Le présent protocole décrit l’établissement d’un système organoïde du côlon murin pour étudier l’activité et le fonctionnement des cellules souches du côlon dans un modèle knockout claudin-7.
Article de méthode
Le présent protocole décrit l’établissement d’un système organoïde du côlon murin pour étudier l’activité et le fonctionnement des cellules souches du côlon dans un modèle knockout claudin-7.
L’épithélium intestinal se régénère tous les 5 à 7 jours et est contrôlé par la population de cellules souches épithéliales intestinales (IESC) située au fond de la région de la crypte. Les CSEI comprennent les cellules souches actives, qui s’auto-renouvellent et se différencient en divers types de cellules épithéliales, et les cellules souches quiescentes, qui servent de cellules souches de réserve en cas de blessure. La régénération de l’épithélium intestinal est contrôlée par les capacités d’auto-renouvellement et de différenciation de ces IESC actifs. De plus, l’équilibre de la population de cellules souches cryptiques et le maintien de la niche des cellules souches sont essentiels à la régénération intestinale. La culture organoïde est une approche importante et attrayante pour étudier les protéines, les molécules de signalisation et les signaux environnementaux qui régulent la survie et les fonctions des cellules souches. Ce modèle est moins cher, moins long et plus manipulable que les modèles animaux. Les organoïdes imitent également le microenvironnement tissulaire, fournissant une pertinence in vivo . Le présent protocole décrit l’isolement des cryptes du côlon, l’intégration de ces cellules cryptiques isolées dans un système de matrice de gel tridimensionnel et la culture de cellules cryptiques pour former des organoïdes du côlon capables d’auto-organisation, de prolifération, d’auto-renouvellement et de différenciation. Ce modèle permet de manipuler l’environnement - éliminer des protéines spécifiques telles que la claudine 7, activer / désactiver les voies de signalisation, etc. - pour étudier comment ces effets influencent le fonctionnement des cellules souches du côlon. Plus précisément, le rôle de la protéine de jonction serrée claudin-7 dans la fonction des cellules souches du côlon a été examiné. Claudin-7 est vital pour maintenir l’homéostasie intestinale et la fonction et l’intégrité de la barrière. L’élimination de la claudine-7 chez la souris induit un phénotype semblable à une maladie inflammatoire de l’intestin présentant une inflammation intestinale, une hyperplasie épithéliale, une perte de poids, des ulcérations des muqueuses, une desquamation des cellules épithéliales et des adénomes. Auparavant, il a été rapporté que la claudine-7 est nécessaire pour les fonctions des cellules souches épithéliales intestinales dans l’intestin grêle. Dans ce protocole, un système de culture organoïde du côlon est établi pour étudier le rôle de la claudine-7 dans le gros intestin.
La culture organoïde intestinale est un système ex vivo tridimensionnel (3D) dans lequel les cellules souches sont isolées des cryptes intestinales du tissu primaire et plaquées dans une matrice de gel 1,2. Ces cellules souches sont capables d’auto-renouvellement, d’auto-organisation et de fonctionnalité des organes2. Les organoïdes imitent le microenvironnement tissulaire et sont plus semblables aux modèles in vivo qu’aux modèles de culture cellulaire in vitro bidimensionnels (2D), bien que moins manipulables que les cellules 3,4<....
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Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été approuvées par le Comité de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Caroline de l’Est (ECU) et menées conformément aux directives des National Institutes of Health et de l’ECU sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Des souris knockout claudin-7 inductibles et intestinales spécifiques ont été générées en croisant des souris transgéniques claudin-7-flox C57BL6 avec des souris Villin-CreERT219. Des souris mâles et femelles âgées de 3 mois ont été utilisées dans cette étude.
1. Préparation du réactif/équipement
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Afin d’examiner les effets régulateurs de la claudine-7 sur les cellules souches du côlon, des cryptes du côlon ont été isolées à partir de tissu murin du côlon, comme décrit ci-dessus et illustré à la figure 1A. Une fois les cryptes isolées du tissu primaire, elles ont été plaquées dans une matrice 3D dans une plaque de 96 puits pour croître pendant 11 jours (Figure 1). Les cryptes saines normales fermeront la lumière et deviendront des sphéroïdes au jour 2 et .......
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La culture organoïde est un excellent modèle pour étudier la fonction des cellules souches, la physiologie intestinale, la découverte de médicaments, les maladies intestinales humaines et la régénération et la réparation des tissus 7,8,9,10,11,26. Bien qu’il présente de nombreux avantages, il peut être difficile à établir. De.......
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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Cette étude a été financée par NIH DK103166.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Dessiccateur sous vide peu encombrant de 0,09 pieds cubes ; | United States Plastic Corp | 78564 | chambre d’anesthésie |
| 0,5 M EDTA pH 8,0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1,5 mL microtubes à centrifuger | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL tubes à centrifuger coniques | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco' s Solution saline tamponnée au phosphate | Gibco | 14190-144 | |
| 2-méthylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4 % de paraformaldéhyde | ThermoFisher | J61899. | |
| 4-hydroxytamoxifène (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL tubes coniques à centrifuger | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µ ; m passoire cellulaire en nylon | Corning | 352350 | |
| 96 puits plaque de culture | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplément (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Albumine sérique bovine | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anticorps anti-murin de lapin | Immuno-Biological Laboratories ; | 18875 | |
| Verre de protection (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomoules | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R& D Systems | 3533-005-02 | matrice de gel |
| Cy3 anticorps anti-lapin | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Flacon Dewar | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose avec L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II avec DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| Kit de détection in situ de la mort cellulaire, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoïdes Dérivation et culture Core | N/A | |
| Kit chirurgical pour souris | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplément (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Température de coupe optimale (OCT) du composé ; | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Citrate de sodium | Fisher Scientific | S-279 | |
| Saccharose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Filtre à vide (0.22 µ ; m; acétate de cellulose) | Corning | 430769 | |
| chlorhydrate Y-27632 | Tocris Bioscience | 1254 |
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