée a été calculée selon le modèle comme suit : . (B) Valeurs obtenues pour le paramètre γ. (C) Valeurs obtenues pour le paramètre Φm. (D) Valeurs obtenues pour le paramètre t0. Les barres d’erreur pour les données individuelles obtenues à partir des statistiques d’ajustement sont plus petites que la taille du symbole. Cette figure a été adaptée avec la permission de Darras et al.17. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Valeurs caractéristiques des paramètres extraits pour diverses concentrations en fibrinogène . (A) Variation de la vitesse maximale de sédimentation Umextraite en fonction de la concentration en fibrinogène de l’échantillon. Différentes couleurs sont liées à différents donneurs sains. (B) Valeurs obtenues pour le paramètre γ. (C) Valeurs obtenues pour le paramètre Φm. (D) Valeurs obtenues pour le paramètre t0. Les barres d’erreur pour les données individuelles obtenues à partir des statistiques d’ajustement sont plus petites que la taille du symbole. Cette figure a été reproduite avec la permission de Dasanna et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Film supplémentaire 1 : Exemple d’une séquence d’images correctement acquise. Différents types d’échantillons sont montrés sur ces images provenant de deux donneurs différents (même groupe sanguin). De gauche à droite, tous les échantillons présentant des doublons : sang complet du donneur 1, suspension des globules rouges du donneur 1 dans Dextran 70 kDa (55 mg/mL PBS) avec hématocrite contrôlé à 45 %, sang complet du donneur 2, suspension des globules rouges du donneur 2 dans Dextran (hématocrite à 45 %), suspension des globules rouges du donneur 1 dans le plasma du donneur 2 (hématocrite à 45 %), et suspension des globules rouges du donneur 2 dans le plasma du donneur 1 (hématocrite à 45 %). Les échantillons ont une large gamme de vitesses de sédimentation, et les suspensions dans Dextran montrent également une certaine hémolyse. Cependant, le code fourni MatlabCodeImageAnalysisSampled.m les analyse tous efficacement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Fichier supplémentaire 1 : MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. Code principal utilisé pour l’analyse d’image (étape 2 du protocole). Pour exécuter le code sur un périphérique spécifique, la ligne 8 doit être modifiée. Il doit contenir le chemin d’accès au dossier contenant les images des tubes de Westergren à analyser, se terminant par le préfixe des images, le cas échéant. Un ensemble d’images compressées est disponible en téléchargement libre sur Zenodo (DOI: 10.5281 / zenodo.7290177). Le code, et en particulier les propriétés de chaque échantillon (définies aux lignes 14-61), a déjà été adapté pour analyser ces images. Pour cet ensemble d’images, le préfixe utilisé était « IMG_ ». Par conséquent, la ligne de chaîne 8 doit se terminer par '\IMG_' (ou '/IMG_' sur les systèmes Linux). La dernière partie du code (lignes 166-179) trace également automatiquement les courbes de sédimentation extraites pour chaque échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : ShapeAnalyzerIntegrated.m. Code principal utilisé pour s’adapter au modèle physique (étape 3 du protocole). Pour exécuter ce code, copiez-le et collez-le simplement dans le dossier contenant les fichiers texte de sortie de MatlabCodeImageAnalysisSampled.m, avec SedimFit.m. Les noms des fichiers à analyser (sans l’extension .txt) doivent être répertoriés à la ligne 9. L’hématocrite initial et la hauteur du tube doivent également être contenus dans les lignes 12 et 15, respectivement. Ce code est déjà préparé pour analyser les courbes extraites des images en libre accès sur Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Une fois les codes de ligne susmentionnés modifiés, cliquez simplement sur le bouton 'Exécuter' dans la barre d’outils Matlab Editor. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : SedimFit.m. Modèle physique ajusté par ShapeAnalyzerIntegrated.m. Ce fichier est une fonction Matlab, définissant les fonctions qui sont ajustées aux courbes expérimentales pour extraire les paramètres physiques. Il doit se trouver dans le même dossier que ShapeAnalyzerIntegrated.m lors de l’exécution de l’analyse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer pertinent pour le contenu de cet article.