Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris

Résumé

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris.

Résumé

Les macrophages ont d’importantes fonctions effectrices dans l’homéostasie et l’inflammation. Ces cellules sont présentes dans tous les tissus du corps et ont l’importante capacité de modifier leur profil en fonction des stimuli présents dans le microenvironnement. Les cytokines peuvent profondément affecter la physiologie des macrophages, en particulier l’IFN-γ et l’interleukine 4, générant respectivement les types M1 et M2. En raison de la polyvalence de ces cellules, la production d’une population de macrophages dérivés de la moelle osseuse peut être une étape fondamentale dans de nombreux modèles expérimentaux de biologie cellulaire. L’objectif de ce protocole est d’aider les chercheurs à isoler et à cultiver des macrophages dérivés de progéniteurs de la moelle osseuse. Les progéniteurs de la moelle osseuse de souris C57BL/6 exemptes d’agents pathogènes sont transformés en macrophages lors de l’exposition au facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) qui, dans ce protocole, est obtenu à partir du surnageant de la lignée de fibroblastes murins L-929. Après l’incubation, les macrophages matures sont disponibles pour une utilisation du 7^au 10^e jour. Un seul animal peut être la source d’environ 2 x 10⁷ macrophages. Par conséquent, il s’agit d’un protocole idéal pour obtenir de grandes quantités de macrophages primaires en utilisant des méthodes de base de culture cellulaire.

Introduction

Les monocytes et les macrophages sont des phagocytes mononucléaires qui peuvent être dérivés de progéniteurs dans la moelle osseuse. Des études récentes ont rapporté que les macrophages proviennent également de progéniteurs érythro-myéloïdes dérivés du sac vitellin¹. Quelle que soit leur dérivation, ces leucocytes ont des fonctions effectrices importantes dans l’homéostasie et l’inflammation ^2,3. Les monocytes sont des cellules du sang périphérique qui peuvent se différencier en macrophages dans les tissus ^2,4, tandis que les ma....

Protocole

Ce protocole a été réalisé conformément au Conseil national de contrôle de l’expérimentation animale (Concea) et avec l’approbation de la Commission d’éthique et d’utilisation des animaux (CEUA). Les souris C57BL/6 ont été achetées à Biotério Central de l’Université fédérale de Minas Gerais (UFMG), à Belo Horizonte, au Brésil. L’équipement de protection individuelle (EPI) tel que les blouses de laboratoire, les gants et les lunettes de protection doit être utilisé à toutes les étapes décrites dans le présent protocole.

1. Préparation du surnageant de la lignée des fibroblastes L-929 comme source de M-CSF

1. Décongele....

Résultats

Les macrophages sont de grandes cellules adhérentes avec des caractéristiques physiologiques particulières. Ils présentent une diversité de présentations morphologiques en culture en raison de leur capacité à adhérer au verre et au plastique, et leur morphologie étalée typique est liée à l’émission d’extensions cytoplasmiques (Figure 1). Une fois que les progéniteurs de la moelle osseuse sont exposés au M-CSF à partir du surnageant de cellule L-929 et commencent la transformation en macropha.......

Discussion

La production d’une population de macrophages dérivés de la moelle osseuse est une étape fondamentale dans de nombreux modèles expérimentaux de biologie cellulaire, en particulier lorsqu’il est important d’obtenir une population homogène de cellules primaires. Comme nous l’avons mentionné, les progéniteurs cellulaires ne peuvent se transformer en macrophages qu’en présence de M-CSF. Les surnageants cellulaires L-929 peuvent être utilisés comme source principale de M-CSF. Outre le coût, il n’y a aucun problème à utiliser .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue 20 cc	DESCARPACK	SI100S4G	Seringue stérile
Aiguilles 26-G	BD	497AQDKT7	Aiguilles stériles
Tube à centrifuger conique 50 ml	SARSTEDT	62547254	Tubes coniques en plastique adaptés à la centrifugation
Solution d’éthanol à 70 %	EMFAL	490	Solution d’éthanol pour l’estérilisation
Dissection anatomique pince	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintenir dans un bécher stérile contenant une solution d’éthanol à 70 %
C57Bl/6 souris de type sauvage	Acheté chez Bioté ; rio Central à l’Université fédérale de Minas Gerais	Sans objet Les	souris doivent être exemptes d’agents pathogènes spécifiques, âgées entre 6 et 10 semaines. Les souris doivent être logées au moins une semaine plus tôt pour se remettre du stress du transport
Fiole de culture cellulaire T175	GREINER	C7481-50EA	Fiole T-175, col incliné, surface 75 cm2, avec capuchon filtrant, sans DNase, sans RNase
Fiole de culture cellulaire T75	GREINER	C7231-120EA	Fiole T-75, col incliné, surface 75 cm2, avec capuchon filtrant, sans DNase, Désinfectant sans RNase
ou lingettes pour bébé ?	CLOROX	Sans objet	Il aide à nettoyer l’os
Eau distillée	GIBCO	15230	Eau distillée stérile
DMEM/F12-10	Sans objet	Sans objet Ajouter	10 mL de sérum fœtal de veau (FBS) et 1 mL de pénicilline/streptomycine (P/S) à DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + surnageant de cellules L-929	Sans objet	objet	Ajouter 20 % de surnageant de la culture de cellules L929 sur DMEM/F-12-10
Dulbecco&prime ; s Aigle modifié&prime ; s Medium - F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM : Le F-12 Medium contient 2,5 mM de L-glutamine, 15 mM d’HEPES, 0,5 mM de pyruvate de sodium et 1200 mg/L de bicarbonate de sodium. Remettre la poudre en suspension dans 1 litre d’eau distillée et ajouter 3,7 g de bicarbonate de sodium. Ajuster le pH à 7,2 et filtrer à 0,22 µ ;M. Stockage à 2 - 8 ° ; C congélateur
Sérum fœtal bovin, certifié, inactivé par la chaleur, États-Unis (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichissement pour hémocytomètre DMEM-F12
	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Utilisé pour compter les macrophages à la microscopie
Les cellules L-929	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 est une lignée de cellules de fibroblastes de souris utilisée comme source de facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF)
Éclipse de Nikon TI  ;	NIKON  ;	Non applicable	Nikon TI Eclipse est un microscope à fluorescence et à contraste de phase
Solution de dissociation cellulaire non enzymatique	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	La solution de dissociation cellulaire non enzimatique élimine les macrophages de la plaque sans les endommager Boîtes de
culture rondes non traitées 100 & fois ; 20&ndash ; mm	CORNING	CLS430591	Ne pas utiliser de boîtes de Pétri traitées à la culture tissulaire ou toute plaque traitée à la culture tissulaire
P3199 Pénicilline G Sel de potassium	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotiques
pénicilline et de streptomycine (P/S)			Utiliser 0,26 gramme de pénicilline et 0,40 gramme de streptomycine. Mélanger avec 40 mL de PBS stérile. À l’intérieur d’une armoire à flux laminaire horizontal, utilisez un 0,22 & ; micro ; M filtrer et stocker les aliquotes de 1,0 mL dans des tubes microfuges de 1,5 ml au congélateur (-20° ; C)
Solution saline tamponnée au phosphate, sans calcium ni magnésium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sulfate
streptomycine stérile S7975, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotiques
Pipettes sérologiques de 10 ml ou 25 ml	SARSTEDT	861254001	Pipettes sérologiques utilisées Volumes supérieurs à 1 ml
Bicarbonate de sodium	SIGMA-ALDRICH	144-55-8 Correction du	pH pour le logiciel DMEM-F12
Nis Elements Viewer	NIKON	Sans objet	NIS-Elements Viewer est un programme autonome gratuit permettant de visualiser des fichiers d’images et des ensembles de données
PBS stérile et 2 % de solution P/S	LABORCRIN 590338		Ajouter 1 mL de P/S dans 40 mL de PBS
stérile Ciseaux à iris droits	KATENA	Sans objet	Maintenir dans un bécher stérile contenant une solution d’éthanol à 70 %
Surnageant des cellules L-929	Sans objet Sans objet	Le	L-929 est une lignée de cellules fibroblastiques de souris utilisée comme source de facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Le surnageant L-929 a été obtenu à partir du protocole
Lame de scalpel chirurgical n° 24 Acier inoxydable	SWANN-MORTON	311	Utilisé pour exposer l’épiphyse des os
La solution de bleu de trypan, 0,4 %	GIBCO	15250061	la solution de bleu de trypan, 0,4 %, est couramment utilisée comme colorant cellulaire pour évaluer la viabilité cellulaire à l’aide du test d’exclusion de colorant
Solution de trypsine/EDTA 0,05 %	GIBCO	25300-062	Utilisé pour dissocier les cellules de la bouteille de culture
Eau pour injection (WFI) pour la culture cellulaire	GIBCO	A12873	Eau stérile et sans endotoxines

Sans Solution de de