MERK: Bruk sterilt kulturglass, pipettespisser og vekstmedium. Her ble E. coli-celler dyrket i et kjemisk definert medium med lav autofluorescens (se materialtabell). Inokulasjoner ble utført i nærvær av en Bunsen-brenner for å minimere risikoen for forurensning. 1. Cellekultur og vekstkurve Strek stammen av interesse fra en frossen glyserolbestand på en Luria-Bertaini (LB) agarplate (supplert med et selektivt antibiotika, om nødvendig), og inkuber ved 37 ° C over natten (mellom 15 timer og 19 timer) for å oppnå enkeltkolonier.MERK: Eksperimentet som presenteres her bruker to stammer, E. coli K-12 MG1655 som tilsvarer wt-stammen og den isogene MG1655 hupA-mCherry-stammen 22. Sistnevnte stamme uttrykker fluorescensmerket α-underenhet av HU-nukleoidassosiert protein. HupA-mCherry-reporteren er integrert på det opprinnelige stedet for hupA. HU-mCherry fungerer som en proxy for å følge nukleoiddynamikken i levende celler da den binder seg til DNA på en ikke-spesifikk måte. Inokuler 5 ml medium (her, 3-[N-morfolino] propansulfonsyrebasert medium [MOPS]; Tabell 1, tabell 2 og tabell 3) supplert med glukose 0,4 % og et selektivt antibiotikum (om nødvendig) med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og plasser røret i en ristende inkubator satt til 37 °C og 180 rotasjoner per minutt (rpm) over natten (mellom 15 timer og 19 timer). Alternativt kan plastrør, glass eller plastflasker (≥ 25 ml) brukes i stedet for glassrør.MERK: MOPS-medium supplert med glyserol ved en endelig konsentrasjon på 0,4% ble brukt gjennom eksperimentene beskrevet i denne artikkelen, bortsett fra nattens kulturer som ble utført i MOPS glukose 0,4%. Generasjonstiden for E. coli i MOPS supplert med glukose er kortere enn i MOPS glyserol. Bruk av MOPS-glukose 0,4 % i stedet for MOPS-glyserol 0,4 % på dette trinnet sikrer at cellene når den stasjonære fasen innen 19 timer. Andre vekstmedier, som M9 eller rikt definert medium (RDM) supplert med forskjellige karbonkilder, kan også brukes. Det skal imidlertid bemerkes at veksthastigheten og persistensfrekvensen er forskjellige avhengig av mediet og / eller karbonet som brukes23. Neste morgen, sentrifuge 1 ml kultur ved 2,300 x g i 3 minutter, kast supernatanten og resuspender pelleten forsiktig i samme volum fosfatbufret saltvann (PBS). Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD 600 nm), og beregne volumet som trengs for en innledende OD600 nm på 0,01 i et endelig volum på 2 ml. Plasser 2 ml MOPS glyserol 0,4% medium i en brønn med en klar bunnplate på 24 brønner, og inokuler med det beregnede dyrkningsvolumet over natten. Plasser 24-brønnsplaten i en automatisert mikroplateleser (se materialfortegnelse) for å overvåke OD600 nm i 24 timer. Still inn mikroplateleseren til å måle OD600 nm hvert 15. minutt ved en temperatur på 37 °C og med høy banerotasjon (140 o / min).MERK: Hvis stammen som brukes i forsøket koder for en fluorescerende reporter, må du sørge for at veksthastigheten er sammenlignbar med vekten for å unngå artefakt i de påfølgende forsøkene, da veksthastigheten påvirker antibiotikapersistensfrekvensen23. På grunn av deteksjonsbegrensninger ved svært lave celletettheter og potensielle belastningsspesifikke effekter på OD600 nm / kolonidannende enheter (CFU) -forholdet, anbefales det å evaluere vekstkinetikken ved å overvåke CFU·mL-1 ved arbeid med ukarakteriserte stammer. 2. Bestemmelse av den minimale hemmende konsentrasjonen av antibiotika MERK: Minste hemmende konsentrasjon (MIC) er definert som den laveste dosen antibiotika der ingen bakterievekst observeres. Bestemmelsen av MIC må utføres for hvert antibiotika og stamme. I forsøkene beskrevet her ble fluorokinolonantibiotikumet ofloxacin (OFX) brukt. Bestemmelsen av MIC tillater bekreftelse på at antibiotikaoppløsningen er riktig forberedt, antibiotika er aktivt, og stammene er like følsomme for antibiotika. Her ble den publiserte agarfortynningsmetoden utført for å bestemme MIC til OFX av de forskjellige stammene som ble brukt24. MIC av et gitt antibiotikum til en gitt bakteriestamme kan også bestemmes via buljongfortynningsmetoden24. Klargjøring av platene for MIC-bestemmelseForbered en master-stamløsning for antibiotika som brukes i forsøkene ved å oppløse 5 mg OFX i 1 ml ultrarent vann. Tilsett 20 μL 37% HCl for å øke løseligheten av OFX. Smelt 100 ml steril LB-agar, og hold den ved 55 °C for å unngå størkning. Klargjør seks små glassflasker (25 ml) og pipett 5 ml flytende LB-agarmedium inn i hver kolbe ved hjelp av en steril pipette. Fortynn 10 mikrol av 5 mg·ml-1 OFX hovedstamoppløsningen i 90 mikroliter ultrarent vann (1:10 fortynning av hovedstamfisken). Tilsett 0 μL, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL eller 10 μL av 500 μg·mL-1 OFX-oppløsningen til hver av de seks glassflaskene inneholdende 5 ml LB-agarmedium for å generere LB-agarmedium med endelige konsentrasjoner på 0 μg·mL−1, 0,02 μg·ml−1, 0,04 μg·ml−1, 0,06 μg·mL−1, 0,08 μg·ml−1 og 0,1 μg·mL-1 OFX, henholdsvis. Bland løsningen ved å rotere kolbene flere ganger.MERK: Hvis MIC av antibiotikumet av interesse er kjent, bør konsentrasjonsområdet nå nedenfra til over den faktiske MIC. Hvis MIC er ukjent, anbefales et stort konsentrasjonsområde med en log2 fortynningsserie. Forsikre deg om at LB-agarmediet er avkjølt før du tilsetter antibiotika, da høye temperaturer kan inaktivere det. Likevel er det viktig å ikke la LB-agarmediet størkne før tilsetning av antibiotika, da dette kan føre til ikke-homogen fordeling av antibiotika i LB-agarmediet. Hell 5 ml av hvert av de seks LB-agarmediene tilberedt i trinn 2.1.3 på en doseøkende måte i en 6-brønns kulturplate ved hjelp av en steril pipette. La agaren avkjøles til den stivner, og tørk platen før bruk.MERK: Forbered antibiotikaoppløsningen og kulturplaten dagen analysen utføres. MIC-bestemmelsesanalyseInokuler 5 ml LB-medium med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og plasser glassrøret i en ristende inkubator satt til 37 ° C og 180 o / min over natten (mellom 15 timer og 19 timer). Neste morgen måles OD600 nm, og fortynner kulturen i et reagensrør til en endelig celletetthet på 1 x 107 CFU · ml-1 i PBS. For stammene som er testet her, tilsvarer 1 x 107 CFU·mL−1 en OD600 nm på 0,0125.MERK: Hvis korrelasjonen mellom CFU·mL-1 og OD 600 nm ikke er kjent, bør vekstkurven bestemt av CFU- og OD 600 nm-målinger etableres for å beregne korrelasjonsfaktoren mellom CFU·mL-1 og OD600 nm. Spot 2 μL av den tidligere fortynnede kulturen på hver brønn i den tørkede 6-brønnsplaten. La flekkene tørke før du legger platen i en inkubator ved 37 °C over natten (mellom 15 timer og 19 timer). Neste dag, telle koloniene dannet i hver brønn. MIC tilsvarer brønnen med minimumskonsentrasjonen av antibiotika der det ikke oppdages bakterievekst. 3. Spot analyse MERK: Spotanalysemetoden er en kvalitativ tilnærming som gjør det mulig å estimere antall levedyktige celler (celler som kan generere kolonier etter antibiotikastress). Spotanalysen utføres før time-kill-analysen for å gi innsikt i levedyktigheten til stammen som brukes under de testede forholdene og for å informere om fortynningene som trengs under time-kill-analysen (se avsnitt 4). For å forberede LB-agarplatene for spotanalyser, hell 50 ml LB-agar i en firkantet petriskål (144 cm2). Forbered en firkantet petriskål per tidspunkt. La LB-agaren stivne, og tørk platene før bruk. Inokuler 5 ml medium (MOPS glukose 0,4%) med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og plasser røret i en ristende inkubator satt til 37 ° C og 180 rpm over natten (mellom 15 t og 19 timer). Neste dag måles OD 600 nm, og fortynn kulturen til friskt temperaturjustert medium (37 ° C, MOPS glyserol 0,4%) i et glassrør (≥25 ml) til en endelig OD600 nm på ~ 0,001. La kulturen vokse over natten i en inkubator ved 37 °C ved 180 o/min (mellom 15 timer og 19 timer). Dagen etter måler du OD 600 nm, og ruger kulturen til en endelig OD600 nm på 0,3. Mens du inkuberer, klargjør 96-brønnplater ved å plassere 90 μL 0,01 M MgSO4-løsning i hver brønn unntatt brønnene i første rad (rad A). Platene med 96 brønner vil bli brukt til 10 ganger seriefortynning i trinn 3.7.MERK: I dette eksperimentet ble to stammer (wt og hupA-mCherry-stamme ) testet i triplikat på syv forskjellige tidspunkter. Siden en plate består av 12 søyler, kan en plate brukes til to tidspunkter, og dermed ble totalt fire plater preparert. Ved en OD600 nm på 0,3, trekk ut 200 μL av hver bakteriekultur. Disse prøvene tilsvarer t0 (ubehandlet) tidspunkt før antibiotikabehandlingen og tillater bestemmelse av CFU·mL-1 før antibiotikabehandlingen. Sentrifuger prøvene ved 2 300 x g i 3 minutter. I løpet av sentrifugeringstiden, tilsett ønsket konsentrasjon av OFX til væskekulturen, og fortsett å inkubere ved 37 °C mens du rister.MERK: Her ble OFX brukt i en konsentrasjon på 5 μg·mL-1 (tilsvarende MIC multiplisert 83 ganger). I en tidligere studie ble denne konsentrasjonen brukt til å karakterisere persistensfenomenet under OFX-eksponering25. Antibiotikakonsentrasjonen som brukes til tid / kill-analysene kan variere avhengig av antibiotika, kulturmediet og tilstanden til bakterievekst. Etter sentrifugering resuspenderes cellepelleten i 200 μL 0,01 MMgSO4-løsning . Plasser 100 μL i den tomme brønnen på 96-brønnplaten som ble klargjort i trinn 3.5. Utfør en fortynning ved å overføre 10 μL av brønnen i rad A til brønnen i rad B inneholdende 90 μL på 0,01 M MgSO4. Fortsett seriefortynningene ved å overføre 10 μL av brønnen i rad B til brønnen i rad C. Gjenta til du når en fortynning på 10-7 (hver overføring er en 10 ganger fortynning).MERK: I dette eksperimentet ble seks kulturer (tre for wt-stammen og tre for hupA-mCherry-stammen ) testet for hvert tidspunkt. I henhold til protokollen brukes en muti-kanal pipette til å utføre serielle fortynninger for de seks stammene samtidig. For å minimere den tekniske feilen endres pipettespissene mellom hver overføring. Spot 10 μL av hver fortynning på LB-agarplatene tilberedt i trinn 3.1.MERK: En flerkanals pipette brukes til samtidig å oppdage den samme fortynningen (f.eks. en 10-4 fortynning) for de seks kulturene. Under spottingen bør det første stoppet på flerkanalspipetten brukes uten å skyve det andre stoppet, da dette kan føre til at mikrodråper blir dispensert på platen. Ved relevante tidspunkter etter antibiotikatilsetningen trekkes 200 μL av dyrkningen ut og seriefortynninger som beskrevet i trinn 3.8. Spot 10 mikrol av hver fortynning som beskrevet i trinn 3.9.MERK: For eksperimentet beskrevet her ble syv tidspunkter samlet inn (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). For stammer som viser økt antibiotikafølsomhet sammenlignet med vekten, kan flere vasker i MgSO4 0,01 M utføres for å fjerne gjenværende antibiotika. Inkuber platene ved 37 °C over natten (mellom 15 timer og 19 timer). Neste dag teller du antall kolonier ved de to høyeste fortynningene som kolonier kan oppdages for. Ideelt sett inneholder flekkene på agarplatene for disse fortynningene mellom 3 og 30 kolonier som muliggjør nøyaktig bestemmelse av CFU·mL-1 for hver prøve. Beregn overlevelsesforholdet ved å dele den beregnede CFU·mL-1 for hvert tidspunkt med CFU·mL-1 i den opprinnelige populasjonen på t0. 4. Time-kill analyser MERK: Mens spotanalyser er en brukervennlig metode for å estimere overlevelsesraten for en gitt stamme for et gitt antibiotika, gir tidsdrepende analyser en overlevelsesrate med høyere oppløsning og utføres for å kvantifisere bakteriell levedyktighet nøyaktig. Profilen til drapskurven kan brukes til å avgjøre om en gitt bakteriestamme er følsom, tolerant eller resistent mot antibiotika i en gitt tilstand. Videre tillater tidsdrepende analyser bestemmelse av tidspunktet for antibiotikaeksponering som er nødvendig for å oppdage persistensfenomenet (begynnelsen av den andre skråningen av den bifasiske drapskurven) samt persistensfrekvensen. Forbered LB-agarplater for tidsdrepende platinganalysen. Hell 25 ml LB-agar i en petriskål (±57 cm2). Forbered minst to petriskåler per tidspunkt (to fortynninger per tidspunkt per stamme er belagt). La LB-agaren stivne, og tørk platene før du tilsetter fem til åtte sterile glassperler på hver plate. Inverter og merk platene i henhold til belastningen/tilstanden/tidspunktet.MERK: Glassperler tillater spredning av bakterier på agarplatene i trinn 4.7 og trinn 4.9. Alternativt kan cellene dispergeres på agarplaten ved hjelp av en spreder. For hver prøve, lag 10 ganger serielle fortynningsglassrør inneholdende 900 μL 0,01 MMgSO4-løsning . Antall fortynnede glassrør per prøve som må fremstilles, tilsvarer fortynningene som trengs for å oppdage kolonier i punktanalysen. Inokuler 5 ml medium (MOPS glukose 0,4%) med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og plasser røret i en ristende inkubator satt til 37 ° C og 180 rpm over natten (mellom 15 t og 19 timer). Etter 16 timers vekst måles OD 600 nm, og fortynn kulturen til friskt temperaturjustert medium (37 ° C, MOPS glyserol 0,4%) i et glassrør til en endelig OD600 nm på ~ 0,001. La kulturen vokse over natten i en inkubator ved 37 °C ved 180 o/min (mellom 15 timer og 19 timer). Dagen etter måler du OD 600 nm, og ruger kulturen til en endelig OD600 nm på 0,3. Ved en OD 600 nm på 0,3, trekk ut 100 μL av kulturen, fortynn i henhold til dataene oppnådd i spotanalysen (ved en OD600 nm på 0,3 og uten antibiotika gir en 10-5 fortynning vanligvis 200-300 kolonier), og plate100 μL på LB-agarplatene fremstilt i trinn 4.1-4.2. Rist platene forsiktig for å unngå at perlene kommer i kontakt med parabolkantene, da dette kan føre til en ikke-homogen spredning av bakteriecellene på LB-agarmediet. Denne første prøven før antibiotikabehandlingen tilsvarer t0-tidspunktet (CFU·mL-1 før antibiotikabehandling). Tilsett ønsket konsentrasjon av OFX, og fortsett å inkubere ved 37 °C mens du rister.MERK: Her ble OFX brukt i en konsentrasjon på 5 μg·mL-1 (tilsvarende MIC multiplisert 83 ganger). På relevante tidspunkter etter antibiotikatilsetningen, trekk ut 100 μL av kulturen, fortynn i henhold til dataene oppnådd i spotanalysen og plate 100 μL på LB-agarplatene fremstilt i trinn 4.1-4.2. Plat cellene som beskrevet i trinn 4.7.MERK: For eksperimentet beskrevet her ble syv tidspunkter samlet inn (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). For stammer som viser økt antibiotikafølsomhet sammenlignet med vekt, kan flere vasker i MgSO4 0,01 M utføres for å fjerne gjenværende antibiotika. Inkuber platene ved 37 °C over natten (mellom 15 timer og 19 timer). Neste dag teller du antall kolonier ved de to høyeste fortynningene som kolonier kan oppdages for. Ideelt sett bør platene inneholde 30-300 kolonier for å muliggjøre en nøyaktig bestemmelse av CFU·mL-1 i hver prøve. Beregn overlevelsesforholdet ved å normalisere CFU·mL-1 ved hvert tidspunkt av CFU·mL-1 ved t0. Plott loggen10 normalisert CFU·mL-1 som en funksjon av tid. 5. Mikrofluidisk time-lapse-mikroskopiavbildning MERK: Følgende avsnitt beskriver klargjøringen av den mikrofluidiske platen samt prosedyren for time-lapse-bildeopptak og bildeanalyse. Målet med dette eksperimentet er å observere og analysere persistensfenotypen ved antibiotikabehandling på encellenivå. Dataene som samles inn under dette eksperimentet, kan brukes til å generere et bredt spekter av resultater, avhengig av spørsmålet som er adressert og / eller fluorescerende reportere som ble brukt under forsøket. I forsøket beskrevet her ble det utført kvantitativ analyse av cellelengden og HU-mCherry-fluorescens22, som reflekterer nukleoidorganisasjonen i persister- og ikke-persisterceller. Bakteriell cellekultur for mikrofluidisk timelapsemikroskopiInokuler 5 ml medium (MOPS glyserol 0,4%, supplert med et selektivt antibiotika om nødvendig) med en isolert koloni i et glassrør (≥25 ml), og legg røret i en ristende inkubator satt til 37 ° C og 180 rpm over natten (mellom 15 t og 19 timer). Neste dag måles OD 600 nm, og fortynn kulturen i friskt temperaturjustert medium (37 ° C, MOPS glyserol 0,4%) i et glassrør til en endelig OD600 nm på ~ 0,001. La kulturen vokse over natten (mellom 15 timer og 19 timer) i en ristende inkubator ved 37 ° C og 180 o / min for å oppnå en tidlig eksponentiell fasekultur neste dag. Fremstilling av mikrofluidplaten og time-lapse-mikroskopiavbildningMERK: Mikrofluidiske eksperimenter kan utføres i kommersielt tilgjengelige mikrofluidiske enheter (som beskrevet her) eller i egenproduserte mikrofluidiske systemer.Fjern konserveringsløsningen (hvis den finnes) fra hver brønn i den mikrofluidiske platen, og erstatt den med et friskt kulturmedium.MERK: Hvis mikrofluidplaten inneholder en avløpsbrønn, bør konserveringsløsningen i utløpsbrønnen fjernes, men ikke erstattes av mediet. Forsegl den mikrofluidiske platen med manifoldsystemet ved å klikke på Seal-knappen eller gjennom den mikrofluidiske programvaren (velg først Verktøy, etterfulgt av Seal Plate). MERK: For å forsegle platen, bør et jevnt trykk påføres platen og manifolden ved å klemme platen manuelt mot manifolden. Hvis det utføres riktig, skal notatet “forseglet” vises på ONIX2-grensesnittet. Det er viktig å ikke legge noe trykk på glassglasset for å unngå potensiell risiko for å bryte manifolden. Når den er forseglet, utfør en første grunningssekvens (klikk på Kjør flytende primingssekvens på det mikrofluidiske programvaregrensesnittet).MERK: Run Liquid Priming Sequence tilsvarer 5 min perfusjon ved 6,9 kPa for brønn 1-5, etterfulgt av 5 min perfusjon ved 6,9 kPa for brønn 8, og en siste perfusjonsrunde for brønn 6 i 5 min ved 6,9 kPa. Run Liquid Priming Sequence gjør det mulig å fjerne konserveringsløsningen som fortsatt kan være tilstede i kanalene som forbinder de forskjellige brønnene. Inkuber platen i et termostatstyrt kabinett i mikroskopet ved ønsket temperatur (her 37 °C) i minimum 2 timer før mikroskopiavbildningen starter. Start en ny Run Liquid Priming Sequence før du begynner eksperimentet. Forsegle den mikrofluidiske platen ved å klikke på Seal off på det mikrofluidiske programvaregrensesnittet. Erstatt mediet i brønn 1 og brønn 2 med 200 μL ferskt medium, i brønn 3 med 200 μL ferskt medium som inneholder antibiotikumet (her OFX ved 5 μg·ml−1), i brønn 4 og brønn 5 med 200 μL ferskt medium, i brønn 6 med 200 μL ferskt medium, og i brønn 8 med 200 μL av dyrkningsprøven (fra trinn 5.1.2) fortynnet til en OD600 nm på 0,01 i friskt medium. Forsegl den mikrofluidiske platen som beskrevet i trinn 5.2.2, og plasser platen på mikroskopmålet inne i mikroskopskapet.MERK: Sørg for å plassere en dråpe nedsenkningsolje på mikroskopmålet før du plasserer mikrofluidplaten. I den mikrofluidiske programvaren klikker du på Cell Loading for å la cellen lastes inn i den mikrofluidiske platen.MERK: Cell Loading-trinnet består av 15 s perfusjon ved 13,8 kPa for brønn 8, etterfulgt av 15 s perfusjon ved 27,6 kPa for brønn 6 og brønn 8, og en siste perfusjonsrunde for brønn 6 for 30 s ved 6,9 kPa. Tettheten av cellene i den mikrofluidiske platen er kritisk for forsøket. Den første delen av denne mikrofluidiske protokollen består av voksende bakterier i 6 timer i et friskt medium før antibiotikabehandlingen. Etter 6 timers vekst må celletettheten være tilstrekkelig til å oppdage de sjeldne persistercellene (under forholdene som brukes i denne studien, genererer persistercellene med en frekvens på 10-4). Hvis celletettheten er for høy, er det vanskelig å skille de enkelte cellene, noe som forhindrer presis enkeltcelleanalyse. Siden veksthastigheten er direkte avhengig av mediet, bør tettheten av celler i mikroskopifeltene vurderes før forsøket starter. Angi et optimalt fokus ved hjelp av overført lysmodus, og velg flere interesseområder (ROI) der et passende cellenummer observeres (opptil 300 celler per felt).MERK: Velg minst 40 avkastning for å sikre at de sjeldne persistercellene er avbildet. På mikrofluidisk programvare klikker du på Opprett en protokoll. Programmer injeksjon av ferskt medium ved 6,9 kPa i 6 timer (brønn 1-2), etterfulgt av injeksjon av mediet som inneholder antibiotika ved 6,9 kPa i 6 timer (brønn 3), og til slutt injeksjon av ferskt medium ved 6,9 kPa i 20 timer (brønn 4-5).MERK: En bakteriekultur fortynnet til en OD600 nm på 0,01 tillater bakterier å vokse i mikrofluidisk kammer i 6 timer, slik at cellene er i eksponentiell vekstfase. Avhengig av antall celler som føres inn i den mikrofluidiske enheten under lastetrinnet (se trinn 5.2.8), kan varigheten av vekstfasen tilpasses for å oppnå opptil 300 celler per avkastning. Siden utholdenhet er et sjeldent fenomen, øker antall celler per avkastning muligheten for å observere persisterceller. Celletallet bør imidlertid ikke overstige 300 celler per avkastning, da dette gjør enkeltcelleanalyse kjedelig. Utfør mikroskopiavbildning i time-lapse-modus med en ramme hvert 15. minutt ved hjelp av overført lys og eksitasjonslyskilden for den fluorescerende reporteren. Her ble det brukt en 560 nm eksitasjonslyskilde for mCherry-signalet (580 nm LED ved 10% effekt med filter 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] og 100 ms eksponering for mCherry). Den Zeiss-kompatible Zen3.2-programvaren ble brukt til celleavbildning. BildeanalyseMERK: Åpning og visualisering av mikroskopibildene utføres med åpen kildekode-programvaren ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)26. Den kvantitative bildeanalysen utføres ved hjelp av åpen kildekode ImageJ / Fiji-programvaren og den gratis MicrobeJ-plugin (https://microbej.com) 27. I denne protokollen ble MicrobeJ 5.13I(14)-versjonen brukt.Åpne ImageJ/Fiji-programvaren på datamaskinen, og dra tidsforkortelsesmikroskopibildene med hyperstack til Fiji-lastestangen. Bruk Bilde > farge > Lag kompositt for å smelte sammen de forskjellige kanalene i hyperstakken. Hvis kanalene i intervalleksperimentet ikke samsvarer med ønsket farge (f.eks. hvis fasekontrasten vises i rødt i stedet for grått), bruker du Bilde > farge > Ordne kanaler for å bruke riktig farge på kanalene. Åpne MicrobeJ-pluginet, og oppdag bakteriecellene ved hjelp av det manuelle redigeringsgrensesnittet. Slett de automatisk oppdagede cellene, og skisser manuelt de vedvarende cellene av interesse ramme for ramme.MERK: Ulike innstillinger kan brukes til å oppdage individuelle celler automatisk. Manuell deteksjon ble brukt her da de analyserte persistercellene danner lange filamenter, som sjelden oppdages riktig ved hjelp av automatisk deteksjon. Etter gjenkjenning bruker du resultatikonet i det manuelle redigeringsgrensesnittet for MicrobeJ til å generere en ResultJ-tabell. Lagre ResultJ-filen, og bruk ResultJ-tabellen til å få innsikt i ulike parametere av interesse for enkeltcelleanalysen. I tilfelle av denne protokollen ble den gjennomsnittlige fluorescensen av HU-mCherry-intensiteten, cellelengden og celleområdet til individuelle celler eksportert.